专利名称：一种酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法。
背景技术：
紫菜含有丰富的多糖和蛋白质，可用于制备具有生理活性效应的活性多糖和活性多肽。紫菜多糖是多聚半乳糖醛酸硫酸酯，构成了紫菜细胞壁的主要成分。紫菜细胞内含有丰富蛋白质，破坏紫菜细胞壁和细胞膜后使紫菜细胞内容物流出，可得到紫菜蛋白。因此， 要充分地获得紫菜多糖和紫菜蛋白，应当尽可能破坏紫菜细胞壁和细胞膜结构。目前紫菜细胞破碎主要采用超声波处理。超声波处理产生的空化效应可破坏紫菜细胞壁和细胞膜结构，得到紫菜多糖和紫菜蛋白质。但单纯用超声波处理，紫菜细胞基本保持完整，仅产生少量空隙，从而影响紫菜细胞破碎效率，不利于紫菜多糖和紫菜蛋白的提取。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法，提高紫菜细胞破碎率，增加紫菜多糖、紫菜蛋白和紫菜降血压肽的得率。一种酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法，包括将紫菜干粉、酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，于35 37°C下酶解反应30 45min，再于30 32°C下利用功率为730 750W的超声波破碎65 70min ；所述的酵母展示型脂肪酶通过如下方法制备将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115中，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144h后离心收集菌体，菌体经冲洗和冷冻干燥制得酵母展示型脂肪酶；所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体PPIC9K中MF α 1信号肽基因下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。所述的酵母展示型脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从hvitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为]\C8164。载体PPIC9K为商业化产品(如hvitrogen公司)，它存在MFa 1信号肽序列(Genbank号M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOXl启动子(Genbank号 Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。以重量份计，水1000份、紫菜干粉20 25份、酵母展示型脂肪酶1 2份。酶解反应同时对反应液进行搅拌，搅拌速率为100 200转/min。本发明还提供了一种提取紫菜多糖或紫菜蛋白的方法，包括
将紫菜干粉、酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，35 37°C下酶解反应30 45min， 再于30 32°C下利用功率为730 750W的超声波破碎65 70min，得细胞破碎液，分离纯化得紫菜多糖或紫菜蛋白。所述紫菜多糖或紫菜蛋白的分离纯化方法将所述细胞破碎液离心后取上清液， 盐析，4°c静置1 后离心，上清液为紫菜多糖溶液，沉淀为紫菜蛋白。本发明又提供了一种制备紫菜降血压肽的方法，包括将紫菜干粉、酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，于35 37°C下酶解反应30 45min,再于30 32°C下利用功率为730 750W的超声波破碎65 70min，分离纯化得到紫菜蛋白；将紫菜蛋白、酵母展示型蛋白酶加入水中混勻，于36 37°C下酶解反应130 133min，得紫菜降血压肽；所述的酵母展示型蛋白酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115中，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144h后离心收集菌体，菌体经冲洗和冷冻干燥制得酵母展示型蛋白酶； 所述重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体PPIC9K中MF α 1信号肽基因下游的蛋白酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。所述的酵母展示型蛋白酶基因可选用Genbank号为ΝΜ_012708. 2的序列。以重量份计，水1000份、紫菜蛋白20 22份、酵母展示型蛋白酶1 1. 1份。脂肪酶可降解破坏组成紫菜细胞膜的磷脂双分子层，用脂肪酶酶解协同超声波处理，脂肪酶对组成紫菜细胞膜的磷脂双分子层的降解破坏可进一步提高后续超声波处理产生的空化效应，促进整个紫菜细胞结构破坏，使细胞成分尽可能释放出来，紫菜多糖和紫菜蛋白与紫菜细胞碎片分离，然后通过盐析处理，即可高得率地获得纯度较高的紫菜多糖和紫菜蛋白，再将紫菜蛋白用酵母展示型蛋白酶酶解处理，获得紫菜降血压肽。本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母GS115细胞中，毕赤酵母GS115细胞诱导培养后将脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面，提高脂肪酶的水解活力。利用该酵母展示脂肪酶对紫菜细胞的细胞膜进行降解，并进而协同超声波处理，高效破碎紫菜细胞以尽可能地释放出细胞成分，离心去除沉淀后测定上清中紫菜多糖与紫菜蛋白质含量，紫菜多糖得率达40. 8 41. 9%，紫菜蛋白得率达47. 5 48. 5 %，而单独用超声波处理则紫菜多糖与紫菜蛋白质得率仅分别为28.7 30.和30. 6 32. 3%。将脂肪酶酶解协同超声波处理后的含紫菜多糖和紫菜蛋白的溶液进行盐析处理后，离心，上清即为紫菜多糖溶液，得率为35. 8-36. 2%，沉淀即为紫菜蛋白，得率为43. 5 46. 1%。紫菜蛋白被酵母展示型蛋白酶酶解后得紫菜降血压肽，得率达21.5%，对血管紧张素转换酶(ACE)抑制活力为83.5%，具有显著降血压活力。
具体实施例方式实施例1制备酵母展示型脂肪酶和酵母展示型蛋白酶通过人工合成的方法，合成脂肪酶基因(Genbank号AF229435)、蛋白酶基因(Genbank号NM_012708. 2)和毕赤酵母GSl 15的细胞壁α凝集素基因 (Genbank号iC8164)，同时在脂肪酶基因(或蛋白酶基因)C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，连接后得到核苷酸序列 LIP-Iinker- α -agglutinin (或 PRO-Iinker- α -agglutinin)，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中LIP为脂肪酶基因(PRO为蛋白酶基因)，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。分别以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，针对脂肪酶的引物对上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG 3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG 3，针对蛋白酶的引物对上游引物5，-CCTTCGCCGCACGCCGCTGCTGATTGGAAA 3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG 3，PCR反应体系为模板DNA为1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR缓冲液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR 运行条件为94 V 3min,35 个循环(94 V 30s, 60 V lmin，72 V 30s)， 72°C IOmin。用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成PPIC9K-LIP质粒(或PPIC9K-PR0质粒)，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Ml I对pPIC9K-LIP质粒(或 PPIC9K-PR0质粒)进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15 μ 1加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V、 400Q、25uF条件下电击10ms，并加入约Iml预冷的山梨醇。将上述混勻的电转产物约 400 μ 1涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上， 根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5% (体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞， 用水冲洗后，接种至YGC培养基中30°C培养120h，然后3000g离心5min收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7. 0磷酸缓冲液洗涤，-80°C下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥Mh，得到酵母展示型脂肪酶和酵母展示型蛋白酶。实施例2酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞实例1水1000克、紫菜干粉20克、酵母展示型脂肪酶1克，配制成混合悬浮液，体系搅拌速率为100转/min，温度为35°C，处理时间为30min，然后超声处理，超声功率730W、 超声处理时间为65min、处理温度为30°C，得到细胞破碎液，离心GOOOg 30min)去沉淀后测上清液中紫菜蛋白和紫菜多糖的得率。实例2水1000克、紫菜干粉25克、酵母展示型脂肪酶2克，配制成混合悬浮液，体系搅拌速率为200转/min，温度为37°C，处理时间为45min，然后超声处理，超声功率750W、 超声处理时间为65min、处理温度为30°C，得到细胞破碎液，离心GOOOg 30min)去沉淀后测上清液中紫菜蛋白和紫菜多糖的得率。实施例3单独用超声波破碎紫菜细胞实例1水1000克、紫菜干粉20克，配制成混合悬浮液，然后超声处理，超声功率 730W、超声处理时间为65min、处理温度为30°C，得到细胞破碎液，离心GOOOg 30min)去沉淀后测上清液中紫菜蛋白和紫菜多糖的得率。实例2水1000克、紫菜干粉25克，配制成混合悬浮液，然后超声处理，超声功率 750W、超声处理时间为65min、处理温度为30°C，得到细胞破碎液，离心GOOOg 30min)去沉淀后测上清液中紫菜蛋白和紫菜多糖的得率。实施例4酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞提取紫菜多糖实例1水1000克、紫菜干粉20克、酵母展示型脂肪酶1克，配制成混合悬浮液，体系搅拌速率为100转/min，温度为35°C，处理时间为30min，然后超声处理，超声功率730W、超声处理时间为65min、处理温度为30°C，得到细胞破碎液，将细胞破碎液离心 (4000g 30min)取上清液，再在上清液中加入硫酸铵浓度至20% (W/V)，4°C静置1 后，离心GOOOg 30min)除去沉淀，上清液即为紫菜多糖溶液，测紫菜多糖溶液中紫菜多糖的得率。实例2水1000克、紫菜干粉25克、酵母展示型脂肪酶2克，配制成混合悬浮液，体系搅拌速率为200转/min，温度为37°C，处理时间为45min，然后超声处理，超声功率750W、超声处理时间为65min、处理温度为30°C，得到细胞破碎液，将细胞破碎液离心 (4000g 30min)取上清液，再在上清液中加入硫酸铵浓度至25% (W/V)，4°C静置1 后，离心GOOOg 30min)除去沉淀，上清液即为紫菜多糖溶液，测紫菜多糖溶液中紫菜多糖的得率。实施例5酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞提取紫菜蛋白实例1水1000克、紫菜干粉20克、酵母展示型脂肪酶1克，配制成混合悬浮液，体系搅拌速率为100转/min，温度为35°C，处理时间为30min，然后超声处理，超声功率730W、超声处理时间为65min、处理温度为30°C，得到细胞破碎液，将细胞破碎液离心 (4000g 30min)取上清液，再在上清液中加入硫酸铵浓度至20% (W/V)，4°C静置1 后，离心GOOOg 30min)除去上清，沉淀即为紫菜蛋白，测紫菜蛋白的得率，本实施例所得紫菜蛋白可用于制备紫菜降血压肽。实例2水1000克、紫菜干粉25克、酵母展示型脂肪酶2克，配制成混合悬浮液，体系搅拌速率为200转/min，温度为37°C，处理时间为45min，然后超声处理，超声功率750W、超声处理时间为65min、处理温度为30°C，得到细胞破碎液，将细胞破碎液离心 (4000g 30min)取上清液，再在上清液中加入硫酸铵浓度至25% (W/V)，4°C静置1 后，离心GOOOg 30min)除去上清后，沉淀即为紫菜蛋白，测紫菜蛋白的得率，本实施例所得紫菜蛋白可用于制备紫菜降血压肽。实施例6酵母展示型蛋白酶酶解处理紫菜蛋白制备紫菜降血压肽水1000克、紫菜蛋白20克、酵母展示型蛋白酶1克，配置成混合悬浮液。处理时体系搅拌速率为160转/min，温度为36. 5°C，处理时间为130min，离心GOOOg 30min)取上清液，再在上清液中加入硫酸铵浓度至25% (W/V)，4°C静置1 后，离心GOOOg 30min)除去上清后，沉淀即为紫菜降血压肽，测紫菜降血压肽的得率和降血压活力。以上实施例中紫菜蛋白及紫菜降血压肽含量的测定采用紫外分光光度法，以酪蛋白为标准品。紫菜多糖含量的测定采用苯酚-硫酸比色法，以D 半乳糖为标准品，测试结果如下表所示^^例得率^\实施例2实施例3实施例4实施例5实施例612121212紫菜多糖40.8%41.9%28.7%30.28%35.8%36.2%紫菜蛋白47.5%48.5%30.6%32.3%43.5%46.1%降血压肽21.5%注紫菜多糖或紫菜蛋白的提取得率定义为提取液中紫菜多糖或紫菜蛋白的量与紫菜原料干重的比值；紫菜降血压肽的制备得率定义为制备得到的紫菜降血压肽的量与紫菜原料干重的比值。以上实施例6中紫菜降血压肽的降血压活力测定方法如下测定所制备紫菜降血压肽的血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性，评价其降血压活力。50 μ 1反应混合物中含有5mM Hip-His-Leu作为反应底物、0. 3M NaCl、5mU ACE和50mM 硼酸盐缓冲液(PH 8.3)。50 μ 1样品加入到上述反应混合液中，在37°C下反应3h之后，加入250 μ 1 1. ON HCl终止反应，向反应体系中再加入1. 5ml乙酸乙酯。旋涡震荡器中震荡 aiiin后，2500g离心15min，静置IOmin后，用移液器吸取1. Oml乙酸乙酯层液体于另外试管中，在干燥箱中干燥60min，再加入3. Oml蒸馏水将其溶解，在228nm处测定该溶液吸光值。ACE 抑制率(% ) = (A-B)/(A-C) X 100%在公式中，A为不存在紫菜降血压肽但存在血管紧张素转换酶(ACE)时的吸光度， B为存在紫菜降血压肽与血管紧张素转换酶(ACE)时的吸光度，C为紫菜降血压肽与血管紧张素转换酶(ACE)都不存在时的吸光度。根据上述方法对制备得到的紫菜降血压肽进行检测，其对血管紧张素转换酶 (ACE)抑制活力为83.5%，具有显著降血压活力。
权利要求
1.一种酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法，包括将紫菜干粉、酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，于35 37°C下酶解反应30 45min， 再于30 32°C下利用功率为730 750W的超声波破碎65 70min ；所述酵母展示型脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia past0ris)GS115中，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144h后离心收集菌体，菌体经冲洗和冷冻干燥制得酵母展示型脂肪酶；所述重组质粒由原始载体PPIC9K和依次插入原始载体PPIC9K中MF α 1信号肽基因下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以重量份计，水1000份、紫菜干粉20 25份、酵母展示型脂肪酶1 2份。
3.一种提取紫菜多糖或紫菜蛋白的方法，包括将紫菜干粉、权利要求1所述的酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，于35 37°C下酶解反应30 45min，再于30 32°C下利用功率为730 750W的超声波破碎65 70min，得细胞破碎液，分离纯化得紫菜多糖或紫菜蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述紫菜多糖或紫菜蛋白的分离纯化方法为将所述细胞破碎液离心后取上清液，盐析，4°C静置1 后离心，上清液为紫菜多糖溶液，沉淀为紫菜蛋白。
5.一种制备紫菜降血压肽的方法，包括将紫菜干粉、权利要求1所述的酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，于35 37°C下酶解反应30 45min，于30 32°C下利用功率为730 750W的超声波破碎65 70min，分离纯化得紫菜蛋白；将紫菜蛋白、酵母展示型蛋白酶加入水中混勻，于36 37°C下酶解反应 130 133min，得紫菜降血压肽；所述的酵母展示型蛋白酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia past0ris)GS115中，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144h后离心收集菌体，菌体经冲洗和冷冻干燥制得酵母展示型蛋白酶；所述重组质粒由原始载体PPIC9K和依次插入原始载体PPIC9K中MF α 1信号肽基因下游的蛋白酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以重量份计，水1000份、紫菜蛋白20 22份、酵母展示型蛋白酶1 1. 1份。
全文摘要
本发明公开了一种酵母展示型脂肪酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法，包括将紫菜干粉、酵母展示型脂肪酶加入水中混匀，35～37℃下酶解反应30～45min后于30～32℃下利用功率为730～750W的超声波破碎65～70min；本发明还公开了一种提取紫菜蛋白和紫菜多糖的方法，将上述紫菜细胞破碎后的细胞破碎液分离即可；本发明还公开了一种制备紫菜降血压肽的方法，即将分离的紫菜蛋白利用蛋白酶在在36～37℃下酶解反应130～133min即可。本发明的方法利用酵母展示脂肪酶对紫菜细胞的细胞膜进行降解并协同超声波处理，高效破碎紫菜细胞，提高紫菜细胞破碎率，增加紫菜多糖、紫菜蛋白和紫菜降血压肽的得率。
文档编号C08B37/00GK102321596SQ201110260328
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者何国庆, 余璐, 周陈伟, 张延 , 徐娟, 杜姗姗, 杨璐, 阮晖 申请人:浙江大学