专利名称：以剩余污泥发酵液为碳源合成聚羟基脂肪酸酯的方法
技术领域：
本发明属于环境保护技术领域，具体涉及一种以污水处理厂剩余污泥发酵液为碳源，利 用活性污泥在好氧多次进料-排水工艺(Aerobic Feeding and Discharge, AFD)条件下合成聚羟 基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)的方法。
背景技术：
在由不可降解塑料带来的环境问题日益严重的情况下，PHA作为一种传统化学合成塑料 的替代品正日益受到广泛的重视。这不仅是因为其机械性能与传统塑料相似，而且它可以完 全被生物所降解。PHA是许多微生物细胞内的能量和碳源类储存物质。目前商业生产的PHA 主要是利用经筛选的微生物或基因工程菌进行纯种发酵合成,，与传统石化高分子材料相比， PHA的生产成本较高，这大大阻碍了 PHA商业化的进程。早在20世纪70年代，人们己经 发现活性污泥可以积累PHA (例如，文献Environmental Science & Technology, 1974， 8， 576-579)。采用活性污泥合成PHA无需在无菌条件下进行，因而生产成本有望得到降低。
在用微生物合成PHA时，碳源所占的费用是影响PHA生产成本的另一个重要因素。在 过去的研究中，用于PHA合成的碳源主要是乙酸、丙酸、葡萄糖等纯物质。为降低碳源成本， 就需要寻找能够合成PHA的更为廉价的碳源。随着全世界范围内污水处理率的提高，每年数 量巨大的剩余污泥被源源不断地产生。有研究表明剩余污泥通过厌氧发酵可产生大量短链脂 肪酸(Short Chain Fatty Acids， SCFAs)、碳水化合物和蛋白质等物质(例如，文献Environmental Science & Technology, 2006， 40， 2025-2029)，其中短链脂肪酸是易被微生物利用并合成PHA 的物质，因此，对剩余污泥的发酵液作为PHA合成的碳源的方法进行研究、开发具有积极意 义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以污水处理厂剩余污泥厌氧发酵产生的发酵液为碳源，利用 活性污泥合成聚羟基垸酸(PHA)的方法。
为达到上述目的，本发明的解决方案是
针对发酵液组分的特点，采用好氧多次进料-排水工艺(Aerobic Feeding and Discharge, AFD)进行PHA的合成，并取得了较高的产量(PHA占细胞干重72.9%)。所谓AFD工艺， 就是将发酵液分为若干次加入反应器中，每次待所加入的发酵液中的SCFAs消耗完毕，停止 曝气并静置沉淀，排出与所加入发酵液相同体积的上清液，而后再补加等体积的发酵液，重 新开始曝气。AFD工艺为活性污泥提供交替出现的外碳源充足和缺乏环境，这种环境有利于PHA的合成和累积。同时，在两次补充发酵液的间隙排出上清液又可以保证进料后反应器内 较高的SCFAs浓度，较高的有机负荷有利于PHA的合成(文献:Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2005, 80， 1306-1318)。因此，AFD工艺为活性污泥提供了适于合成PHA 的环境，从而得到了较高的产量。
本发明提出的一种以污水处理厂剩余污泥发酵液中的短链脂肪酸为碳源，利用活性污泥 在好氧多次进料-排水工艺(Aerobic Feeding and Discharge, AFD)条件下合成PHA的方法， 具体步骤如下
(1) 取污水处理厂产生的剩余污泥放入发酵罐中，调节pH至8-11，在室温下搅拌6-10 d(天)，将混合物进行泥水分离，收集到的液体即为发酵液。
(2) 将活性污泥置于反应器中，向其中加入(1)中得到的发酵液，在好氧条件下曝气， 待所加入的发酵液中的SCFAs消耗完毕，停止曝气并静置沉淀，排出与前述步骤中所加入发 酵液相同体积的上清液，而后补加等体积的发酵液并再次曝气。重复上述过程若干次，待最 后一次加入的发酵液中的SCFAs消耗完毕，停止曝气。
(3) 通过离心收集积累了 PHA的活性污泥，经冷冻干燥后与氯仿混合震荡，取其上清 液在旋转蒸发仪中蒸发浓縮，而后，在搅拌条件下加入冷乙醇，所得白色絮状沉淀即为合成 的PHA。
其中，(1)中剩余污泥厌氧发酵生产发酵液的方法采用文献中报道的方法(例如，文献 Environmental Science & Technology, 2006， 40， 2025-2029); (3)中的PHA提取方法采用文 献中报道的方法(例如:文献Mac匪olecule， 1986， 19: 2860-2864)。
在上述PHA合成过程中，碳源浓度过高会对活性污泥造成抑制，过低则PHA的累积量 相应降低，因此，发酵液与活性污泥的比例通常控制在0.5:1 10:1。同时，适当的溶解氧浓度 也是促进SCFAs被活性污泥吸收并转化为PHA的重要因素之一，通常控制在0.5~8mg/L。此 外，过短的曝气时间不能保证SCFAs的充分吸收，过长的曝气时间会造成活性污泥内已累积 的PHA的分解，因此，曝气时间通常控制在0.5~10h。最后，合适的发酵液投加次数一方面 可提高发酵液中碳源的利用效率，另一方面可保障活性污泥获得充足的碳源，通常控制在 2~10次。
其中，本发明较好的条件是发酵液与活性污泥的体积比为1:1 5:1;每次投加发酵液曝 气时间l 5h;溶解氧浓度控制在4~7mg/L;发酵液投加次数为3 6次。
由于采用了上述方案，本发明的有益效果是
(1) 具有良好的环境效益首先，在生产发酵液的同时可实现污泥减量和稳定化；其 次，用发酵液做碳源，可减少乙酸、葡萄糖等不可再生能源的消耗；最后，所合成的PHA是 可完全生物降解材料，用于替代传统石化塑料可在一定程度上解决传统塑料所造成的环境污 染；
(2) 具有良好的经济效益 一方面，采用AFD工艺可得到较高的PHA产量，从而可
降低PHA的生产成本；另一方面，活性污泥法无需严格控制操作条件，可以节省费用。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。 实施例l:
(1) 剩余污泥厌氧碱性发酵生产SCFAs
剩余污泥厌氧碱性发酵生产SCFAs的方法参照相关文献(例如，文献Environmental Science and Technology, 2006， 40: 2025 -2029)，具体步骤是在有机玻璃制成的工作容积为5 升的反应器中，加入城市污水处理厂的剩余污泥(其含水率为99.4%， pH=6.72)作为发酵产 酸的底物，反应温度为20士rC，调整pH为10，在厌氧条件下搅拌7d，取泥水混合物离心， 收集清液即为发酵液，用做下述PHA合成中的碳源。发酵液中含SCFAs 2606mgCOD/L，蛋 白质882mg/L，碳水化合物201mg/L。
(2) 活性污泥合成PHA
将0.5L活性污泥置于反应器中，同时向其中加入发酵液，在好氧条件下曝气，控制溶解 氧浓度为8mg/L，所加发酵液体积与活性污泥体积比为0.5:1，共投加5次发酵液，每次待所 加入发酵液中的SCFAs消耗完毕后，停止曝气并静置沉淀，排出与前述步骤中所加入发酵液 相同体积的上清液，并补加等体积的发酵液，5次投加发酵液后分别曝气0.5、 0.5、 1、 1、 2h， 而后停止曝气，离心收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA317.4mg。
(3) 活性污泥中PHA的测定
活性污泥中PHA含量的测定参照相关文献(例如，文献Applied Microbiology and Biotechnology, 1978， 6: 29-37)，具体步骤是将污泥样品于冷冻干燥机中干燥至粉末状， 称取干燥后的污泥粉于裂解瓶中，依次加入氯仿、硫酸一甲醇和苯甲酸一甲醇溶液，于102r 下裂解数小时，待冷却后，加蒸馏水离心，取有机相进行气相色谱分析。
(4) 活性污泥中PHA的提取
活性污泥中PHA的提取方法参照相关文献(例如，文献Macromolecule， 1986， 19: 2860-2864)，具体步骤是取经冷冻干燥的污泥样品，与10倍体积的氯仿混合震荡24h (摇 床30'C， 200转/min)，将上述混合液离心，即得含PHA的上清液，将上清液在旋转蒸发仪 中蒸发浓縮后，在搅拌条件下加入5倍体积冷乙醇(0 4 。C)并在0。C冰箱中放置30min。 待白色絮状沉淀出现，过滤烘干即得所合成的PHA。
实施例2:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为1:1，控制溶解氧浓度 为0.5mg/L，每次投加发酵液后分别曝气3、 4、 5、 6、 7h，其余条件同实施例1，反应结束 时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA186.3mg。
实施例3:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为10:1，控制溶解氧浓度
5为6mg/L，发酵液投加次数为3次，每次投加发酵液后分别曝气6、 7、 8h，其余同实施例1， 反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA292.5mg。
实施例4:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为8:1，控制溶解氧浓度 为8mg/L，发酵液投加次数为6次，每次投加发酵液后分别曝气5、 6、 7、 8、 9、 10h，其余 条件同实施例l,反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA354.6mg。
实施例5:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为1:1，控制溶解氧浓度 为6mg/L，发酵液投加次数为2次，每次投加发酵液后分别曝气1、 2h，其余条件同实施例1， 反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA374.9mg。
实施例6:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为5:1，控制溶解氧浓度 为7mg/L,发酵液投加次数为3次，每次投加发酵液后分别曝气4、 5、 6h，其余条件同实施 例l，反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA408.6mg。
实施例7:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为2:1，控制溶解氧浓度 为4mg/L，发酵液投加次数为4次，每次投加发酵液后分别曝气2、 3、 4、 5h，其余条件同 实施例l，反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA423.8mg。
实施例8:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为0.5:1，控制溶解氧浓度 为5mg/L，发酵液投加次数为10次，每次投加发酵液后分别曝气1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10h，其余条件同实施例l,反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA485.2mg。
实施例9:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为3:1，控制溶解氧浓度 为6mg/L，发酵液投加次数为3次，每次投加发酵液后分别曝气2.5、 3.5、 5h,其余条件同 实施例l，反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA548.3mg。
实施例10:剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为1:1，控制溶解氧浓度 为6mg/L，发酵液投加次数为3次，每次投加发酵液后分别曝气1、 2、 3，其余条件同实施 例l，反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA647.9mg。
实施例ll:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为1:1，控制溶解氧浓度 为6mg/L，发酵液投加次数为4次，每次投加发酵液后分别曝气1、 2、 3、 4h，其余条件同 实施例l，反应结束时收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA729.1mg。
实施例12:
剩余污泥发酵液的获得及污泥中PHA的测定和提取方法见实施例1。
PHA的合成方法如下改变所投加发酵液与活性污泥的体积比为1:1，控制溶解氧浓度 为6mg/L，每次投加发酵液后分别曝气1、 2、 3、 4、 5h，其余条件同实施例1，反应结束时 收集活性污泥，测得每克污泥中含PHA732.4mg。采用Waters公司的150C型凝胶渗透色谱 测得所得PHA的重均分子量为8.5xl05Da，采用TA公司的Q100型差式扫描量热仪测得所得 PHA的熔点为101.4°C，玻璃转化温度为2.68"C。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉 本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应 用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技 术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于以污水处理厂剩余污泥发酵液为碳源，利用活性污泥在好氧多次进料-排水工艺条件下合成聚羟基脂肪酸酯。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于(1 )取污水处理厂产生的剩余污泥放入发酵罐中，调节pH至8~11,在室温下搅拌6~10d, 将混合物进行泥水分离，收集到的液体即为发酵液；(2) 将活性污泥置于反应器中，向其中加入步骤(1)中得到的发酵液，在好氧条件下 曝气，待所加入的发酵液中的短链脂肪酸消耗完毕，停止曝气并静置沉淀，排出与所加入发 酵液相同体积的上清液，而后补加等体积的发酵液并再次曝气；重复上述过程若干次，待最 后一次加入的发酵液中的短链脂肪酸消耗完毕，停止曝气；(3) 通过离心收集积累了聚羟基脂肪酸酯的活性污泥，经冷冻干燥后与氯仿混合震荡， 取其上清液在旋转蒸发仪中蒸发浓縮，而后，在搅拌条件下加入冷乙醇，所得白色絮状沉淀 即为合成的聚羟基脂肪酸酯。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中所加入的发酵液与活性污泥的 体积比为0.5:1 10:1。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中每次加入发酵液后的曝气时间以 短链脂肪酸消耗完毕为准，曝气0.5 10h。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中曝气过程中，反应器内溶解氧浓 度为0.5~8mg/L。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中发酵液的投加次数为2-10次。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于发酵液与活性污泥的体积比为1:1 5:1;每次 投加发酵液曝气时间l~5h;溶解氧浓度控制在4~7mg/L;发酵液投加次数为3 6次。
全文摘要
本发明属于环境保护技术领域，具体涉及一种以污水处理厂剩余污泥发酵液为碳源，通过活性污泥在室温、好氧条件下合成聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)的方法。它首先将污水厂产生的剩余污泥在厌氧条件下水解，获得剩余污泥的发酵液，再将其加入到含有活性污泥的反应器中，在好氧多次进料-排水工艺(Aerobic Feeding and Discharge，AFD)条件下使PHA在活性污泥中得到高效积累。本发明提供了一种资源化利用污水处理厂剩余污泥高效合成PHA的方法，具有良好的环境效益和经济效益。
文档编号C08G63/06GK101555314SQ20091005176
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者姜亚敏, 陈银广 申请人:同济大学