一种肝素的提取、分离、纯化方法

专利名称：：一种肝素的提取、分离、纯化方法
技术领域：
：本发明涉及一种肝素的提取、分离、纯化方法。
背景技术：
：肝素(h印arin)是天然的抗凝血物质，因而受到了世界各国的重视。肝素广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在。肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在。这种复合物没有抗凝血活性，但在去除蛋白质后，这种抗凝活性逐渐表现出来。肝素用于临床虽有60余年的历史，但到目前为止还没有一种能够完全代替它的产品，所以它仍然是最重要抗凝血和抗血栓的生化药物之一。肝素具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素不但有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。肝素主要来源于畜禽副产物中的猪小肠黏膜、牛肺等，并且我国是国际上最主要的肝素供应国，肝素钠是我国最重要的创汇产品之一，80%的粗品或精品肝素出口到美国和德国。但我国应用的低分子肝素主要依靠进口，是由国外将肝素钠再行降解形成低分子肝素后再输入到我国。目前临床上用于抗血栓的药剂主要是肝素制剂，据IMS统计，2004年肝素市场的全球销售额已突破40亿美元。不断完善从粗品原料到精品再到成品制剂完备的产业链，研究肝素制备技术的提升、创新将具有重要的经济意义和社会效益。猪小肠粘膜肝素是我国重要的出口的生化药物，但目前生产的肝素产品存在着效价低、提取率低、环境污染大、不符合药典标准、产品毒副作用大、活性低等缺陷，大多数是以粗品肝素的形式存在。
发明内容为解决
背景技术：
中的不足，本发明提供一种肝素的提取、分离、纯化方法，该方法所得到的肝素具有以下特点(l)提取率可达230.81mg/kg，比传统方法提高40%;(2)肝素的效价提高为150U/mg。本发明所采用的技术方案内容是该肝素的提取、分离、纯化方法，按如下步骤进行蛋白酶水解法提取肝素、超声波辅助盐析法、树脂吸附分离肝素及肝素的纯化。蛋白酶水解法、超声波辅助盐析法提取肝素及树脂吸附分离肝素包括下列步骤-(1)酶解、盐解及过滤将匀浆后的猪小肠粘膜移入提取锅，需要加l:15倍重量的水，用NaOH调pH至8.5，55。C加热半小时，加入猪小肠粘膜质量2%的胰蛋白酶反应2小时，加入混合液质量5%的NaCL在6(TC反应2小时，之后将上述混合液加入到超声波药品处理机内，超声温度为40。C，超声时间为40min，超声功率为300W，超声处理之后用300目的滤布过滤；(2)吸附将上述滤液移入吸附罐中，在液体温度为4(TC的条件下，按原来猪小肠粘膜质量的8°/。加入树脂，搅拌吸附3小时；(3)清洗把(2)中的树脂倒入不锈钢桶中，用1.2mol/L的NaCL浸泡洗涤30min;'(4)洗脱把(3)中的树脂移入桶中用5mol/L的NaCL浸泡3小时，要不时轻轻搅动，促使肝素解析；(5)酸处理将洗脱液用HCL调pH值至3.5处理30min;(6)碱处理将(5)得到的洗脱液用NaOH调pH至10处理3h;(7)乙醇沉淀将(6)中所得的洗脱液用1.5倍体积的95%酒精处理12h，搅拌静置，虹吸出上层清液；(8)干燥把下层沉淀取出滤干，在60'C下真空干燥,得到肝素粗品。肝素的纯化包括下列步骤(1)S印hadexG50凝胶柱层析分离肝素①溶胶用烧杯取2gS印hadexG50凝胶，用缓冲液在IO(TC水浴中加热凝胶13h，然后采用倾泄法倾去上层小颗粒的浮胶，防止层析时堵塞凝胶网孔，将溶好的凝胶与过滤后的去离子水按3"(W/V)进行混合，柱子中应先装入35mm缓冲液并关闭出水口；②装柱将①中溶好的凝胶与去离子水的混合液用玻璃棒搅拌均6匀后引流灌入3.6*85cm的柱子中，让凝胶自然沉积，打开出水口，待凝胶自然沉积完毕后，关闭出水口，灌好后的柱子应该表面平整，柱体没有气泡，以免影响分离，如表面不平就用玻璃棒将胶面轻轻搅起，让其再自然沉降。如柱内有细小的气泡则应该重新装柱；③平衡灌好的柱子胶面上用缓冲液加满直至进样口，并确保没有气泡进入，然后进行平衡25柱床体积；④上样将肝素样品500mg用10mL缓冲液溶解后，用0.45um微孔滤膜过滤，等缓冲液液面距离胶面2mm左右时将过滤后的肝素溶液延柱壁缓慢加入，要注意在加样时防止将胶面冲起影响分离。上样的流速2mL/min，上样体积为1.5mL;⑤洗脱样液进入胶床后与胶床基本平齐时用0.2mol/LNH4HC03为流动相洗脱样品，流速为5mL/min，为便于洗脱缓冲液中应加入0.lmol/L的NaCL，用咔唑法检测，收集不同的洗脱峰，获得Mr不同的肝素分离组分；收集将各次分离的相同洗脱峰样品合并，用旋转蒸发仪浓縮后，冻干，选择经过S印hadexG50第一次分离、冻干样品用0.2mol/L的NH4HC0s溶解，上样流速为2mL/min;用Superdex30凝胶层析柱进行第二次分离，用0.2mol/LNH4HC03为流动相洗脱样品，流速为5mL/min，用咔唑法检测，再收集不同的分离组分，浓縮、冻干，得到不同Mr的寡糖片段；(2)QFFSpharose离子交换色谱分离肝素①装柱将SPS印haroseFF凝胶填料用玻璃棒搅拌均匀后缓慢倒入玻璃柱内，使凝胶自然沉积，要注意不要有气泡出现，待胶面平整后进行洗柱；②洗柱用蒸馏水清洗凝胶柱约lh，直至pH为中性，流速为2.0mL/min进行压柱；③平衡用0.2Mol/L的NaCl溶液即A液来平衡柱子，直到pH为中性；④进样将经过QFFS印harose凝胶柱层析分离系统分离后所获得的Mr分布范围小即分子量3000-20000Da的组分20mg溶解于10mL蒸馏水中，用0.45um微孔滤膜过滤，上QFFS印harose(90um，2.0求25cm)强阴离子交换柱，以L0mL/min流度，进样量为1.5mL，其上样方法与凝胶层析的方法一样；⑤洗杂用A液继续洗脱，流速为1.OmL/min，当用平衡缓冲液洗脱至基线时，洗脱停止，这主要是洗脱掉不能吸附的色素及一些杂蛋白等物质，这时检测紫外波长在280nm的吸光值，每2mL为一管收集洗脱液并检测有无肝素；(D洗脱采用梯度洗脱法将事先配好的2mol/L的NaCl溶液装入恒流泵的B液瓶中，等A液瓶中的洗脱液即A液低于B液时并且已经洗脱至基线时，将恒流泵中A、B液中间的阀门打开，使A、B混合，并流入层析柱中进行洗脱；流速为5.OmL/min，在216nm波长处检测，QFFSpharose离子交换色谱分离肝素条件为用水和2mol/L的NacL为流动相进行梯度洗脱，流速为5.OmL/min，在216nm波长处检测；⑦收集在紫外216nm处在线检测洗脱液，分别收集各阶段洗脱峰，旋转蒸发仪浓縮，冻干，可获得不同肝素分离产物。上述方案的缓冲液为去离子水。本发明的有益效果是由本发明采用蛋白酶水解法提取肝素及超声波辅助盐析法提取肝素相结合的方法，纯化采用S印hadexG50凝胶柱层析分离肝素的方式，由上述方法得到的肝素提取率可达230.81mg/kg，比传统方法提高40%，肝素的效价提高为150U/mg，达到国际领先水平。图1是酶水解温度对肝素提取物率的影响曲线；图2是酶水解时间对肝素提取物率的影响曲线；图3是料液比对肝素提取物率的影响(w/v)曲线；图4是超声功率和肝素提取率的变化关系曲线；图5是超声温度和肝素提取率的变化关系曲线；图6是超声时间对肝素提取物率的影响曲线；图7是温度对肝素吸附量的影响曲线；图8是吸附时间对肝素吸附量的影响曲线；图9S印hadexG-50分离肝素图谱；图10QFFs印harose离子交换层析分离肝素图谱；图11肝素PAGE电泳结果；图12是柱层析前的肝素的紫外光谱图；图13是柱层析后的肝素的紫外光谱图；图14为柱层析纯化前的肝素的红外谱图；图15为柱层析纯化后的肝素的红外谱图；图16标准双糖混合物的HPLC图谱见图17肝素样品的HPLC图谱。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例l、首先对蛋白酶水解法提取肝素步骤中酶水解温度、酶水解时间、料液比进行单因素试验。(1)酶水解温度对肝素提取率的影响设定料液比为1:15，提取时间2h，温度在4070。C之间取7个点进行试验，然后测定吸光值，求出平均值，用空白溶液做对照，每个试验做3个平行样。根据所得数据绘制出肝素提取率与酶水解温度的关系曲线图1。如图1所示，随着温度的提高肝素提取率增加显著，温度在55'C时肝素提取率最高。但温度过高肝素提取率明显下降。(2)酶水解时间对肝素提取率的影响试验设定在提取温度55'C，料液比1:15条件下，酶水解时间在0.53.5h之间取7个点进行试验，然后测定吸光值，求出平均值，用空白溶液做对照，每个试验做3个平行样。根据所得数据绘制肝素提取率与酶水解时间的关系曲线图2。由图2可见，提取时间在2h之内酶水解速度较快，水解2h肝素提取物率最高，以后增加趋于平缓。这表明目的产物与酶解时间密切相关，时间过短水解不充分，但时间过长又会引起产物结构的变化进而使肝素提取物率降低。(3)料液比对肝素提取率的影响试验设定在固定温度55。C、提取时间2h，料水比在1:51:35之间选取7个点。然后测定吸光值，求出平均值，用S白溶液做对照，每个试验做3个平行样。根据所得数据绘制出肝素提取率与料液比的关系曲线图，肝素提取率随料液比的变化规律如图3所示。如图3所示，随着料液比的增大，肝素的得率提高，料液比在1:51:15之间是上升趋势的，当料液比为l:15时肝素提取率达到最大值，随着料液比的增大肝素的提取率逐渐减小。通过单因素试验及其对结果分析确定试验因素水平编码表见表1。试验因素水平编码表表l编码水平Xl温度X2时间X3料液比-l5011:505521:1016031:15利用SAS(version8.2)软件对表中肝素提取率试验数据进行多元回归拟合分析、回归方差分析显著性分析。结果显示模型的R2=0.9810，说明该模型与实际试验拟合较好，自变量与响应值之间线形关系显著，可以用于肝素酶法提取试验的理论预测。回归方程各项的方差分析结果还表明方程的一次项、二次项的影响都是高度显著的，并且交互项中X1与义3项显著，因此各个具体试验因子对响应值的影响不是简单的线形关系。各因素经回归拟合后，选择对响应值显著的各项，得到肝素酶法提取得率对编码自变量(提取温度、时间和料液比)的二次多项回归方程为r=9.70+1.54Z2+0.69X3-0.76xj+0.012%,X2—0.58%,%3—0.60%22—084义32通过响应面和等高线图考察两两因子之间的关系，为了进一步确证最佳点的值，采用SAS软件的RSREG程序对试验模型进行典型性分析，以获得最大肝素提取得率时的各提取条件，优化后的蛋白酶水解法提取肝素的最佳工艺参数为提取温度55°C;时间2h;料液比1:15，在此条件下肝素提取率为206.83mg/kg，比传统的盐析法提取率提高了32%。'实施例2、超声波辅助盐析法实验(1)超声功率对肝素提取率的影响超声功率分别采取IOOW，150W,200W,250W,300W，350W，400W等7个水平，料液比为1:15，盐浓度为5%，温度为4(TC，超声时间1040min，浸渍时间40min条件下提取，每个试验做3个平行样，按照肝素提取的工艺路线步骤测定，然后测定吸光值，求出平均值，同时用空白溶液做对照。根据所得数据绘制出超声功率和肝素提取率的变化关系曲线图4，功率为300W时肝素提取率最高。(2)超声温度对肝素提取率的影响超声温度分别采取20。C，25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，50°C等7个水平，在超声功率300W，超声时间40min，料液比为1:15，浸渍时间40min条件下提取，按照肝素提取的工艺路线步骤测定，然后测定吸光值，求出平均值，同时用空白溶液做对照，每个试验做3个平行样。根据所得数据绘制出肝素提取率与提取温度的关系曲线图5。从图5可以看出，在所试验的温度范围内，提取温度越高，肝素提取率越高，当温度为4(TC时，肝素提取率最高。(3)超声时间对肝素提取率的影响超声波时间分别选取10min，15min，20min，25min，30min，35min，40min等7个水平，料液比为1:15，在超声功率300W，温度40。C，浸渍时间40min条件下提取，每个试验做3个平行样，按照肝素提取的工艺路线步骤测定，然后测定吸光值，求出平均值，同时用空白溶液做对照。根据所得数据绘制出肝素提取率与超声时间的关系曲线图6，分析肝素提取率随着超声时间的延长的变化规律。超声时间少于40min时，超声波时间越长肝素提取率越高，超声40min时，肝素提取率达到最高。超声时间再延长，肝素提取率开始下降。在单因素的基础上，设计五因素二次旋转回归组合试验优化影响超声波辅助盐析法提取肝素的工艺条件，选取料液比、超声温度、超声功率、盐浓度、超声时间5个因素，作为多因素交叉组合试验的考察因子，分别以A、x2、力、A、xs代表，以肝素提取率为响应值r，试验因素水平及编码表见表。试验因素水平及编码表表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通过二次旋转回归组合试验确定肝素提取率的回归模型方程为Y-30.759722+0.225000X!+1.350000X!2+0.808333X3-1.516667X4-0.300000X5-0.727083X'2+l.300000X1X2+1.187500X2X3+0.448682X'X4-0.025000X2X5+0.435417X22-0.462500X2X3-0.575000X2X4-0.325000X2X5-2.8089583X32-0.287500X3X4+0.448682X3X5-1.464583X42+0.075000X4X5-1.114583X52根据取得的回归方程，优化后的超声波辅助盐析提取肝素的最佳工艺参数为超声温度40'C，超声时间40min，将蛋白酶水解法与超声波辅助盐析法结合使用，提取率达230.81mg/kg，比传统的盐析方法提高40%，比单独的酶法提取量高22.13%,比单独的超声波法提取高11.66%。因此，选择酶水解结合超声波辅助盐析法为提取肝素的最佳方法。实施例3、树脂选取表3是树脂静态吸附效果的比较。在表3中列举了8种大孔径树脂经过静态吸附后，对各自的吸附效果的比较。不同树脂的静态吸附效果表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>D208大孔径强碱性二型阴离子树脂，常用于提取肝素钠，肝素效价及肝素提取率均较高，产品色泽相对较好；D290大孔径苯乙烯一型阴离子树脂，产品色泽尚可，但肝素吸附率低；D254大孔径强碱性季铵型阴离子树脂，常用于提取肝素钠，产品效价及效价回收率均最高，但产品色泽较黄，选择性较差，树脂的机械强度和耐磨性较差，不利于肝素精制；D890大孔径强碱性苯乙烯阴离子树脂，产品效价及效价回收率较低，产品色泽较黄；D201大孔径强碱性阴离子树脂，性能与201*7相似，耐渗透力、耐磨能力强，产品效价及效价回收率较低，产品色泽较黄；D202大孔径二型强碱性阴离子树脂，用于含盐量较高的水和糖液纯化。抗物理磨损和抗化学渗透能力好，产品效价及效价回收率较低，产品色泽较白；D301，D311是两种大孔径弱碱性阴离子树脂，具有高交换容量和机械强度，高抗有机污染能力，质量总交换量也较大，但在强碱条件下树脂的吸附效果不好，肝素的效价和得率较低，产品的色泽黄。综合以上因素，选用D208树脂作为研究对象。树脂预处理方法取一定量的干树脂在蒸馏水中充分浸泡、溶胀后滤干，加等体积乙醇或丙酮搅拌lh，用蒸馏水洗净滤干，力Q4倍量的2mol/L的盐酸搅拌2h，用蒸馏水洗至中性，滤干;加2倍量2mol/L的NaoH溶液搅拌2h，蒸馏水洗至中性，滤干；最后用2倍量2mol/L的盐酸溶液搅拌2h，水洗至中性。(1)温度对肝素吸附量的影响所示树脂吸附肝素的条件设定在NaCL浓度为2M，吸附时间3h，温度设定在2080。C之间研究温度对肝素吸附量的影响。温度直接影响物质在水中的溶解度，因此对肝素吸附量会有比较显著的影响。本试验选择不同的提取温度，随着温度的提高肝素提取率增加显著，温度4(TC时提取率最高，但温度过高肝素提取率明显下降。图7是吸附都树脂吸附肝素量的影响的变化曲线。(2)吸附时间对肝素吸附量的影响树脂吸附肝素的条件设定在温度40'C，盐浓度为2M,吸附时间在17h之间研究吸附时间对肝素吸附量的影响。吸附时间对于肝素的吸附有比较明显的影响。本试验采用不同的吸附时间如图12所示，随着吸附时间的延长，肝素的吸附量增加。图12吸附时间对肝素吸附量的影响。正交试验结果与分析肝素是一种聚阴离子，在碱性条件下利于吸附。故选择pH值8.5，在以上单因素分析的基础上，我们选取温度，溶液盐浓度，吸附时间3个因素考察其对D208树脂吸附肝素的影响。取滤液100mL加入4%(质量百分比)己处理好的湿树脂，放入250mL锥形瓶中，试验按表4所列的因素水平进行正交试验。表5是正交试验结果分析。U(34)正交试验因素水平表表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>回归系数取值及分析结果表7<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>用SAS统计系统对D208大孔径阴离子树脂吸附分离肝素实验数据进行分析，对回归方程的各项进行了方差分析，方程的相关系数R2=0.9876，方程的模型在0.05水平显著。最佳提取条件温度40。C，吸附时间3h，盐浓度2%。为了进一步验证结论的准确性，进行了验证试验，在最佳提取工艺下，粗品肝素的效价达到150U/mg。实施例4、纯化(1)S印hadexG50分离肝素的结果将粗品肝素的组分用S印hadexG50凝胶层析分离，其结果见图9。S印hadexG50分离条件层析柱3.6*85cm，洗脱液O.2mol/LNMC03溶液，洗脱速度5ml/L，UV检测波长:216nm.结果显示粗品肝素组分分离后可获得一大一小两个主要的的洗脱峰，肝素组分需要进一步的分离，样品才能获得较好的分离效果。(2)QFFSpharose分离肝素的结果经过凝胶分离后的肝素组分已经得到了Mr分布范围很小的组分，再经过QFFS印harose(90um，2.0*25cm)强阴离子交换柱层析分离。QFFSpharose分离结果如图10，经过S印hadexG50柱层析后的肝素再用QFFSpharose进一步纯化，可得到单一的肝素峰，证明肝素经过纯化后为均一组分。图9S印hadexG-50分离肝素图谱。图10QFFs印harose离子交换层析分离肝素图谱。电泳分析结果肝素PAGE电泳结果见图11。SDS-PAGE电泳结果如图11所示。D208树脂分离后得到的粗品肝素中仍含有少量的杂蛋白和核酸以及硫酸软骨素等杂质，而经过S印hadexG50凝胶层析和QFFs印harose离子交换层析后的肝素为均一组分，基本上去除了蛋白质等杂质，电泳显示为单一的条带，其分子质量在15000Da左右，与标准品的分子质量相同，说明纯化后的肝素成分比较均一。从电泳图可以看出柱层析纯化前的肝素的电泳条15带是连续的多个条带，而经过纯化后的肝素电泳条带是窄而清晰的条带，说明肝素经过纯化后是均一的组分，主要成分是肝素寡糖。紫外分析结果图12、13分别是柱层析前后的肝素的紫外光谱图。图12显示肝素寡糖组分在280nm和260nm附近有明显的吸收峰，说明肝素寡糖经过S印hadexG50分离后仍含有蛋白质和核酸杂质；图13显示肝素组分在280nm和260nm附近都没有明显的吸收峰，说明QFFS印harose离子交换色谱分离后的肝素产品中不含蛋白质和核酸，是均一组分的肝素。红外光谱分析结果图14和图15分别为柱层析纯化前和纯化后的肝素的红外谱图。如图所示，二谱图的吸收位置是一致的，在860cm—'和940cm—、处出现肝素的特征吸收峰，其他吸收峰的归属见表8。这说明肝素原料经过柱层析后得到的肝素的基本结构均没有发生变化。纯化前后的肝素相比，大部分吸收峰的位置没有发生变化，但图14中杂峰较多，说明在柱层析之前粗品肝素中含有一定量的杂质，经过柱层析分离后得到的肝素纯度较高。从红外光谱图14和15可以看出，在两个谱图中在3373cm—i和1425cm—'都有特征峰存在，3373cm—'为羟基的伸縮振动，1425cm—1:为羟基的面内弯曲振动，二者呈宽强峰状态，是羟基存在的信号。621cm—'和586cm—i为羟基的面外弯曲振动峰，二者的存在证明了证明了肝素组分中羟基的存在。1670cm—'为酰胺羰基伸縮振动，1620cm—1为羧基的羰基伸縮振动，二者的存在证明了肝素组分中羰基的存在。表8是肝素寡糖的红外光谱分析结果。从表中可以看出肝素寡糖出峰位置、基团种类和吸收峰类型。肝素寡糖的红外结果表表8吸收峰类型基团寡糖峰位-OH,-NH3373(s)rc-h-C-H-2921(w)yc=o-CO-NH(双建)1670(m)-C021620(s)■yc-o-co-o-(双键)1237(s)yc-o-c-o-1043(s)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>HPLC分析结果(1)标准品混合物图谱标准双糖混合物的HPLC图谱见图16。表9是标准双糖混合物HPLC图谱的分析结果。根据表中标准双糖的出峰次序和保留时间可以分析出代表的双糖片段。标准双糖混合物的出峰时间表9<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(2)肝素寡糖双糖分析结果纯化后的肝素样品用肝素酶降解后得到的产物双糖分析的结果见图17和表10。从图17中可以看出肝素样品的HPLC图谱的主要的出峰位置和保留时间与标准双糖样样品的出峰位置一致，说明检测的经过亚硝酸降解的肝素样品中是均一的肝素组分，不含有其他杂质。而且肝素的双糖组成与标准品一致，说明肝素的结构与标准品相同。肝素样品的双糖分析结果如表io所示。肝素双糖分析结果表10<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>图17和表10显示肝素双糖分析结果显示，肝素主要组成双糖为a-4UA-[1-4]-GlcN(65.4%)与a-QUA-[1-4]-GlcNAc(13.9%)，a-4UA一[卜4]-GlcNS-6S含量较少，硫酸基团的含量少。本试验采用S印hadexG50凝胶柱层析和QFFS印harose强阴离子交换柱层析纯化粗品肝素，肝素的效价从135U/mg提高的纯化后的150U/mg。将纯化后的肝素用紫外光谱、红外光谱、PAGE电泳、HPLC进行检测。紫外光谱扫描的结果显示，纯化后的样品在260nm和280mn没有吸收峰；肝素的红外光谱测定结果显示，肝素结构中含有羟基、羧基、酰胺键；HPLC双糖分析结果显示，纯化后的肝素样品的主要的出峰位置和保留时间与肝素标准品双糖混合物的出峰位置一致肝素主要组成双糖为a-4UA-[1-4]-GlcN(65.4%)与a-QUA-[1-4]-GlcNAc(13.9%);PAGE电泳色谱图中可以看出，肝素样品的分子量范围很大，纯化后的肝素电泳条带是窄而清晰的条带。根据以上的鉴定结果可以看出，纯化后的肝素中不含有蛋白质核酸等杂质；肝素的结构在纯化前后没有变化；肝素的分子量从3000到30000Da都有分布；肝素经过纯化后是纯的均一的组分。本发明中的超声波药品处理机是由济宁金百特电子有限公司制造的，型号为JBT。权利要求1、一种肝素的提取、分离、纯化方法，其特征在于按如下步骤进行蛋白酶水解法提取肝素、超声波辅助盐析法、树脂吸附分离肝素及肝素的纯化。2、根据权利要求1所述的肝素的提取、分离、纯化方法，其特征在于蛋白酶水解法、超声波辅助盐析法提取肝素及树脂吸附分离肝素包括下列步骤(1)酶解、盐解及过滤将匀浆后的猪小肠粘膜移入提取锅，需要加l:15倍重量的水，用Na0H调pH至8.5，55"C加热半小时，加入猪小肠粘膜质量2%的胰蛋白酶反应2小时，加入混合液质量5%的NaCL在6(TC反应2小时，之后将上述混合液加入到超声波药品处理机内，超声温度为40。C，超声时间为40min，超声功率为300W，超声处理之后用300目的滤布过滤；(2)吸附将上述滤液移入吸附罐中，在液体温度为4(TC的条件下，按原来猪小肠粘膜质量的8%加入树脂，搅拌吸附3小时；(3)清洗把(2)中的树脂倒入不锈钢桶中，用1.2mol/L的NaCL浸泡洗涤30min;(4)洗脱把(3)中的树脂移入桶中用5mol/L的NaCL浸泡3小时，要不时轻轻搅动，促使肝素解析；(5)酸处理将洗脱液用HCL调pH值至3.5处理30min;(6)碱处理将(5)得到的洗脱液用NaOH调pH至10处理3h;(7)乙醇沉淀将(6)中所得的洗脱液用1.5倍体积的95%酒精处理12h，搅拌静置，虹吸出上层清液；(8)干燥把下层沉淀取出滤干，在60。C下真空干燥，得到肝素粗品。3、根据权利要求1所述的肝素的提取、分离、纯化方法，其特征在于肝素的纯化包括下列步骤(1)S印hadexG50凝胶柱层析分离肝素①溶胶用烧杯取2gS印hadexG50凝胶，用缓冲液在IO(TC水浴中加热凝胶13h，然后采用倾泄法倾去上层小颗粒的浮胶，将溶好的凝胶与过滤后的去离子水按3:1(W/V)进行混合，柱子中应先装入35mm缓冲液并关闭出水口；②装柱将①中溶好的凝胶与去离子水的混合液用玻璃棒搅拌均匀后引流灌入3.6*85cm的柱子中，让凝胶自然沉积，打开出水口，待凝胶自然沉积完毕后，关闭出水口；③平衡灌好的柱子胶面上用缓冲液加满直至进样口，并确保没有气泡进入，然后进行平衡25柱床体积；上样将肝素样品500mg用10mL缓冲液溶解后，用0.45um微孔滤膜过滤，等缓冲液液面距离胶面2mra左右时将过滤后的肝素溶液延柱壁缓慢加入，上样的流速2mL/min，上样体积为1.5mL;⑤洗脱样液进入胶床后与胶床基本平齐时用0.2mol/LNH4HC03为流动相洗脱样品，流速为5mL/min，用咔唑法检测，收集不同的洗脱峰，获得Mr不同的肝素分离组分；⑥收集将各次分离的相同洗脱峰样品合并，用旋转蒸发仪浓縮后，冻干，选择经过S印hadexG50第一次分离、冻干样品用0.2mol/L的NH4HC03溶解，上样流速为2mL/min;用Superdex30凝胶层析柱进行第二次分离，用0.2mol/LNH4HC03为流动相洗脱样品，流速为5mL/min，用咔唑法检测，再收集不同的分离组分，浓縮、冻干，得到不同Mr的寡糖片段；(2)QFFSpharose离子交换色谱分离肝素①装柱将SPS印haroseFF凝胶填料用玻璃棒搅拌均匀后缓慢倒入玻璃柱内，使凝胶自然沉积，待胶面平整后进行洗柱；②洗柱用蒸馏水清洗凝胶柱约lh，直至pH为中性，流速为2.0mL/min进行压柱；③平衡用0,2Mol/L的NaCl溶液即A液来平衡柱子，直到pH为中性；④进样将经过QFFS印harose凝胶柱层析分离系统分离后所获得的Mr分布范围小即分子量3000-20000Da的组分20mg溶解于10mL蒸馏水中，用0.45um微孔滤膜过滤，上QFFS印harose(90um，2.0氺25cm)强阴离子交换柱，以1.0mL/min流度，进样量为1.5mL，其上样方法与凝胶层析的方法一样；⑤洗杂用A液继续洗脱，流速为1.0mL/min，当用平衡缓冲液洗脱至基线时，洗脱停止，这主要是洗脱掉不能吸附的色素及一些杂蛋白等物质，这时检测紫外波长在280mn的吸光值，每2mL为一管收集洗脱液并检测有无肝素；⑥洗脱采用梯度洗脱法将事先配好的2mol/L的NaCl溶液装入恒流泵的B液瓶中，等A液瓶中的洗脱液即A液低于B液时并且已经洗脱至基线时，将恒流泵中A、B液中间的阀门打开，使A、B混合，并流入层析柱中进行洗脱；流速为5.OmL/min，在216nm波长处检测，QFFSpharose离子交换色谱分离肝素条件为用水和2mol/L的NacL为流动相进行梯度洗脱，流速为5.0mL/min，在216nm波长处检测；⑦收集在紫外216nm处在线检测洗脱液，分别收集各阶段洗脱峰，旋转蒸发仪浓縮，冻干，可获得不同肝素分离产物。4、根据权利要求3所述的肝素的提取、分离、纯化方法，其特征在于缓冲液为去离子水。全文摘要本发明涉及一种肝素的提取、分离、纯化方法。该方法包括蛋白酶水解法提取肝素、超声波辅助盐析法提取肝素、离子交换树脂吸附分离肝素及肝素的纯化。该方法所得到的肝素具有以下特点(1)提取率可达230.81mg/kg，比传统方法提高40％；(2)肝素的效价提高为150U/mg。文档编号C08B37/00GK101597344SQ20091007197公开日2009年12月9日申请日期2009年5月7日优先权日2009年5月7日发明者宋大巍,张丽萍,曹荣安,李良玉,李雷刚,楠杨申请人:张丽萍