一种动物细胞培养用微载体及其交联方法

文档序号:3656249阅读:330来源:国知局
专利名称:一种动物细胞培养用微载体及其交联方法
技术领域
本发明涉及动物细胞培养用微载体,更具体地说是涉及一种无动物来源成分的含 精氨酸配基的微载体以及精氨酸配基与基质的交联方法,属于生化工程和细胞工程领域,
背景技术
微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术,已广泛 用于生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体以及具有特殊功能的效应 细胞等,已成为医药生物高技术产业的关键技术。动物细胞培养常常需要贴壁生长,在悬浮状态下细胞生长缓慢,停止,甚至死亡。 微载体培养其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中,作为载 体,使贴壁细胞在微载体表面附着生长,同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。它 将细胞的贴壁培养变为悬浮培养,这样可以大大增加细胞生长的表面积以提高细胞的生长 密度。细胞贴壁主要是靠静电引力和范德华力,取决于细胞与微载体表面理化性质和微载 体接触概率有关。微载体其工作原理即是在经过共价交联的载体微球(主要提供固相吸 附表面)上引入电荷,使细胞以其表面所带的性质相反的电荷互相吸引以达到贴壁目的。 而一般细胞在进入生理PH值时,表面带负电荷。若微载体带正电荷,则利用静电引力可加 快细胞贴壁速度。目前市场上常用的微载体有两类,它们都是带有不同基团的葡聚糖交联 而成的大分子,一类是以带正电荷的化合物二乙基氨基乙基(DEAE)作为配基,用于一般的 动物细胞培养,如GE的Cytodex 1 ;另一类微载体用变性的动物明胶——猪胶原蛋白(Pig collagen)作为配基,通过共价交联在葡聚糖微球表面形成一层明胶膜,为细胞的贴壁生长 提供附着,从而增加细胞附着和增殖。商品化的第二类微载体有GE的Cytodex 3。Cytodex 3常被选用作体外贴壁培养困难的细胞的微载体。特别是对上皮形态细胞的贴壁培养,更有 其独特的优点。其他细胞如肝细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成肌细胞等,也用这种微载体进 行过常规培养。利用猪胶原蛋白生产微载体,是将葡聚糖微球先用环氧氯丙烷 (Epichlorohydrin, ECH)活化,然后在碱性条件下将经过变性的猪胶原蛋白交联于葡聚糖 表面(图1)。但因这种微载体含有猪胶原蛋白,当用于生物制品的产业化过程会遇到很多 的困难并增加很多工作量。首先,添加动物来源成分,会给生物制品下游纯化增加负担,并 且会在最终产品中存在残留;注入健康人体会产生严重的副反应;另外,添加动物来源成 分会增加生物制品外源性病毒的风险。因此,对细胞大规模培养原辅材料的质量控制,除了 对其支持细胞增殖能力的控制之外,还应考虑是否含有动物来源成分从而引起的安全性问 题。目前已有的微载体大多以动物胶原及其衍生物作为包被材料,但随着对生物制品 安全性和质量要求的不断提高和行业对药品生产GMP要求的不断完善,在生产过程中添加 含动物源性材料一直是各国的监管机构在生物安全性方面监管时高度关注的一项内容。使 用不含有任何动物来源成分的原辅材料进行疫苗等生物制品的生产,必然会成为生物制药领域的发展趋势。为克服因应用含动物来源成分的微载体于细胞大规模培养过程中而带来引入病 毒的风险以及由此引起的产品申报和监管困难,市场上迫切需要一种不含动物胶原等动物 源性材料作配基的新型微载体,以建立在整个生产过程中无动物来源成分的细胞培养系统 和方案
发明内容
目前已有的动物细胞培养用微载体大多以动物胶原及其衍生物作为包被材料,本 发明的目的是提供一种无动物来源成分的含精氨酸配基的微载体。本发明的另一个目的是提供这种微载体精氨酸配基与葡聚糖基质的交联方法。为实现上述目的,本发明使用以下技术方案本发明利用精氨酸(Arginine)或全人工合成的多聚精氨酸(Poly-Arginine)作 为配基,用烯丙基甘油醚作为交联活化剂将之交联于葡聚糖珠表面而合成的一种无动物来 源成分的微载体。由精氨酸聚合而成的多肽链,具有和动物明胶相似的性质,为细胞提供一 个具有多聚正电荷的粘附生长环境,有利于细胞的快速附着和扩展,有利于细胞的高密度 生长。它即模仿了动物明胶的表面结构,但又不引入动物源性物质,克服了细胞大规模培养 过程中因引入动物来源成分可能带来的产品质量及安全性问题。本发明的技术路线是利用烯丙基甘油醚通过葡聚糖凝胶表面的羟基,将葡聚糖珠 活化。溴化后通过氨基将精氨酸或多聚精氨酸交联于活化的葡聚糖微球表面。具体的实施步骤为(见图2):第一步,葡聚糖微球干粉加水膨胀后,加入NaOH以提供碱性环境;第二步,加入烯丙基甘油醚,搅拌并保温,使烯丙基甘油醚的环氧基打开并与葡聚 糖微球表面的羟基进行反应,形成共价键;第三步,加入溴水,将烯丙基甘油醚的醚键打开,在碱性条件下与精氨酸或多聚精 氨酸的氨基进行反应,通过精氨酸的ε _氨基将其交联于葡聚糖表面形成微载体。本发明的技术效果在于(1)通过烯丙基甘油醚的交联,在葡聚糖珠表面接臂,从而使得多聚精氨酸配基向 外延伸,以减少细胞黏附时的位阻效应。(2)通过烯丙基甘油醚的环氧基和葡聚糖珠交联的配基具有稳定性好和配基脱落 率低的优点,这对微载体本身的性质以及产品质量至关重要。(3)由精氨酸聚合而成的多肽链,具有和动物明胶相似的性质,都含有大量的阳性 电荷,可以模仿动物明胶的表面结构,但又不引入动物源性物质。


图1为以猪胶原蛋白为配基,葡聚糖凝胶为基质的微载体合成路线图;图2为通过烯丙基甘油醚交联多聚精氨酸,以葡聚糖凝胶作为基质的微载体合成 路线图;图3为用精氨酸作配基的微载体培养Vero细胞的显微镜照片。
具体实施例方式下列实施例中所用方法,如无特别说明均为常规方法。实施例1、微载体的制备如图2所示,本发明微载体 配基与基质的交联步骤如下1.烯丙基甘油醚活化葡聚糖微球将IOOg葡聚糖干粉加入三颈烧瓶中,加入IOOOg水并搅拌使其充分溶胀。加入 IlOg固体硫酸钠,30°C下搅拌1小时。加入70g固体NaOH后并充分搅拌溶解后,加入烯丙基甘油醚。将温度升高至55°C 并反应过夜。反应完毕后用约10倍体积的水洗涤凝胶,然后再用10倍体积的乙醇与10倍 体积的水依次洗涤各一次。2.溴化烯丙基甘油醚将IL烯丙基甘油醚活化的葡聚糖微球加入到三颈瓶中并加入250mL水。加入30g 的无水乙酸钠并充分搅拌。加入溴水直至悬液呈黄色,后继续溴化10分钟。加入甲酸钠终 止反应至黄色消失。继续搅拌30分钟后将凝胶在一烧结玻璃漏斗中抽干。3.交联精氨酸(多聚精氨酸)配基将IOOg配基溶解于IL水中并制成0. lg/mL的配基溶液,加入到抽干的葡聚糖凝 胶中并用NaOH调pH值至9.0。45°C反应24小时后,依次用IOOmM的Tris缓冲液(pH8. 0), 50mM醋酸缓冲液(pH4. 0),浸洗5次,然后用0. 9%的NaCl溶液浸洗一次。将洗涤好的微载体放置于烧结玻璃漏斗中,用丙酮脱水后在70°C的烘箱中彻底干 燥。将干燥好的微载体放置于密闭容器中保存。步骤1 3的反应体系中所涉及的各物料用量可按比例放大。合成后的多聚精氨酸微载体,颗粒的直径分布在30 μ m到300 μ m之间,表面电荷 的密度为30 200 μ mol/mL,培养试验表明此微载体适于Vero细胞贴壁生长,细胞密度可 达 8X105/mL。实施例2、用微载体培养非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)1、细胞培养为检验以上制备的微载体的性能,我们将其用于非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞) 的培养,并与商品化的猪胶原蛋白微载体(Cytodex 3)作对照试验,方法如下首先将微载体在PBS (磷酸盐缓冲液)溶液中溶胀并高压灭菌。接种前将微载体用 含青霉素/链霉素的培养基洗涤两次。Ig的微载体干粉大约可膨胀到12mL的体积。用细胞 培养基烯释至微载体浓度为6g/L。将细胞接种于12孔培养板中,接种密度为2 X IO5ceIls/ mL。然后将ImL的微载体悬液加入到相应的培养孔,并于7% C02的培养箱中保温过夜。二、细胞计数与观察在显微镜下观察分别用精氨酸微载体及猪胶原蛋白微载体连续培养6小时、24小 时与72小时的细胞生长情况(图3)。显微镜照片显示,用精氨酸微载体培养Vero细胞, 图3中显示接种6小时后细胞开始附着,培养24小时后细胞已开始贴壁生长;培养72小时 后,微载体表面已为细胞所覆盖。用精氨酸合成的非动物源性微载体与市售的猪胶原蛋白 微载体的效果无区别。细胞培养用微载体主要用于大规模、高密度的动物细胞培养,而动物细胞培养是疫苗及抗体及基因工程药物生产的关键技术。由于微载体的加入,使贴壁培养的动物细胞 能够帖服于微载体表面而悬浮生长,从而极大的提高了生长密度并缩短了生长时间。对照 试验表明, 用精氨酸合成的非动物源性微载体适于Vero细胞贴壁生长,并能实现细胞高密 度培养,细胞计数显示细胞密度可达8X105/mL,与市售的猪胶原蛋白微载体的效果无区 别。精氨酸微载体和猪胶原蛋白微载体对细胞生长曲线及生长密度的作用相同,完全可以 替代猪胶原蛋白微载体用于动物细胞的大规模培养。
权利要求
一种动物细胞培养用微载体,由配基与基质通过交联剂交联而成,其特征在于配基为精氨酸聚合而成的多肽链。
2.如权利要求1中所述的动物细胞培养用微载体,其特征在于其配基由天然精氨酸或 全人工合成多聚精氨酸聚合而成。
3.如权利要求1中所述的动物细胞培养用微载体,其特征在于基质为葡聚糖。
4.如权利要求1至3任一权利要求项中所述的的动物细胞培养用微载体,其特征在于 配基通过交联剂烯丙基甘油醚交联于基质表面。
5.一种用于权利要求4中所述的动物细胞培养用微载体的交联方法,其特征在于配基 通过交联剂烯丙基甘油醚与基质连接。
6.如权利要求5中所述的动物细胞培养用微载体的交联方法,包括以下步骤(1)烯丙基甘油醚活化葡聚糖微球将I00g葡聚糖干粉加入三颈烧瓶中,加入1000g水并搅拌使其充分溶胀,加入110g固 体硫酸钠,30°c下搅拌1小时,加入70g固体NaOH后并充分搅拌溶解后,加入烯丙基甘油 醚,将温度升高至55°C并反应过夜,反应完毕后用约10倍体积的水洗涤凝胶,然后再用10 倍体积的乙醇与10倍体积的水依次洗涤各一次;(2)溴化烯丙基甘油醚将1L烯丙基甘油醚活化的葡聚糖微球加入到三颈瓶中并加入250mL水,加入30g的无 水乙酸钠并充分搅拌,加入溴水直至悬液呈黄色,后继续溴化10分钟,加入甲酸钠终止反 应至黄色消失,继续搅拌30分钟后将凝胶在一烧结玻璃漏斗中抽干;(3)交联精氨酸(多聚精氨酸)配基将100g配基溶解于1L水中并制成0. lg/mL的配基溶液,加入到抽干的葡聚糖凝胶中 并用NaOH调pH值至9. 0,45°C反应24小时后,依次用100mM的Tris缓冲液(pH8. 0), 50mM 醋酸缓冲液(PH4. 0),浸洗5次,然后用0. 9%的NaCl溶液浸洗一次,将洗涤好的微载体置 于烧结玻璃漏斗中,用丙酮脱水后在70°C的烘箱中彻底干燥,将干燥好的微载体放置于密 闭容器中保存,步骤⑴ ⑶反应体系中所涉及的各物料用量可按比例放大。
全文摘要
本发明公开了一种动物细胞培养用微载体及交联方法。该微载体是利用精氨酸(Arginine)或全人工合成的多聚精氨酸(Poly-Arginine)作为配基,用烯丙基甘油醚作为交联活化剂将之交联于葡聚糖珠表面而合成的一种无动物来源成分的微载体。该微载体由精氨酸聚合而成的多肽链,具有和动物明胶相似的性质,为细胞提供一个具有多聚正电荷的粘附生长环境,有利于细胞的快速附着和扩展及细胞的高密度生长。该精氨酸配基既模仿了动物明胶的表面结构,但又不引入动物源性物质,克服了细胞大规模培养过程中因引入动物来源成分可能带来的产品质量及安全性问题。
文档编号C08B37/02GK101864391SQ201010178279
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者张平, 张洪 申请人:博格隆(上海)生物技术有限公司
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