专利名称：一种具有抗肿瘤活性的水溶性低分子虫草多糖及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种虫草多糖，同时，本发明还涉及一种所述虫草多糖的制备方法及 其在抗肿瘤和提高机体免疫力方面的应用。
背景技术：
虫草多糖是虫草中含量较高的抗肿瘤活性物质，但虫草多糖种类繁多，结构复杂， 目前的研究初步认为多糖的生物活性与其结构有关，但目前对虫草多糖的化学组成、链结 构、分子大小与抗肿瘤作用之间的关系研究较少，尚缺乏规律性的科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虫草多糖，其活性成分明确、结构清晰、分子量大小明 确、质量可控，用于抗肿瘤和提高机体免疫力，效果可靠，并且几乎无不良反应。本发明的另一目的在于提供该虫草多糖制备方法，其方法工艺简单，产品收率高。本发明的目的还在于提供该虫草多糖在抗肿瘤和提高机体免疫力方面的应用。本发明提供的虫草多糖，其所含活性多糖成分的含量为94. 57%，平均相对分子量 约为9874。糖链构型为吡喃糖，该多糖由木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖四种单糖组成，其比 例为0.31 0.89 0.54 1。主要以1 — 2、1 — 3位糖苷键连接，还含有少量的1 — 6 键合的糖基。本发明提供的虫草多糖的制备方法，以人工发酵培养虫草菌丝体为原料，包括以 下步骤用30%乙醇作提取剂，提取温度为70°C，料液比为1 20，提取时间为2小时。提 取液经去脂、去蛋白、50%乙醇沉淀，经DEAE Sephadex A_25柱和S印hadex G_75柱逐级纯 化，冷冻干燥后即得到该虫草多糖。本发明的体外活性实验证明该水溶性低分子虫草多糖能抑制肿瘤细胞株的生长， 在以人肝癌细胞株Bel-7204和人胃癌细胞株SGC-7901为靶细胞的MTT还原法检测抗肿瘤 活性试验中，半数致死量IC5tl分别为3. 756和5. 256 μ g/ml，表明该水溶性低分子虫草多糖 具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。体内活性实验表明，该水溶性多糖对植入小鼠体 内的SarcomalSO肿瘤的生长具有明显的抑制作用，而且无毒副作用。
具体实施例方式实施例1 水溶性低分子虫草多糖的制备以人工发酵培养虫草菌丝体为原料，古尼虫草菌丝粉一30%乙醇溶液70°C热回 流提取一离心、抽滤一保留清液，残渣反复提取一合并提取液一浓缩一冷冻干燥一粗多糖 CPS —脱脂一sevage法去蛋白一离心一保留清液一加入乙醇使浓度达到50% —离心得沉 淀，沉淀经DEAE-S印hadex A_25柱层析一苯酚硫酸法跟踪检测一合并峰值附近洗脱液一冷 冻干燥一得固体一经过S印hadex G-75柱层析一得精制多糖。
实施例2 =MTT还原法检测水溶性低分子虫草多糖的抗肿瘤活性试验1.细胞培养MFC细胞培养于含有10%胎牛血清，青、链霉素各100μ g/mL的RPMI-1640培养 基中，5% C02，37°C，饱和湿度的条件下常规培养，每48h 72h更换一次新鲜培养基，并按 1 3的比例传代培养，以保证实验所用细胞均处于对数生长期。
MFC细胞常规培养，每48h更换一次新鲜培养基，传代时用hanks液(不含Ga2+、 Mg2+等离子)洗细胞两次后，加胰酶(含0. 05%胰酶、0. 02 % EDTA)1 2mL覆盖培养瓶底 面，于培养箱中消化10 15min，加入3 4mL含血清的培养基终止消化，收集细胞液离心 (1000rpm/min,7. 5min)，离心后倾去上清液加入新鲜培养基进行培养。2抗肿瘤活性的测定MTT法将IX IO5个/mL细胞悬液接种于96孔板中，每孔加100 μ L。实验组同时分别加 入不同浓度的测试药物，每个浓度6个平行孔，另设6个不加药物的细胞孔作为阴性对照。 37°C,5% CO2培养箱培养72h后1000rpm/min离心lOmin，弃去上清。再向每孔加入0. 5mg/ mL的MTT与ρΗ7· 4的PBS缓冲液的混合液100 μ L，继续培养4小时后，1500rpm/min离心 15min，弃去上清液，每孔加入150 μ L 二甲基亚砜(DMSO)，震荡2min使细胞中的结晶物充 分溶解，用酶标仪测定570nm波长下的吸光度值，并计算各浓度药物对细胞生长的抑制率 (M)。绘制细胞活力曲线图，求出IC5tl值。试验结果如表1所示。结果表明，水溶性低分子 虫草多糖具有较强的细胞毒性，其毒性对正常细胞和癌细胞具有一定的选择性；水溶性低 分子虫草多糖可用于制备抗肿瘤药物。表1.水溶性低分子虫草多糖的细胞毒性试验结果
试验细胞正常人肝细胞株人肝癌细胞株人胃癌细胞株
_L-02_Bel-7204_SGC-7901
ICso Wml)_13.422_3.756_5.256_实施例3 体内抑瘤活性实验小鼠于接种Sarcoma 180肿瘤细胞后第2天静脉注射给药，连续10天，观察小鼠 的各种表现、肿瘤生长及死亡情况，停药后1天处死S180实体瘤小鼠，观察药物的抑瘤率， 结果表明①25、50、100mg/kg对S180肿瘤的生长有抑制作用，分别是41.2、51.5、70. 1%, 提示水溶性低分子虫草多糖具有较强的抗肿瘤作用。
附图1为虫草多糖CPS-50-A1的1H NMR谱和13C NMR谱；附图2为虫草多糖CPS-50-A1的HSQC图谱；附图3为虫草多糖CPS-50-A1提取分离纯化流程。
权利要求
一种具有抗肿瘤活性的水溶性低分子多糖，由下法制得用30％乙醇作提取剂，从虫草菌种深层发酵培养出的菌丝体中提取虫草多糖，通过单因素和正交实验确定了古尼虫草多糖的最佳提取工艺温度为70℃，料液比为1∶20，提取时间为2小时。提取液经去脂、去蛋白、50％、70％乙醇沉淀，冷冻干燥后得到粗多糖。经DEAE SephadexA-25柱和SephadexG-75柱逐级纯化，冷冻干燥得到一种水溶性低分子多糖CPS-50-A1。
2.权利要求1所述水溶性低分子多糖的制备方法，其特征在于用30%乙醇作提取 齐U，从虫草菌种深层发酵培养出菌丝体中提取虫草多糖，通过单因素和正交实验确定了古 尼虫草多糖的最佳提取工艺温度为70°C，料液比为1 20，提取时间为2小时。提取液经 去脂、去蛋白、50%、70%乙醇沉淀，冷冻干燥后得到粗多糖。经DEAE Sephadex A-25柱和 SephadexG-75柱逐级纯化，冷冻干燥得到一种水溶性低分子多糖CPS-50-A1。
3.权利要求1所述的水溶性低分子多糖在制备抗肿瘤药物中的用途。
4.权利要求1所述的水溶性低分子多糖在制备提高机体免疫功能的保健品中的用。
全文摘要
本发明公开了具有抗肿瘤活性的人工培养的虫草菌丝体水溶性低分子多糖及其制备方法和用途。用30％乙醇作提取剂，最佳提取工艺温度为70℃，料液比为1∶20，提取时间为2小时。经去脂、去蛋白、50％、70％乙醇沉淀，冷冻干燥后得到粗多糖。粗多糖经DEAE SephadexA-25柱和Sephadex G-75柱逐级纯化，得到一种水溶性低分子多糖。该多糖纯度较高，其多糖含量为94.57％，相对分子质量约为9874。该水溶性多糖对人肝癌细胞株Bel-7204和人胃癌细胞株SGC-7901的增殖有显著的抑制效果，对植入小鼠体内的S180肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。本发明水溶性低分子虫草多糖活性成分明确，质量可控，可用作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。
文档编号C08B37/00GK101805412SQ20091007032
公开日2010年8月18日 申请日期2009年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者刘安军, 原静, 司传领, 朱振元, 钟玥如 申请人:天津科技大学