专利名称：用来培养细胞的合成微型载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养微型载体，更具体来说涉及合成的化学限定的微型载体。关于序列表的声明本申请包括通过EFS网站以电子方式提交给美国专利商标局的序列表，其文件名为“SP09156 ST25. txt”，为2010年5月27日建立的8kb的文件。
背景技术：
人们已经将微型载体用于细胞培养，用来以高产率提供附着依赖性细胞。微型载体通常在细胞培养基中进行搅拌或者搅动，与较传统的培养设备相比，所述微型载体能够提供非常大的附着和生长表面积体积比。目前大部分可以获得的微型载体提供细胞与用于细胞生长的载体之间的非特异性连接。虽然这些微型载体可以使用，但是它们无法进行生物特异性细胞粘附，因此无法很容易地对培养的细胞的特性进行设计。例如，由于非特异性相互作用，可能很难将细胞(例如干细胞)保持在特定的分化状态，或者介导细胞以特定的方式进行分化。一些目前可以获得的微型载体提供了生物特异性粘附，但是这些微型载体使用了源自动物来源的涂层，例如胶原或者明胶。这些动物来源的涂层可能会使得细胞接触潜在有害的病毒或者其它传染原，如果将所述细胞用于治疗目的，所述病毒或者其它传染原可能会被传播给病人。另外，这些病毒或者其它传染原可能会对培养的细胞的一般培养和维持造成不利影响。另外，这些生物产品容易在不同批次之间发生变化，并且储藏寿命有限。
发明内容
本发明描述了一种可以用来培养细胞的合成的化学限定的微型载体。在各种实施方式中，即使在微球体可能为高度可溶胀的情况下，本文所述的微型载体也能够在保持细胞粘着和生长的同时具有足够的耐受搅拌的能力。在各种实施方式中，用来形成微型载体的组合物包含(i)具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体；(ii)包含羧酸的亲水性不饱和单体；以及(iii)选自以下单体的亲水性多官能不饱和单体亲水性多官能(甲基)丙烯酸酯单体或者亲水性多官能(甲基)丙烯酰胺单体。所述单体可以选自(甲基)丙烯酸酯单体或者(甲基)丙烯酰胺单体。在一些情况下，相对于所述具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体、包含羧酸的亲水性不饱和单体以及亲水性多官能不饱和单体的总重量，所述(i)具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体的重量百分数至少为60%，(ii)所述包含羧酸的亲水性不饱和单体的重量百分数至少为10%，(iii)所述亲水性多官能不饱和单体的重量百分数为3-30%。
在各种实施方式中，微型载体包含由以下单体(i)-(iii)的混合物共聚形成的聚合物(i)具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体；(ii)包含羧酸的亲水性不饱和单体； 以及(iii)亲水性多官能不饱和单体。所述微型载体可以进一步包含偶联于微型载体表面上的多肽，例如能够促进细胞粘附的多肽；例如，所述多肽可以通过所述包含羧酸的亲水性不饱和单体的羧基偶联于微型载体表面。较佳的是，所述聚合基底物不允许细胞的非特异性粘附，所述多肽提供了生物特异性细胞结合。在各种实施方式中，用来制备细胞培养微型载体的方法包括使得单体的混合物共聚以形成微型载体基底物。所述单体的混合物包含(i)具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体；(ii)包含羧酸的亲水性不饱和单体；以及(iii)亲水性多官能不饱和单体。在一些实施方式中，所述单体的混合物通过油包水共聚而发生共聚。所述方法还包括将多肽偶联于所述微型载体基底物以形成所述微型载体。在很多实施方式中，用来培养细胞的方法包括使得细胞与包含微型载体的细胞培养基接触。所述微型载体包括由以下单体(i)-(iii)的混合物形成的聚合基底物(i)具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体；(ii)包含羧酸的亲水性不饱和单体；以及(iii)亲水性多官能不饱和单体；所述微型载体还包含多肽偶联的聚合物。该方法还包括在所述培养基中培养所述细胞。所述细胞可以是干细胞，例如胚胎干细胞，所述培养基可以是化学限定的培养基。本发明列出的一个或多个各种实施方式提供了优于现有技术的用来培养细胞的制品和系统的一个或多个优点。例如，本文描述的合成微型载体能够在无需动物来源的生物涂层的情况下支持细胞粘着，由此限制了病原体污染的风险。当所述细胞用于细胞治疗的时候，这一点是特别要紧的。另外，通过使用本发明所述的微型载体，可以对包括人胚胎干细胞(hESC)在内的细胞进行大规模培养。这些微型载体还可以有益地在不希望或者禁止使用胶原、明胶、纤连蛋白之类的动物来源的产品的情况下，用于除了干细胞以外的细胞的培养。本文所述的方法可以用来制造具有很宽范围的性质的微型载体，所述性质包括例如刚度、溶胀性、表面化学性质，还可以提供包含柔软的可溶胀的基材的微型载体，当在搅拌的容器中培养细胞的时候，这种微型基材能够防止细胞受到破坏。另外，所述微型载体可以是整体型的，并不是像大部分商业微型载体那样是涂覆的状态，由此减少了与生产复杂性和细胞相容性相关的成分的数量。结合以下附图，对以下详述部分进行阅读，可以很容易地理解这些优点以及其它的优点。附图简要说明
图1是根据实施例1制备的代表性的微型载体的显微图。图2A和2B是根据实施例1制备的代表性微型载体的扫描电子显微(SEM)图。图3A，B，C和D是进行PBS缓冲液洗涤之后获得的代表性的微球体不同放大倍数的SEM图。图4是根据实施例1制备的微型载体颗粒的粒度分布图。图5A和B是粘附于用GRGDS肽接枝的微型载体上的CHO-Ml细胞的图像。图6是粘附于用GRGDS肽接枝的微型载体上的HEK293细胞的图像。图7是粘附于用GRGDS肽接枝的微型载体上的MRC5细胞的图像。图8是根据实施例6制备的代表性的微型载体的显微图。
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图9A和B是分别在实施例7和8中讨论的与接枝于微型载体的玻璃体结合蛋白多肽㈧和RGE多肽⑶相连接的HT1080细胞的相差显微图。图10是制得的微型载体的尺寸与搅拌速率的变化关系图。发明详述在以下详述中，参照构成说明书的一部分的附图，以示意性方式描述本发明的装置、系统和方法的几种具体实施方式
。应理解可以在不脱离本发明公开内容的范围或精神的范围内预期其它的实施方式。因此，以下发明详述不应理解为限制性的。除非另外说明，本文使用的所有科学和技术术语的含义是本领域通用的含义。本文提供的定义是用来帮助理解本文常用的某些术语，不会对本发明的范围构成限制。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的相反表示。在本说明书和权利要求书中，通常使用术语“或”表示“和/或”，除非文中有明显的相反表示。在本文中用单字母氨基酸代码和三字母氨基酸代码表示多肽序列。这些代码可以互换使用。在本文中，“单体”表示能够与另一种单体聚合的化合物(无论所述“单体”与另外的单体属于相同或不同的化合物)，所述化合物的分子量约小于1000道尔顿。在许多的情况下，单体的分子量约小于400道尔顿。在本文中，“微型载体基底物”表示其上可以偶联多肽的聚合物微型载体。在本文中，“微型载体基底物”和“聚合微型载体”经常互换使用。微型载体是一个小的不连续的颗粒，用来培养细胞并且细胞可以连接到该颗粒。微型载体可以是任何合适的形状，例如棒状、球形等，可以是多孔的或者非多孔的。在本文中，“肽”和“多肽”表示氨基酸序列，它们可以通过化学方式合成或者可以重组衍生，但是它们无法以完整蛋白质的形式从动物来源分离。出于本发明的目的，肽和多肽不是完整的蛋白质。肽和多肽可以包括作为蛋白质片段的氨基酸序列。例如，肽和多肽可以包括被称为细胞粘附序列(例如RGD)的序列。多肽可以具有任意合适的长度，例如长度为3-30个氨基酸。多肽可以进行乙酰化(例如Ac-LysGlyGly)或者酰胺化(例如 SerLysSer-NH2)以保护其自身免于被例如外肽酶破坏。可以理解，在描述某种序列的时候， 也考虑了这些修饰形式。在本文中，“(甲基)丙烯酸酯单体”表示甲基丙烯酸酯单体或者丙烯酸酯单体。 在本文中，“(甲基)丙烯酰胺单体”表示甲基丙烯酰胺或者丙烯酰胺单体。(甲基)丙烯酸酯和(甲基)丙烯酰胺单体包含至少一个烯键式不饱和部分。在本文中，“聚(甲基)丙烯酸酯”表示由包括至少一种(甲基)丙烯酸酯单体的一种或多种单体形成的聚合物。在本文中，“聚(甲基)丙烯酰胺”表示由包括至少一种(甲基)丙烯酰胺单体的一种或多种单体形成的聚合物。在本文中，“平衡水含量”表示用下式1所示的平衡水含量(EWC)定义和测量的聚合物材料的吸水特性式1 :EWC(% ) = [(1凝胶-1干)/(1凝胶)]*100。在本文中，“具有”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”、“拥有”等表示开放式的含义，通
常表示“包括(含)，但不限于”。应当理解，“主要由……组成”、“由……组成”等涵盖在术语“包括”等的范围之内。因此，由包含具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体、包含羧酸的亲水性不饱和单体、以及亲水性多官能单体的单体混合物形成的微型载体可以由一种混合物形成，该混合物主要由以下单体组成，或者由以下单体组成具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体；包含羧酸的亲水性不饱和单体；以及亲水性多官能不饱和单体。在本文中，当用“亲水性”描述单体的时候，表示该单体能够分离入水包油乳液的水相之内。例如，等于或大于95%;例如等于或大于98%的单体分离入水相中。应当理解， 保留在水相中的单体的量取决于乳液中的组分(例如油相和乳化剂的组分，如果有的话)。 例如，在许多的乳液中，油相是硅油或者氟化溶剂，通常具有极高亲水性的单体，例如二甲基丙烯酸乙二醇酯可以保持分散在水相中(因此在本文中认为其是“亲水性的”)。在通过水包油共聚形成微型载体的时候，单体能够保持在水包油乳液中的水相中的能力是很重要的。如果所述单体不会保持在水相中，则形成微型载体的能力可能会受到负面影响。本发明描述了用来培养细胞的合成微型载体等。在各种实施方式中，所述微型载体设计用来在化学限定的培养基中支持未分化干细胞的增殖和维持。1.微型载体在本文中，微型载体是通过包含以下单体的单体混合物聚合形成的具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体，包含羧酸的亲水性不饱和单体，以及亲水性多官能不饱和单体。在一些实施方式中，所述微型载体的聚合基底物是由一种单体混合物形成，所述单体混合物由以下单体组成，或者主要由以下单体组成具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体，包含羧酸的亲水性不饱和单体，以及亲水性多官能不饱和单体。A.具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体可以使用任何合适的具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体。“不带电荷的”单体表示具有以下性质的单体当该种单体结合入聚合微型载体中的时候，在特定细胞培养条件下没有带电荷的基团。在细胞培养条件下包括带电荷部分的微型载体可以造成细胞的非特异性连接。在各种实施方式中，希望细胞与微型载体的相互作用具有生物特异性并且对接枝于微型载体的多肽具有选择性。在各种实施方式中，所述具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体是化学式(I) 所示的(甲基)丙烯酸酯单体
权利要求
1.一种用来通过油包水乳液共聚形成微型载体的组合物，该组合物包含(i)具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体，其选自具有羟基的亲水性(甲基)丙烯酸酯单体或者具有羟基的亲水性(甲基)丙烯酰胺单体；( )包含羧酸的亲水性不饱和单体，其选自包含羧酸的(甲基)丙烯酸单体或者包含羧酸的(甲基)丙烯酰胺单体，以及(iii)亲水性多官能不饱和单体，其选自亲水性多官能(甲基)丙烯酸酯单体或者亲水性多官能(甲基)丙烯酰胺单体。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，相对于所述具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体、包含羧酸的亲水性不饱和单体以及亲水性多官能不饱和单体的总重量，所述(i)具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体的重量百分数至少为60%，(ii)所述包含羧酸的亲水性不饱和单体的重量百分数至少为10%，(iii)所述亲水性多官能不饱和单体的重量百分数为3-30%。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述亲水性多官能不饱和单体选自 N，N’_亚甲基二丙烯酰胺，N，N’(1，2-二羟基亚乙基)二丙烯酰胺，聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯，三甘油二丙烯酸酯，丙二醇甘油化物二丙烯酸酯，三羟甲基丙烷乙氧基化物三丙烯酸酯，以及甘油1，3-二甘油化物二丙烯酸酯。
4.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述亲水性多官能不饱和单体选自 亚甲基二丙烯酰胺和二羟基亚乙基二丙烯酰胺。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体是下式(I)或(II)所述的单体
6.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体选自甲基丙烯酸羟丙酯，甲基丙烯酸-2-羟基乙酯，丙烯酸-2-羟基乙酯，甲基丙烯酸甘油酯，丙烯酸羟丙酯，丙烯酸-4-羟丁酯，N-(羟基甲基)丙烯酰胺，N-[三 (羟基甲基)甲基]丙烯酰胺，3-丙烯酰氨-1-丙醇，N-丙烯酰氨-乙氧基乙醇和N-羟基乙基丙烯酰胺。
7.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体是甲基丙烯酸-2-羟乙酯。
8.如权利要求1-7中的任一项所述的组合物，其特征在于，所述包含羧酸的亲水性不饱和单体是式(III)或式(IV)所述的单体
9.如权利要求1-7中的任一项所述的组合物，其特征在于，所述包含羧酸的亲水性不饱和单体选自甲基丙烯酸-2-羧基乙酯，丙烯酸-2-羧基乙酯，丙烯酸，甲基丙烯酸，2-羧基乙基丙烯酰胺以及丙烯酰氨乙醇酸。
10.如权利要求1-7中的任一项所述的组合物，其特征在于，所述包含羧酸的亲水性不饱和单体是甲基丙烯酸-2-羧基乙酯。
11.一种形成细胞培养微型载体的方法，其包括通过油包水共聚使得如权利要求1-10中任一项所述的组合物中的单体共聚；以及使多肽与所述微型载体基底物连接以形成所述微型载体。
12.一种用于细胞培养的微型载体，其包含一种聚合微型载体基底物，该基底物由权利要求1-10中任一项所述的组合物中的单体共聚形成；以及与所述聚合基底物连接的多肽。
13.如权利要求12所述的微型载体，其特征在于，所述微型载体基底物的平衡水含量为 5-70% ο
14.如权利要求12或13所述的微型载体，其特征在于，所述多肽与包含羧酸的亲水性不饱和单体的羧酸基团偶联。
15.如权利要求12-14中任一项所述的微型载体，其特征在于，所述多肽是能够提高细胞与微型载体的粘附性的多肽。
16.如权利要求12-14中任一项所述的微型载体，其特征在于，所述多肽选自BSP多肽，玻璃体结合蛋白多肽，纤维结合蛋白多肽以及胶原多肽。
17.如权利要求12-14中任一项所述的微型载体，其特征在于，所述多肽是含RGD的多肽。
18.如权利要求12-17中任一项所述的微型载体，其特征在于，所述微型载体基底物是整体型的。
19. 一种用来培养细胞的方法，该方法包括使细胞与包含权利要求12-18中任一项所述的微型载体的细胞培养基接触；以及在所述培养基中培养细胞。
全文摘要
一种细胞培养微型载体，包含由以下单体(i)-(iii)的混合物共聚形成的聚合物(i)具有羟基的不带电荷的亲水性不饱和单体；(ii)包含羧酸的亲水性不饱和单体；以及(iii)亲水性多官能不饱和单体。所述微型载体可以进一步包含偶联于微型载体表面上的多肽，例如能够促进细胞粘着的多肽；例如，所述多肽可以通过所述包含羧酸的亲水性不饱和单体的羧基偶联到微型载体表面上。
文档编号C08F289/00GK102482385SQ201080033364
公开日2012年5月30日 申请日期2010年5月27日 优先权日2009年5月28日
发明者D·亨利, M·赫维, S·德赛 申请人:康宁股份有限公司