专利名称：：灵芝活性多糖的低温提取技术的制作方法
技术领域：
：本发明属于灵芝中活性物质的提取技术，更具体涉及一种灵芝活性多糖的低温提取技术。
背景技术：
：灵芝多糖是灵芝中除蛋白质和三萜类外研究最深入最广泛的一类化合物。20世纪70年代对灵芝多糖的研究主要集中在多糖和多糖复合物组分的分离、制备和药理作用方面，到80年代和90年代则主要集中在灵芝多糖及多糖复合物的结构及其与功能的关系方面。国内外已从灵芝中分离到200多个多糖体，有4种具有强烈抗肿瘤活性的多糖都是肽多糖。据研究，灵芝多糖结构中含有较多的糖苷键，可能是使其具有强烈药理活性的原因。灵芝多糖类化合物是灵芝所含重要生理活性成分，深受医药科技工作者的重视，灵芝多糖可抑制肿瘤细胞的无限、快速分裂能力，目前，灵芝多糖已被用作治疗肿瘤的药物之一。现已证明灵芝多糖还具有提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，降血糖作用、降血脂作用、抗放射和抗衰老作用。进入21世纪以来，"人类在回归大自然"的思潮影响下，人们更加青睐天然药物，其中多糖成分由于对人体的良好作用，更加引起科学家的关注。现代科学研究表明多糖广泛存在于动物细胞膜、高等植物和微生物细胞壁中，上生命有机体不可缺少的组织部分，并具有一系列不同的生理功能。其中真菌多糖因其独特的生物活性而引起人们的广泛关注。自1958年，Brander报道了酵母细胞壁多糖(Zymosan)具有抗肿瘤作用以来，人们对真菌多糖产生了浓厚的兴趣，并对真菌多糖的化学结构和生物活性进行了深入仔细的研究，已经取得了丰硕的成果。近20年来，已有大量关于真菌多糖生物活性的研究报道，主要集中在抗肿瘤、免疫调节、抗突变、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化、抗辐射和抗溃疡等多方面，特别是其免疫促进及免疫调节作用。目前对于灵芝中活性成分的提取方法多种多样，如传统的水提取法，有机溶剂的提取法，及其现有较常用的索氏、超声波、微波、酶解等等提取方法，但是由于方法的单一和各自条件的限制，存在使灵芝中活性成分，特别是灵芝多糖的提取率和纯度不高，提取成本高等问题。发明目的本发明的目的是提供一种灵芝活性多糖的低温提取技术，解决现有技术中灵芝多糖的提取率和纯度不高，提取成本高等问题；本发明的方法以多个提取分离步骤相结合，并在特定的温度条件下，使灵芝多糖的提取率得到很大的提高，特别是产品中的多糖含量得到显著的提高，并保持多糖的活性，明显提升产品的品质，成本低廉，具有显著的经济价值。本发明的灵芝活性多糖的低温提取方法将灵芝在低温条件下进行水提取、有机溶剂提取后进行酶解、浓縮、超滤后低温活化处理后进行冷冻干燥，得到所述的灵芝活性多糖产品。本发明的显著优点即关键技术是活性成分的提取和活性的保留(1)低温提取确保多糖空间结构不被破坏活性多糖药效活性依赖于其空间三螺旋结构的完整，后者主要由氢键维持。氢键的结合力较小，在高温下容易破坏，而灵芝活性多糖的整个流程的提取、浓縮、活化、冻融等程序都是在低温(45-70°C)条件下进行，可以减少传统高温(IO(TC)提取方法对多糖空结构与活性造成的破坏。(2)多层次分离确保产品富含中，小分子多糖本发明精选优质原料进行超细度粉碎，并在特定条件下经过多层生化分离提取，如此使得产品中小分子活性多糖含量达大大提高。(3)低温活化确保多糖结构的稳定本发明提取物液体经过缓慢降温，使系统中的熵(Endropy)逐步下降，给有效成分恢复原始状态留出充裕的时间和空间，待到有效成分复原后，再降温、冷冻，使系统的熵逐步从0.3下降到0.02，以稳定有效成分的结构、从而保护有效成分的活力。药理试验证明，产品的药理活性可比常规方法大幅提高3-5倍。图1是本发明的灵芝活性多糖的低温提取工艺流程图。具体实施例方式具体步骤包括(1)采用灵芝子实体，切片破碎；(2)在60-8(TC热水温度下，用翻动热水提取3小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用热水翻动提取3小时，提取次数为2次，所述热水与灵芝的用量比为热水为灵芝的10倍(W/W)(即每lkg的灵芝用10kg重量的热水)(3)将步骤(2)提取液过滤后，滤液备用，滤渣用重量浓度为80%的乙醇，在60-8(TC温度下，发动提取2小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用滤渣用重量浓度为80%的乙醇翻动提取2小时，提取次数为2次，所述乙醇与灵芝的用量比为1:6-8倍(W/W)(即每lkg的灵芝用6-8kg重量的乙醇)(4)将步骤(3)提取液过滤后，滤液备用，滤渣加入6-8倍(滤渣重量的6-8倍)的去离子水，浸泡0.5小时后，升温至90°C，再浸泡1小时，使滤渣组织膨胀；(5)将步骤(4)组织膨胀后的滤渣降温至45t:-501:，按照先后顺序加入纤维酶反应0.5小时后再加入木聚糖酶反应1小时；所述纤维素酶的用量浓度为30-40ppm，即3-4g/100Kg，酶活力CMC为60000U/g;pH5.0;温度50-60°C;所述木聚糖酶的用量浓度为20-30卯m，即2-3g/100Kg，酶活力CMC为2000万-3000万，pH5.O，温度50_60°C;(6)酶反应结束后，升温至10(TC，保持l-5分钟进行灭酶处理；加入物料10倍(滤渣重的10倍)的水，浸泡2小时；100目过滤；得到的滤液与步骤(2)和步骤(3)的滤液合并后浓縮至热侧比l:1.04(是指浓縮滤液至在20-3(TC的相对密度为1.04)，静置沉淀12小时；分离上清液和沉淀并在2小时内降温至Ot:，沉淀备用；(7)将步骤(6)的上清液超滤后将超滤液在45-60分钟内快速降温至-l(TC，保持1小时后自然恢复至常温，使超滤液复原；(8)将步骤(7)复原后的超滤液进行冷冻干燥后得到灵芝活性多糖浸膏或粉产PRo其中，步骤(1)的灵芝子实体切片可以破碎至粒径为0.3cm-0.5cm。步骤(2)的水最佳的提取温度为70°C;所述步骤(3)的乙醇最佳的提取温度为70°C。步骤(6)降温至Ot:备用的沉淀还可以再加入到步骤(3)乙醇提取过滤后爱的滤渣中进行后续工序。步骤(6)上清液超滤采用的超滤膜(UF)种类为三醋酸纤维素超滤膜(具有亲水性强，膜截留盐的能力强，透过速度快)，所述超滤膜的截留分子量(丽CO)10000-50000，近似孔径5-12nm。选用作为膜材料超滤膜使用条件温度<30°C，pH4-6。冷冻干燥的条件为时间约12小时、温度前4小时为-8至-1(TC、后8小时常温20-30。C、压力为常压。根据福建省宁德市产品质量检验所对本发明的产品中各成分的含量检验结果如下表中<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>灰分，％^o以下是本发明的几个实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1(1)采用灵芝子实体，切片破碎；(2)在6(TC热水温度下，用翻动热水提取3小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用热水翻动提取3小时，提取次数为2次，所述热水与灵芝的用量比为热水为灵芝的10倍(W/W)(即每lkg的灵芝用10kg重量的热水)(3)将步骤(2)提取液过滤后，滤液备用，滤渣用重量浓度为80%的乙醇，在60°C温度下，发动提取2小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用滤渣用重量浓度为80%的乙醇翻动提取2小时，提取次数为2次，所述乙醇与灵芝的用量比为1:6倍(W/W)(即每lkg的灵芝用6kg重量的乙醇)(4)将步骤(3)提取液过滤后，滤液备用，滤渣加入6倍(滤渣重量的6倍)的去离子水，浸泡0.5小时后，升温至90°C，再浸泡1小时，使滤渣组织膨胀；(5)将步骤(4)组织膨胀后的滤渣降温至45t:，按照先后顺序加入纤维酶反应0.5小时后再加入木聚糖酶反应1小时；所述纤维素酶的用量浓度为30ppm，即3g/100Kg，酶活力CMC为60000U/g;pH5.0;温度50°C;所述木聚糖酶的用量浓度为20卯m，即2g/腿g，酶活力CMC为2000万，pH5.O，温度50°C;(6)酶反应结束后，升温至IO(TC，保持1分钟进行灭酶处理；加入物料10倍(滤渣重的IO倍)的水，浸泡2小时；100目过滤；得到的滤液与步骤(2)和步骤(3)的滤液合并后浓縮至热侧比1:1.04(是指浓縮滤液至在203(TC的相对密度为1.04)，静置沉淀12小时；分离上清液和沉淀并在2小时内降温至Ot:，沉淀备用；(7)将步骤(6)的上清液超滤后将超滤液在45分钟内快速降温至-l(TC，保持1小时后自然恢复至常温，使超滤液复原；(8)将步骤(7)复原后的超滤液进行冷冻干燥后得到灵芝活性多糖浸膏或粉产PIPRo其中，步骤(1)的灵芝子实体切片可以破碎至粒径为0.3cm。步骤(6)降温至ot:备用的沉淀还可以再加入到步骤(3)乙醇提取过滤后爱的滤渣中进行后续工序。步骤(6)上清液超滤采用的超滤膜(UF)种类为三醋酸纤维素超滤膜(具有亲水性强，膜截留盐的能力强，透过速度快)，所述超滤膜的截留分子量(丽CO)10000。选用作为膜材料超滤膜使用条件温度<30°C，pH4。冷冻干燥的条件为时间约12小时、温度前4小时为-8t:、后8小时常温2(TC、压力为常压。实施例2(1)采用灵芝子实体，切片破碎；(2)在8(TC热水温度下，用翻动热水提取3小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用热水翻动提取3小时，提取次数为2次，所述热水与灵芝的用量比为热水为灵芝的10倍(W/W)(即每lkg的灵芝用10kg重量的热水)(3)将步骤(2)提取液过滤后，滤液备用，滤渣用重量浓度为80%的乙醇，在80°C温度下，发动提取2小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用滤渣用重量浓度为80%的乙醇翻动提取2小时，提取次数为2次，所述乙醇与灵芝的用量比为1:8倍(W/W)(即每lkg的灵芝用8kg重量的乙醇)(4)将步骤(3)提取液过滤后，滤液备用，滤渣加入8倍(滤渣重量的8倍)的去离子水，浸泡0.5小时后，升温至90°C，再浸泡1小时，使滤渣组织膨胀；(5)将步骤(4)组织膨胀后的滤渣降温至5(TC，按照先后顺序加入纤维酶反应0.5小时后再加入木聚糖酶反应1小时；所述纤维素酶的用量浓度为40ppm，即4g/100Kg，酶活力CMC为60000U/g;pH5.0;温度60°C;所述木聚糖酶的用量浓度为30卯m，即3g/腿g，酶活力CMC为3000万，pH5.O，温度60°C;(6)酶反应结束后，升温至IO(TC，保持5分钟进行灭酶处理；加入物料10倍(滤渣重的10倍)的水，浸泡2小时；100目过滤；得到的滤液与步骤(2)和步骤(3)的滤液合并后浓縮至热侧比1:1.04(是指浓縮滤液至在203(TC的相对密度为1.04)，静置沉淀12小时；分离上清液和沉淀并在2小时内降温至Ot:，沉淀备用；(7)将步骤(6)的上清液超滤后将超滤液在60分钟内快速降温至-l(TC，保持1小时后自然恢复至常温，使超滤液复原；(8)将步骤(7)复原后的超滤液进行冷冻干燥后得到灵芝活性多糖浸膏或粉产PIPRo其中，步骤(1)的灵芝子实体切片可以破碎至粒径为0.5cm。步骤(6)降温至Ot:备用的沉淀还可以再加入到步骤(3)乙醇提取过滤后爱的滤渣中进行后续工序。步骤(6)上清液超滤采用的超滤膜(UF)种类为三醋酸纤维素超滤膜(具有亲水性强，膜截留盐的能力强，透过速度快)，所述超滤膜的截留分子量(丽CO)30000。选用作为膜材料超滤膜使用条件温度<30°C，pH4-6。冷冻干燥的条件为时间约12小时、温度前4小时为-1(TC、后8小时常温30°C、压力为常压。实施例3(1)采用灵芝子实体，切片破碎；(2)在7(TC热水温度下，用翻动热水提取3小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用热水翻动提取3小时，提取次数为2次，所述热水与灵芝的用量比为热水为灵芝的10倍(W/W)(即每1kg的灵芝用10kg重量的热水)(3)将步骤(2)提取液过滤后，滤液备用，滤渣用重量浓度为80%的乙醇，在70°C温度下，发动提取2小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用滤渣用重量浓度为80%的乙醇翻动提取2小时，提取次数为2次，所述乙醇与灵芝的用量比为1:7倍(W/W)(即每1kg的灵芝用7kg重量的乙醇)(4)将步骤(3)提取液过滤后，滤液备用，滤渣加入7倍(滤渣重量的7倍)的去离子水，浸泡0.5小时后，升温至90°C，再浸泡1小时，使滤渣组织膨胀；(5)将步骤(4)组织膨胀后的滤渣降温至45t:-501:，按照先后顺序加入纤维酶反应0.5小时后再加入木聚糖酶反应1小时；所述纤维素酶的用量浓度为35ppm，即3.5g/100Kg，酶活力CMC为60000U/g;pH5.0;温度55°C;所述木聚糖酶的用量浓度为25卯m，即2.5g/100Kg，酶活力CMC为2500万，pH5.O，温度55°C;(6)酶反应结束后，升温至IO(TC，保持1-5分钟进行灭酶处理；加入物料10倍(滤渣重的10倍)的水，浸泡2小时；100目过滤；得到的滤液与步骤(2)和步骤(3)的滤液合并后浓縮至热侧比1:1.04(是指浓縮滤液至在203(TC的相对密度为1.04)，静置沉淀12小时；分离上清液和沉淀并在2小时内降温至Ot:，沉淀备用；(7)将步骤(6)的上清液超滤后将超滤液在50分钟内快速降温至-l(TC，保持1小时后自然恢复至常温，使超滤液复原；(8)将步骤(7)复原后的超滤液进行冷冻干燥后得到灵芝活性多糖浸膏或粉产PIPRo其中，步骤(1)的灵芝子实体切片可以破碎至粒径为0.4cm。步骤(6)降温至Ot:备用的沉淀还可以再加入到步骤(3)乙醇提取过滤后爱的滤渣中进行后续工序。步骤(6)上清液超滤采用的超滤膜(UF)种类为三醋酸纤维素超滤膜(具有亲水性强，膜截留盐的能力强，透过速度快)，所述超滤膜的截留分子量(丽CO)50000。选用作为膜材料超滤膜使用条件温度<30°C，pH4-6。0.001-0.002um或1000-300，OOODalton，冷冻干燥的条件为时间约12小时、温度前4小时为-9t:、后8小时常温25。C、压力为常压。效果试验在60、65、70、80、10(TC五个温度段条件下灵芝活性多糖的提取试验(按照步骤(2)和步骤(3)的提取温度为60、65、70、80、10(TC，其余步骤按照以上具体实施方式中进行)。进行10批次的试验，试验结束，记录如下70度4.9434.7920105]80度5.9814.2470106]100度7.3513.8230107]试验60108]温度灵芝多糖灵芝活性多糖0109]60度2.1012.0590110]65度3.1553.1080111]70度5.0294.8780112]80度6.0644.3050113]100度7.3863.8410114]试验70115]温度灵芝多糖灵芝活性多糖0116]60度1.8431.8060117]65度2.9222.8910118]70度4.7794.6360119]80度5.8044.1210120]100度7.1573.7220121]试验80122]温度灵芝多糖灵芝活性多糖0123]60度1.8091.7730124]65度2.8712.7630125]70度4.8694.7280126]80度5.8244.1350127]100度7.1673.7270128]试验90129]温度灵芝多糖灵芝活性多糖0130]60度2.0652.0230131]65度3.9663.1320132]70度5.1094.9080133]80度6.0844.3200134]100度7.3013.7970135]试验100136]温度灵芝多糖灵芝活性多糖0137]60度1.8911.8510138]65度2.9512.9040139]70度4.9894.7480140]80度5.7424.0770141]100度7.4273.8620142]以上结果表明，在70度下灵芝有效活性1.912%，65度为2.935%，80度为4.157%，而100度为3.751%。对在70度和100度条件提取的灵芝活性多糖进行对比，在70度条件下可以得到更多的中小分子活性灵芝多糖。根据试验初步结果，重点进行7(TC和IO(TC(按照步骤(2)和步骤(3)的提取温度为70和IO(TC，其余步骤按照以上具体实施方式中进行)的试验3批次进行进一步验证，该结果是正确的。试验记录如下灵芝多糖灵芝活性多糖4.6654.5157.7434.036灵芝多糖灵芝活性多糖4.9044.7667.1893.758灵芝多糖灵芝有效活性多糖5.1234.9396.8963.536温度70度100度温度70度100度温度70度100度三次统计数温度70度100度灵芝多糖灵芝有效活性多糖4.8974.7607.2763.777得到在70度条件下提取的有效灵芝活性多糖。根据试验结果标明，重点进行70度和100度的试验3批次进行进一步验证，在70度条件提取的有效活性灵芝多糖比100度下要多4.760%比3.777%。虽然灵芝多糖4.897%比7.276%得率低，但在70度下不可溶性多糖为3%;在100度下不可溶性多糖高达48%，因此本发明步骤(2)和步骤(3)的优选的提取温度为70°C。通过再此验证，在7(TC条件提取的有效活性灵芝多糖比100度条件下要多。权利要求一种灵芝活性多糖的低温提取方法，其特征在于将灵芝在低温条件下进行水提取、有机溶剂提取后进行酶解、浓缩、超滤后低温活化处理后进行冷冻干燥，得到所述的灵芝活性多糖产品。2.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的低温提取方法，其特征在于为低温三重提取，所述方法的具体步骤包括(1)采用灵芝子实体，切片破碎；(2)在60-8(TC热水温度下，用翻动热水提取3小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用热水翻动提取3小时，提取次数为2次，所述热水与灵芝的用量比为热水为灵芝的10倍(W/V)，即每lkg的灵芝用10kg重量的热水；(3)将步骤(2)提取液过滤后，滤液备用，滤渣用重量浓度为80^的乙醇，在60-8(TC温度下，翻动提取2小时，每次提取完后过滤，滤液备用；滤渣继续用用重量浓度为80%的乙醇翻动提取2小时，提取次数为2次，所述乙醇与灵芝的用量比为1:6-8倍(w/w)，即每lkg的灵芝用6-8kg重量的乙醇；(4)将步骤(3)提取液过滤后，滤液备用，滤渣加入6-8倍(w/w)的去离子水，浸泡0.5小时后，升温至9(TC，再浸泡1小时，使滤渣组织膨胀；(5)将步骤(4)组织膨胀后的滤渣降温至45t:-501:，按照先后顺序加入纤维酶反应0.5小时后再加入木聚糖酶反应1小时；所述纤维素酶的用量浓度为30-40ppm，即3-4g/100Kg，酶活力CMC为60000U/g;pH5.0;温度50-60°C;所述木聚糖酶的用量浓度为20-30ppm，即2-3g/100Kg，酶活力CMC为2000万-3000万，pH5.O，温度50_60°C;(6)酶反应结束后，升温至IO(TC，保持1-5分钟进行灭酶处理；加入物料10倍(w/V)的水，浸泡2小时；100目过滤；得到的滤液与步骤(2)和步骤(3)的滤液合并后浓縮至热侧比1:1.04，即浓縮到滤液在20-30°C的相对密度为1.04，静置沉淀12小时；分离上清液和沉淀并在2小时内降温至ot:，沉淀备用；(7)将步骤(6)的上清液超滤后将超滤液在45-60分钟内快速降温至-l(TC，保持1小时后自然恢复至常温，使超滤液复原；(8)将步骤(7)复原后的超滤液进行冷冻干燥后得到灵芝活性多糖浸膏或粉产品。3.根据权利要求2所述的灵芝活性多糖的低温提取方法，其特征在于所述步骤(1)的灵芝子实体切片破碎至粒径为0.3cm-0.5cm。4.根据权利要求2所述的灵芝活性多糖的低温提取方法，其特征在于所述步骤(2)的水提取温度为70°C;所述步骤(3)的乙醇提取温度为70°C。5.根据权利要求2所述的灵芝活性多糖的低温提取方法，其特征在于所述步骤(6)降温至ot:备用的沉淀再加入到步骤(3)乙醇提取过滤后爱的滤渣中进行后续工序。6.根据权利要求2所述的灵芝活性多糖的低温提取方法，其特征在于所述步骤(6)上清液超滤采用的超滤膜为三醋酸纤维素超滤膜，所述超滤膜的截留分子量为10000-50000;超滤膜使用条件温度<30°C，pH4-6。7.根据权利要求2所述的灵芝活性多糖的低温提取方法，其特征在于所述冷冻干燥的条件为总时间12小时，温度前4小时为-8至-l(TC，后8小时常温20-3(TC、压力为常压。全文摘要本发明提供一种灵芝活性多糖的低温提取技术，属于灵芝中活性物质提取
技术领域：
，解决现有技术中灵芝多糖的提取率和纯度不高，提取成本高等问题；本发明将灵芝在低温条件下进行水提取、有机溶剂提取后进行酶解、浓缩、超滤后低温活化处理后进行冷冻干燥，得到所述的灵芝活性多糖产品。本发明的方法以多个提取分离步骤相结合，并在特定的温度条件下，使灵芝多糖的提取率得到很大的提高，特别是产品中的多糖含量得到显著的提高，并保持多糖的活性，明显提升产品的品质，成本低廉，具有显著的经济价值。文档编号C08B37/00GK101701041SQ20091031077公开日2010年5月5日申请日期2009年12月2日优先权日2009年12月2日发明者唐文波,王忠,郭耀荣,高益槐申请人:安发(福建)生物科技有限公司