高脱乙酰度低分子量壳聚糖l-乳酸盐的制备方法

专利名称：：高脱乙酰度低分子量壳聚糖l-乳酸盐的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐的制备方法。(二)
背景技术：
：壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性曱壳素，是由曱壳素经脱乙酰化反应转化变成的分子量为1259万的生物大分子。从Braconot于1811年描述曱壳素迄今，曱壳素和壳聚糖的发展历史已有一百多年。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，降解产物一般对人体无毒副作用，在体内不积蓄，无免疫原性，因而在生物医学领域有着极广阔的前景。已开发和潜在的应用实例包括人工皮肤(创伤敷料)、手术缝合线与骨修复材料、抗凝血剂和人工透析膜、药物制剂和药物释放剂等。除此之外，壳聚糖曾在1991年被欧美学术界誉为继蛋白质、脂肪、糖类、维生素和无机盐之后的第六生命要素。据文献报道，壳聚糖对疾病的预防和保健作用有强化免疫功能；降低胆固醇；降血压，降血糖，强化肝脏机能；使血管扩张，从而改善腰酸背痛症状；治疗烧伤，烫伤，加速外伤愈合；防止胃溃疡，吸附体内有害物质并排出体外等。此外，壳聚糖还能够用作凝胶化试剂，生物传感器，合成人工器官(人工皮肤、粘膜、腱、牙、骨)及骨固定棒材，还可作减肥药使用。壳聚糖的应用涉及许多领域，其中化妆品、保健品、食品工业等行业对壳聚糖的需求增长最快；在医药、化工、造纸、农业、环保、轻纺等领域正在得到广泛的应用。壳聚糖以其资源丰富、价格便宜、安全无毒等众多优点，使得各国对壳聚糖的应用研究不断深化，预计未来若干年，国内外在对壳聚糖的开发和利用上会取得更多成果。壳聚糖是曱壳质经脱乙酰反应后的产品，脱乙酰基程度(D.D)决定了大分子链上胺基(NH2)含量的多少，而且D.D增加，由于胺基质子化而使壳聚糖在稀酸溶液中带电基团增多，聚电解质电荷密度增力口，其结果必将导致其结构，性质和性能上的变化，直接影响着壳聚糖的物化性质及其应用。乙酰度的高低，直接关系到其在稀酸中的溶解能力、粘度、离子交换能力、絮凝性能和与氨基有关的化学反应能力，以及许多方面的应用。本项目研发产品作为天然抗菌药物，对产品的粘度和溶解能力都有严格的要求，此外脱乙酰度的提高能有效增加溶液中自由氨基的浓度，提高产品的抑菌能力。目前市售的壳聚糖其脱乙酰度都不够高(70%~90%)，往往需要进一步水解才能得到90%~100%脱乙酰度的产品。目前有关于壳聚糖的降解和脱乙酰的研究已广泛开展，但工艺技术研究还存在一些问题，特别是有关于水不溶性低分子量壳聚糖的制备还是基本是空白。
发明内容本发明目的是提供一种可定向制备所要求分子量的高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐的方法。本发明采用的技术方案是一种高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐的制备方法，所述方法包括(1)高脱乙酰化反应壳聚糖在相转移催化剂存在下，于质量浓度3540%的氢氧化钠溶液中于100130。C下反应36小时，得到高脱乙酰化的壳聚糖，所述相转移催化剂为十六烷基三甲基溴化铵，所述相转移催化剂质量用量为壳聚糖质量的2%~4%,所述氢氧化钠溶液用量为520mL/g壳聚糖；(2)氧化降解取高脱乙酰化的壳聚糖，溶解于去离子水中，加入双氧水进行反应，双氧水与壳聚糖单元物质的量之比为13:1,根据产物分子量^x与反应时间t之间的关系式确定氧化降解时间，于3050°C下进行氧化降解反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式中^!为降解产物重均分子量，单位Dalton;八=丄，Xo为壳聚糖原料初始重均分子量，单位Dalton;Z。A=，Ea为反应活化能，单位KJ/mol;T为反应温度，单位K;R为摩尔气体常数，单位J/(mol.K);a=6.3218;Ea=60.69;R=8.3145;t为氧化降解反应时间，单位min;降解反应结束后，反应液分离纯化得到壳聚糖降解物；(3)L-乳酸盐制备将壳聚糖降解物溶胀后，与L-乳酸反应，制得所述高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐。本发明采用双氧水在中性条件下氧化降解制备水不溶性低分子量壳聚糖的工艺路线和关键控制因素，在此基础上建立合适的数学模型，通过模型计算能实现壳聚糖的定向降解。主要内容如下1)建立利用相转移催化技术制备高脱乙酰度壳聚糖的工艺路线，并对工艺的关键影响因素进行优化；2)研究釆用双氧水在中性条件下氧化降解制备水不溶性低分子量壳聚糖的工艺路线和关键控制因素，在此基础上建立合适的数学模型，实现壳聚糖的定向降解。本发明工艺路线为壳聚糖—高脱乙酰化—定向氧化—乳酸化—冻干—产品优选的，所述步骤(l)为壳聚糖在相转移催化剂十六烷基三曱基溴化铵存在下，于质量浓度40%的氢氧化钠溶液中于121°C下反应3小时，得到高脱乙酰化的壳聚糖；所述相转移催化剂质量用量为壳聚糖质量的3%，所述氢氧化钠溶液用量为10mL/g壳聚糖。优选的，所述步骤(3)为按照壳聚糖降解物去离子水4g:50mL的比例，将壳聚糖降解物置于去离子水中，溶胀30分钟后，按照壳聚糖降解物L-乳酸-lg:9mL的添加量加入L-乳酸，60。C恒温反应45分钟，反应液用去离子水稀释至壳聚糖降解物去离子水4g:400mL，微滤后，用5KD聚砜膜超滤，滤液浓缩，-63°。冻干，得到所述高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐。当所用原料壳聚糖重均分子量为120kD时，步骤(2)中按照log(Mw)=-0.6321*t+9.0856确定氧化降解反应时间，Mw为降解产物重均分子量，单位Dalton;t为氧化降解反应时间，单位min。具体的，原料壳聚糖重均分子量为120kD,目标产物高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐重均分子量为50士5KD，步骤(2)中氧化降解温度为40。C，氧化降解反应时间为1.47小时，双氧水与壳聚糖单元物质的量之比为2:1。原料壳聚糖重均分子量为120kD,目标产物高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐重均分子量为30士3KD，步骤(2)中氧化降解温度为50°C,氧化降解反应时间为1.62小时，双氧水与壳聚糖单元物质的量之比为2:1。原料壳聚糖重均分子量为120kD,目标产物高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐重均分子量为IO士IKD，步骤(2)中氧化降解温度为50°C,氧化降解反应时间为5.92小时，双氧水与壳聚糖单元物质的量之比为2:1。本发明的有益效果主要体现在壳聚糖脱乙酰度高、产品无毒、无副反应；通过模型计算，能得出不同分子量壳聚糖L-乳酸盐的制备条件，实现定向的制备，工艺的重复性和稳定性也易于控制。图1为脱乙酰度随反应时间变化的曲线；图2为脱乙酰度随温度变化曲线；图3为脱乙酰度随氬氧化钠溶液浓度变化曲线；图4为&02加入量对壳聚糖降解的影响；图5为不同温度下壳聚糖氧化降解的时间曲线；图6为不同温度和反应时间下壳聚糖H202降解物的色泽；图7为不同温度下壳聚糖氧化降解的时间曲线；图8为ln(k)和反应温度关系图；(，实验值；一，模型值)；图9为壳聚糖40°C、1.47hr定向降解产物的GPC图谱；图10为壳聚糖50。C、1.62hr定向降解产物的GPC图谱；图11为壳聚糖50。C、5.92hr定向降解产物的GPC图谱；具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:高脱乙酰度壳聚糖的制备1实^r方法1.1各种因素对高脱乙酰度壳聚糖制备将壳聚糖加入三角烧瓶中，用一定浓度的氢氧化钠在一定温度和时间下进行脱乙酰基反应。反应终结后，经过滤、洗净、烘干，即可得高脱乙酰壳聚糖。1)反应时间对脱乙酰度的影响将一定量壳聚糖加入40%浓度的氢氧化钠溶液中(每克壳聚糖溶于10mL溶液，以下同)，在120。C下反应lh、2h、3h、5h、7h。检测脱乙酰度。2)反应温度对脱乙酰度的影响将一定量的壳聚糖溶解加入40%浓度的氢氧化钠溶液中，在90、100、120°C下反应2h。检测脱乙酰度。3)氢氧化钠溶液浓度对脱乙酰度的影响将一定量的壳聚糖加入30、35、40%氢氧化钠溶液中，120。C下反应3小时。检测脱乙酰度。4)催化剂对脱乙酰度的影响。将一定量的壳聚糖加入35%氢氧化钠溶液中，同时分别加入O、1%、2%、3%、4%的相转移催化剂，在IO(TC下反应3小时。检测脱乙酰度。5)间歇i威加入方法对脱乙酰度的影响将壳聚糖加入40%氢氧化钠溶液中，120°C下用间歇法进行脱乙酰反应。先反应20min,然后取出样品冷却，过滤样品并洗涤至中性待用，切换入新的40。/。NaOH继续反应(样品取出至再加入总共滞留时间为20min),再加入反应20min后停止反应过滤样品并洗涤至中性，干燥，测定产品的脱乙酰度。整个过程持续1小时，其中样品反应时间40min.中间样品间歇20min。1.2壳聚糖脱乙酰度的测定方法本处采用酸;威滴定法测定。准确称量0.3g壳聚糖样品，置于250mL锥形瓶中，加入标准0.1mol/L盐酸溶液30ml，在(20±5)。C恒温条件下搅拌溶解完全，加入3滴曱基橙-苯胺蓝指示剂，用标准0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定过量的盐酸，试液从紫红色变成淡绿色为滴定终点。计算公式理论氨基含量=!x100%=9.94%氨基含量o/。JC^C^xO扁x簡。/。G(100-吗式中d——盐酸标准溶液的浓度，mol/LC2——氬氧化钠标准溶液的浓度Vi-加如盐酸标准溶液的体积，mlV2-^。入氬氧化钠标准溶液的体积，mlG——#品质量，gW-样品的水分，％0.016——与lmllmol/L盐酸溶液相当的氨基量，G脱乙酰度(D.D.)/%=M^xl00o/o9.94%2、试-睑结果与讨"i仑2.1改进酸石成滴定法测定壳聚糖脱乙酰度酸碱滴定法虽然常用，但误差一般较大。本文对常用的曱基橙指示剂进行改进，采用改进的苯胺蓝…曱基橙作为指示剂进行酸碱滴定检测，每个样品测定三个平行样，结果见表2。计算过程如下以才羊品1为例脱乙酰度(D.D.)/%=^i^xi009.94%理论氨基含量-!x100%=9.94%161氨基含量Q^(C&C")xO馬xK)(^G(100-『)D.D.%=(0.1070*30-0.1051*13.61)*0馬/(0.319*0.0994)=89.80%表2:酸》威滴定法测定数据<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从实验分析，采用改进的苯胺蓝---曱基橙指示剂后，测定的灵敏度明显增加，而且测定的结果重复性较好，偏差较小。而且所得结果与原料的脱乙酰度(DD)90%(企业出厂参数)非常接近，因此采用改进的苯胺蓝—曱基橙作为指示剂可以有效地提高酸碱滴定法灵每t度和准确性2.2壳聚糖脱乙酰度工艺的优化2.2.1反应时间对脱乙酰度的影响。反应时间对反应脱乙酰度的影响见图1。由图可见，随着.反应时间的增长，产物脱乙酰度也增加，但是当反应时间到3hr后，脱乙酰度(DD)值已增加緩慢。这可能是由于脱乙酰反应是亲核取代反应，主要涉及C-N键断裂，反应需要一定时间；但随着酰胺基浓度的降低,DD值变化不大。根据实验结果确定反应时间3hr。而且随着反应时间延长，壳聚糖分子量会不断减小,产品色泽不断加深。2.2.2反应温度对脱乙酰度的影响由图2可知，产品的D.D.值随着温度的增加而增加，这是因为亲核取代反应涉及C-N键的断裂，需一定的反应活化能，所以升高温度有利于该反应的进行。由于实验条件限制，本论文采用的高压反应斧为常用灭菌锅，最大可控压力为lkg/cm2,对应温度为121°C。据此，本实验选定脱乙酰反应温度为121°C。2.2.3碱浓度对脱乙酰度的影响脱乙酰反应中NaOH浓度对产品的脱乙酰度有较大影响。由图3可见碱浓度低时，DD低。这是由于NaOH为亲核试剂，当其浓度低时亲核攻击效果较差，DD值不高。当碱浓度增加后，DD增加。从图上可见，当碱浓度达到40%后，DD增长趋于緩和，因为此时碱浓度接近饱和，再要提高碱浓度比较困难，溶解也较緩慢。并且，碱浓度越高对设备的腐蚀越强，对设备要求越高。考虑到这些因素选定40。/。NaOH为反应浓度。2.2.4相转移催化剂对脱乙酰度的影响表3:相转移催化剂对脱乙酰度影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>相转移催化剂能加速或者能使分别处于互不相溶的两种溶剂(液-液两相体系或固-液两相体系)中的物质发生反应。在壳聚糖脱乙酰反应中，相转移催化剂可以活化OH-从液相转移到固相，增加它与壳聚糖的接触机会，因而能加速壳聚糖的脱乙酰基反应。用相转移催化剂能在较短的时间内制得高脱乙酰度的壳聚糖，要制备脱乙酰度大于99%及完全脱乙酰壳聚糖，就可以考虑使用相转移催化剂提高脱乙酰效果。由表3可知，当相转移催化剂超过3%(催化剂质量占壳聚糖质量的3%)时，再加入相转移催化剂DD值无明显变化，所以确定相转移催化剂加入量为3%。2.2.5间歇碱加入法对脱乙酰度的影响表4:间歇法对脱乙酰度影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表4可知间歇碱加入法能一定程度上提高产物脱乙酰度，原因可能是间歇式法处理时，能把壳聚糖脱乙酰反应产生的乙酰基及时去除，避免碱液中乙酰基浓度过大，造成产物的抑制作用，从而进一步提高壳聚糖的脱乙酰度。而且对产品外观进行观察，发现其对产品色泽影响较小。2.2.6产品的红外光i普分析将壳聚糖原料(DD为89.89%)和按照以上得到的优化条件获得的高脱乙酰度壳聚糖(DD为99.9%)进行了红外光谱图分析(采用KBr压片法)。乙酰基C=0的红外吸收峰在1468.8nm附近，在语图上可以清楚地看到乙酰基吸收峰，而在高脱乙酰度产品％的红外光谱图中可以发现1468.8nm处的吸收峰已经消失，由此可以认为产品中乙酰基已基本脱除。3、结论对相转移催化法制备高脱乙酰度壳聚糖的条件进行了优化，得到以下结果完全乙酰度壳聚糖(DD^99.9。/c))的制备条件为121。C下，加入3%的相转移催化剂，用40%的氢氧化钠溶液反应3hr。实施例2:壳聚糖的定向氧化降解壳聚糖的降解方法很多，包括酸法、酶法、氧化法及射线降解等方法。H202氧化降解壳聚糖是目前研究和生产应用最多的一种方法。其优点是成本低，易处理，且对反应产物的后续处理影响小，无残毒，易于实现工业化生产。目前研究水溶性壳聚糖的工作已广泛开展，并已取得很多成果。而有关于非水溶性低分子量壳聚糖的制备，目前还较少见文献报道。本项目研究目标是定向截取Mw=30~50K范围的水不溶性低分子量壳聚糖作为壳聚糖人工泪液的原料之一，因而采用11202氧化法具有很多不可比拟的优点，如易于获得水不溶性低分子量壳聚糖，而且，中性条件下异相氧化降解壳聚糖仅是壳聚糖主链P-1,4糖苷键的断裂，对壳聚糖的结构没有影；产品无毒、无副反应。只要掌握好降解条件，工艺的重复性和稳定性也易于控制'。壳聚糖的降解如下图所示，是一个无规则的线性降解过程。在降解过程中，双氧水分解后所形成的活性自由基可能夺取壳聚糖的(3-l,4-糖苷键的1位或4位上的H^、子，然后C-O-C键发生断裂。H202~~""FT('OH或'02一)影响壳聚糖&02氧化降解关键因素是1€202用量，反应温度以及反应时间。本发明对以上的影响因素进行优化。一、实一睑方法1.1壳聚糖氧化降解1)分别称取5g左右壳聚糖原料(含水量10%),加入到不同编号的250ml三角瓶中，并在每个烧瓶中加入100ml去离子水，静置10min,混匀后向每个三角瓶中加入一定量的30%(v/v)的H202;2)把三角瓶放入30。C,130r/min左右的SHA-C水浴恒温震荡器中反应，反应开始时间为Ohr;3)每隔一定时间耳又出3个平行样品，分别加入lmol/L亚碌u酸钠lml，震荡混匀，使降解反应停止；4)加入95%冷乙醇使体系中乙醇浓度达到70%以上，静置5~10min后，4由滤，洗涤；5)得到固体样品后-60°C冻干，得到不同反应时间的壳聚糖降解产物。备注若需将水溶性和非水溶性产品分开，则采用以下步骤a.加入10%氬氧化钠使溶液体系pH大于8,抽滤，洗涤，得到的产物分别-6(TC冻干。b.滤液经50。C旋转蒸发浓缩，-6(TC冷冻干燥，得到水溶性壳聚糖降解样口口P。6)实验结果取3个平行样品的平均值。1.2壳聚糖分子量测定1)粘均分子量的测定(Mri)称取干燥恒重的壳聚糖lg，用0.1mol/L乙酸-0.2mol/L氯化钠溶剂配成50ml样品溶液(溶液浓度为Cl),经过3号砂芯漏斗过滤，精确量取中间部分滤液10ml,移入乌氏粘度计侧管，将粘度计垂直固定于恒温水浴中保温10min以上，-使管内溶液的温度与水浴温度达到平tf。在另外2根支管口各接1根乳胶管，将侧管上面的乳胶管用夹子夹住，用吸球自中间乳胶管口吸气，使样品溶液渐渐上升，直到刻度线a以上，此时先放开夹子，再移走吸球，使样品溶液在毛细管内自然下落，用秒表准确测量并记录溶液下降时通过刻度线a和b的时间T。h]=2(Tisp-h/。(2-1)(2國2)"r=TVT:(2-3)其中T,为测得的降解后溶液的时间T2为测得的溶剂时间利用Mark-Houwink经验公式:=KM:(2-4)M为相对分子量K为常数，是一个与体系关系不大的单依赖于温度的数值，取0.00181cm3/g;a是一个与分子量有关的数值，取0.93;由式(2-4)可得到降解产品的粘均分子量，由于重均分子量测定费时较多，有时可用粘均分子量来估计样品分子量大小。2)重均分子量(Mw)及分子量分布的测定a)流动相的选择以超纯水，O.lmol/L硝酸钠溶液，0.2mol/L硫酸钠溶液(pH=5)、O.lmol/L氯化钠溶液，0.1mol/LNaAc+0.2mol/LHAc緩冲溶液为流动相，根据样品的溶解度、折光率、出峰时间和峰形等诸因素综合考虑，最后选定流动相。进样柱温为30。C，流速为1.0ml/min，进样量为20iaL。b)标准曲线的建立采用优选得到的流动相组成，根据原料来源和粘度法测得的产品粘均分子量，样品与不同分子量标样的保留时间的比较，确定选定标样分子量(Mw)范围。用标准分子量葡聚糖(Dextran,Fluka产品)作为标样。选取5个不同分子量的标样，加流动相制成5mg/mL的溶液作为标准溶液。柱温30。C,20nL进样，记录标样的保留时间tR应用GPC软件绘制标准曲线，得到回归方程。C)样品重均分子量(Mw)和分子量分布测定精密称取样品适量，加流动相溶解，制成5mg/mL的溶液，放置一段时间，取20juL进样，记录样品保留时间，根据已经获得的标准曲线方程，得到产品的重均分子量及分子量分布。二、结果与讨论1)壳聚糖非均相氧化降解中水溶与非水溶产物的分布表5:不同温度下壳聚糖降解水不溶性与水溶性产物的比例<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>壳聚糖的&02降解在酸、碱和水介质下均可以发生降解反应，根据文献报道，在中性和碱性介质中，大分子壳聚糖不溶于水，降解反应是非均相反应，加上壳聚糖分子内和分子间氢键的作用，H202渗入速度慢，反应发生在表面及无定形区，反应的可及度较小，反应速度相对较慢，且反应不均匀。但当降解产物分子量(Mw)低于7K后，产物已可溶于水。为了获取水步溶性低分子降解产物，本工作需首先明确水解过程中，非水溶性降解产物占总产物的比例。表5为不同温度下，壳聚糖氧化降解水溶性与水不溶性产物的比例。从表5中可以发现，在3CTC50。C条件下壳聚糖在中性条件下氧化降解，在反应的26hr之间，其降解物基本为水不溶性物质，其水溶性部分所占比例较小；当温度增加到60。C以上，其水溶性部分明显增加。从实验结果分析，当壳聚糖降解产物(MW)分子量低于7.5K时降解，产物可溶于水。从表5结果中还可以发现，当降解反应进入均相后，反应速度明显加快。与文献报道实验结果相比基本一致。由于本工作目标为获得水不溶性物质，因此在下进一步实验中拟在305(TC之间研究壳聚糖的降解规律。2)&02用量对壳聚糖降解的影响大量文献报道,双氧水的用量是获得水不溶性低分子壳聚糖的关键因素。随着H202加入量比例的增加，降解壳聚糖的分子量逐渐降低，选择适当H202的用量是控制降解得到特定分子量范围壳聚糖的关^t。此外，对于水不溶性壳聚糖的制备，&02用量还直接影响处理产品的色泽。根据文献报道和前期工作，壳聚糖在中性条件下降解，4(TC60。C时为壽丈感温度，而且随着温度的增加产品色泽也有加深的趋势。考虑到此条件下，壳聚糖降解的不稳定性，选择4(TC为反应温度。本工作选择压02按设定的用量比r(H202与糖单元摩尔比)/加入量分别为0.25/0.71ml，0.5/1.42ml，0.75/2.13ml，1.0/2.84ml,1.5/4.97ml,2.0/5.68ml,2.5/7.1ml,3.0/9.94ml，反应lhr后，采用GPC法测定壳聚糖降解产物的重均分子量(Mw),结果如图4所示。从图4结果可以发现，随着双氧水加入量的增加，壳聚糖的分子量不断降低，当r大于2.0后，壳聚糖的降解速度已变化不大，故在本发明中选取r=2.0为双氧7jc加入量。3)温度和降解时间对壳聚糖降解的影响由2丄1研究结果可知壳聚糖在50。C以下中性条件下氧化降解产物主要为水不溶性产物，据此本发明研究壳聚糖降解的温度定为30~50°C。图5是不同温度下壳聚糖氧化降解的时间曲线，由图可知壳聚糖在反应的初始阶段分子量快速下降，但随着反应时间的延长其分子量(Mw)的变化逐渐变小，直至最后基本不变。此外考虑到本项目研发产品的用途，产品色泽也是本研究重点考察的因素。图6为不同反应时间和温度下壳聚糖降解产物的色泽情况，由图可见壳聚糖氧化降解产物的色泽与反应温度关系不大，而与反应时间有较大关系，当温度50。C时，降解产物从2hr到6hr从淡黄色逐渐变为棕褐色。这与刘羿君等人的结果相似，而与任艳玲等人的结果不同。2.2壳聚糖降解数学模型的建立高聚物的降解一般服从无规则降解动力学，分子链上任何一处的同类化学键都有均等的断裂机会，也就是说，&02等对壳聚糖大分子链上(3-1,4糖苷键的进攻没有位置选择性，无规则的线性动力学方程由唐敖庆通过乡克i十方法4偉导出—ln(^)=—1n(^)+虹(1)义0式中z)——降解前初始重均分子量，7——为无规则降解产物重均分子量，k——为反应常数(1)式左边是对数形式，为了便于数学处理，将其展开成Maclaurin级数-ln()"ln(l-丄)iiiiiiiiii"2e3冗4x:由于壳聚糖降解物聚合度一般大于50,所以二次以上的高次项可以-,即为整理后可得:其中^=1—In(^zl)=丄(2)1"+K(3)才艮据以上对式(3)的非线性回归，得到结果如下:表1:采用非线性回归得到的不同温度下壳聚糖降解动力学参数<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>不同温度下壳聚糖降解曲线如图7所示，横坐标为降解时间，纵坐标为该时间壳聚糖的重均分子量(Mw)，图中图例为实验数据，曲线为模型计算值。根据式(4)的Arrhenins方程，即磁(5)对其两边求对数，得到lnk=lna-Ea/RT(6)式中，R为摩尔气体常数，J/(mol.K);T为反应温度，K;a为常数；Ea为反应活化能J'mol";对式(6)进行非线性回归，拟合得到如图8的结果，图中直线为计算值，图例为实验值。拟合得到的结果如下a=6.3218,活化能Ea二60.69KJ/mol,而且回归系数R^0.99926394,与实验结合符合较好。由此可见，采用H202溶液在中性条件下降解壳聚糖，其降解动力学较好地符合无规则线性动力学，其表观反应速率常数随温度的升高，符合Arrhenins方程。2.3壳聚糖的定向氧化降解根据式(3)建立的数学模型以及拟合得到的模型参数，根据不同需要定向制备Mw为IOKD、30KD和50KD的低分子水不溶性壳聚糖。由于产品对色泽也有较高要求，需综合考虑反应温度和降解时间对产品色泽的影响。由于降解温度在50。C以下，产品色泽变化小，决定在40。C下制备Mw=50K样品，在50。C条件下制备Mw=10KD和30K样品，双氧水加入量(R)为2.0。根据模型计算，制备Mw-IOKD产品，需反应5.92hr(50°C);Mw=30K产品，需反应1.62hr(50°C);制备Mw=50K产品需反应1.47hr(40°C)。根据上述模型计算得到的条件，进行了壳聚糖降解试验，得到产品后进行了GPC分析。根据标准分子量葡聚糖建立的标准曲线为log(Mw)=-0.6321xt+9.0856(7)Mw为重均分子量(Dalton)t为时间(min)40°C、1.62hr反应得到降解物的GPC分析图谱见图9，计算得到Mw=50401.9，PD=2.998;50°C、1.62hr反应得到降解物的GPC分析图谱见图10，计算得到Mw=30359.6,PD=2.868;50°C、5.92hr反应得到降解物的GPC分析图谱见图11,计算得到MW=10491.1，PD=2.689。由图9、10和11的结果可知，按照模型计算得到的降解条件参数制备的壳聚糖降解产物其重均分子量与理论值符合较好，这说明本工作建立的数学模型在一定的条件下可以指导定向制备不同分子量的壳聚糖降解物。三、结^仑l)研究了壳聚糖中性条件下氧化降解的工艺条件。考察了双氧水加入量、反应温度和时间等参数对壳聚糖降解物重均分子量的影响，发现壳聚糖在30~50°C，双氧水加入量(r)为2.0条件下，以水不溶性降解物为主；温度继续升高后，水溶性产物明显增加。降解温度和时间对产物的色泽有较大的影响，主要因素为反应时间。3)根据高聚物降解的无规则线性动力学和Arrhenins方程建立了壳聚糖在中性条件下氧化降解的动力学模型，并拟合得到了模型参数。4)根据建立的壳聚糖降解数学才莫型，得到制备Mw=IOKD、30KD和50KD壳聚糖降解产物的工艺条件。工艺条件为a.制备Mw=50±5KD壳聚糖H202用量比r(H202与糖单元摩尔比)2.0,40°C,1.47hr;b.制备Mw=30±3KD壳聚糖H202用量比r(H202与糖单元摩尔比)2.0,50°C,1.62hr;c.制备Mw-10±1KD壳聚糖压02用量比r(H202与糖单元摩尔比)2.0，50。C,5.92hr。实施例3:壳低聚糖L-乳酸盐制备高脱乙酰度低分子量壳聚糖虽然水溶性有一定提高，但是只能微溶于水，要进一步提高壳聚糖的水溶性，提高杀菌效果，而不破坏壳聚糖的基本结构，制备壳聚糖盐是一种很好的办法。L-乳酸是人体本身含有的一种有机酸，本身又有较好的杀菌效果，因此本项目结果国内外资料制备壳聚糖乳酸盐以提高其水溶性，提高抑菌效果。1.实-睑方法(1)壳聚糖乳酸盐制备在烧杯中称入壳聚糖样品10g，然后加蒸镏水500mL，溶涨30min，后加入9mLL-乳酸，混匀后放入恒温水浴摇床，60。C条件下反应45分钟。取出样品，用蒸馏水稀释到4L,先过滤出去大分子颗粒，然后用5KD聚砜膜超滤，滤液浓缩到原体积的1/5,冻干。(2)分析方法1)重均分子量(Mw)及分子量分布的测定a)流动相的选择以超纯水，0.1mol/L硝酸钠溶液，0.2mol/L碌u酸钠溶液(pH=5)、O.lmol/L氯化钠溶液，0.1mol/LNaAc+0.2mol/LHAc《爰沖溶液为流动相，根据样品的溶解度、折光率、出峰时间和峰形等诸因素综合考虑，最后选定流动相。进样柱温为30。C,流速为l.Oml/min,进样量为20juL。b)标准曲线的建立采用优选得到的流动相组成，才艮据原料来源和粘度法测得的产品粘均分子量，样品与不同分子量标样的保留时间的比较，确定选定标样分子量(Mw)范围。用标准分子量葡聚糖(Dextran，Fluka产品)作为标样。选取5个不同分子量的标样，加流动相制成5mg/mL的溶液作为标准溶液。柱温3(TC,20jaL进样，记录标样的保留时间tR应用GPC软件绘制标准曲线，得到回归方程。c)样品重均分子量(Mw)和分子量分布测定精密称取样品适量，加流动相溶解，制成5mg/mL的溶液，放置一段时间，取20pL进样，记录样品保留时间，根据已经获得的标准曲线方程，得到产品的重均分子量及分子量分布。2.实验结果1)不同分子量壳聚糖原料及其乳酸盐的平均分子量及其分布根据实验方法介绍分别以重均分子量120KD、50KD和30KD为原料，制备壳聚糖乳酸盐，壳聚糖乳酸盐与原料的分子量变化如表6所示。表6:壳聚糖原料及乳酸盐的重均分子量<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>由表所示，壳聚糖和对应的乳酸化产品的重均分子量和分子量分布变化不大，因此在制备时可以以壳聚糖原料的分子量作为基准。2)壳聚糖乳酸盐性质及其鉴定制备的壳聚糖乳酸盐经核磁共振(NMR)、液质联用(HPLC-MS)、元素分析、红外光谱(FT-IR)等分析(参见附录)，可发现壳聚糖的脱乙酰度达到99.9%,元素分析、核磁共振以及红外光谱等检测确定其为壳聚糖乳酸盐。3.结论1)壳聚糖乳酸盐制备工艺a、按壳聚糖去离子水=1:50(g:mL)溶涨30min,后按壳聚糖乳酸=1:9(g:mL)加入L-乳酸，混匀后放入恒温水浴60。C条件下反应45min。b、取出步骤a得到的溶液用蒸馏水稀释到壳聚糖去离子水=1:400(g:mL),微滤后，用5KD聚砜膜超滤，滤液浓缩到原来体积的1/5,-63'C冻干。2)壳聚糖和对应的乳酸化产品的重均分子量(Mw)和分子量分布变化不大，在制备壳聚糖乳酸盐时可以以壳聚糖原料的分子量作为基准。结论1)高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐制备工艺路线:壳聚糖—高脱乙酰化—定向氧化—乳酸化—冻干—产品2)高脱乙酰(DD^99.9%)条件为121。C下，加入3%(壳聚糖催化剂质量比)的相转移催化剂(十六烷基三甲基溴化铵，无毒，可去除)，用40。/。的氢氧化钠溶液反应3hr。3)得到制备Mw=IOKD、30KD和50KD低分子量壳聚糖降解工艺条件(原料Mw为120K),工艺条件为a.制备Mw=50士5KD壳聚糖H202用量比r(H202与糖单元摩尔比)2.0,40°C，1.47hr;b.制备Mw=30±3KD壳聚糖H202用量比KH202与糖单元摩尔比)2.0,50°C,1.62hr;c.制备Mw-10±1KD壳聚糖！1202用量比"11202与糖单元摩尔比)2.0,50°C,5.92hr;若原料分子量不是120KD,则在3050。C,『=2.0条件下，可以按下式确定反应时间，获得不同低分子量壳聚糖原料制备条件其中爿=丄，Xo为壳聚糖原料初始分子量(Mw)A="e-￡。/sr，Ea为反应活化能(KJ/mol)，T为反应温度(K)A=6.3218;Ea=60.69;4)壳聚糖乳酸盐制备工艺a.按壳聚糖去离子水=1:50(m:v)溶涨30min，后按壳聚糖乳酸=1:9(m:v)加入乳酸，混匀后》文入恒温水浴60。C条件下反应45min。b.取出样品，用蒸馏水稀释到壳聚糖去离子水=1:400(m;v),微滤后，用5KD聚砜膜超滤，滤液浓缩到原来体积的1/5,-63"冻干。5)产品冻干产品可在-63。C条件下冷冻干燥。权利要求1.一种高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐的制备方法，所述方法包括(1)高脱乙酰化反应壳聚糖在相转移催化剂存在下，于质量浓度35-40％的氢氧化钠溶液中于100～130℃下反应3～6小时，得到高脱乙酰化的壳聚糖，所述相转移催化剂为十六烷基三甲基溴化铵，所述相转移催化剂质量用量为壳聚糖质量的2％～4％，所述氢氧化钠溶液用量为5～20mL/g壳聚糖；(2)氧化降解取高脱乙酰化的壳聚糖，溶解于去离子水中，加入双氧水进行反应，双氧水与壳聚糖单元物质的量之比为1～3:1，根据产物分子量Xn与反应时间t之间的关系式确定氧化降解时间，于30～50℃下进行氧化降解反应式中Xn为降解产物重均分子量，单位Dalton；A　，X0为壳聚糖原料初始重均分子量，单位Dalton；k＝ae-Ea/RT，Ea为反应活化能，单位KJ/mol；T为反应温度，单位K；R为摩尔气体常数，单位J/(mol.K)；a＝6.3218；Ea＝60.69；R＝8.3145；t为氧化降解反应时间，单位min；降解反应结束后，反应液分离纯化得到壳聚糖降解物；(3)L-乳酸盐制备将壳聚糖降解物溶胀后，与L-乳酸反应，制得所述高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(1)为壳聚糖在相转移催化剂十六烷基三曱基溴化铵存在下，于质量浓度40%的氢氧化钠溶液中于121。C下反应3小时，得到高脱乙酰化的壳聚糖；所述相转移催化剂质量用量为壳聚糖质量的3%,所述氢氧化钠溶液用量为10mL/g壳聚糖。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(3)为按照壳聚糖降解物去离子水4g:50mL的比例，将壳聚^f唐降解物置于去离子水中，溶胀30分钟后，按照壳聚糖降解物L-乳酸4g:9mL的添加量加入L-乳酸，60。C恒温反应45分钟，反应液用去离子水稀释至壳聚糖降解物去离子水二lg:400mL，微滤后，用5KD聚砜膜超滤，滤液浓缩，-63°。冻干，得到所述高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐。4.如权利要求13之一所述的方法，其特征在于步骤(l)中所用原料壳聚糖重均分子量为120kD,步骤(2)中按照log(Mw)=-0.6321*t+9.0856确定氧化降解反应时间，Mw为降解产物重均分子量，单位Dalton;t为氧化降解反应时间，单位min。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于原料壳聚糖重均分子量为120kD,产物高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐重均分子量为50士5KD，步骤(2)中氧化降解温度为40°C，氧化降解反应时间为1.47小时，双氧水与壳聚糖单元物质的量之比为2:1。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于原料壳聚糖重均分子量为120kD,产物高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐重均分子量为30士3KD，步骤(2)中氧化降解温度为50°C,氧化降解反应时间为1.62小时，双氧水与壳聚糖单元物质的量之比为2:1。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于原料壳聚糖重均分子量为120kD,产物高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐重均分子量为10士1KD，步骤(2)中氧化降解温度为50°C，氧化降解反应时间为5.92小时，双氧水与壳聚糖单元物质的量之比为2:1。全文摘要本发明提供了一种高脱乙酰度低分子量壳聚糖L-乳酸盐的制备方法。本发明采用双氧水在中性条件下氧化降解制备水不溶性低分子量壳聚糖的工艺路线和关键控制因素，在此基础上建立合适的数学模型，通过模型计算能实现壳聚糖的定向降解。本发明的有益效果主要体现在壳聚糖脱乙酰度高、产品无毒、无副反应；通过模型计算，能得出不同分子量壳聚糖L-乳酸盐的制备条件，实现定向的制备，工艺的重复性和稳定性也易于控制。文档编号C08B37/00GK101362806SQ20081012139公开日2009年2月11日申请日期2008年10月9日优先权日2008年10月9日发明者吴绵斌,孔繁智,朱婉萍,黄飞华申请人:浙江省中医药研究院