专利名称：Atrp法构建以多糖为骨架的生物可还原高效阳离子基因载体的制作方法
技术领域：
本发明属于非病毒基因载体技术领域，具体涉及ATRP法构建一系列以多糖为骨架，其中包括葡聚糖、环糊精、普罗兰，具有高效基因转染效率的生物可还原阳离子多糖基因载体。
背景技术：
基因治疗在攻克人类癌症、遗传疾病及心血管等重大疾病方面起到举足轻重的作用，未来的医疗是将正常的或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞来干预疾病的发生、发展和进程，从而达到治疗的目的。基因治疗有三个重要环节，即目的基因的寻找、基因载体的研制和目的基因在细胞中的特异性表达。其中，基因导入系统是基因治疗的核心技术，缺乏安全而高效的基因载体是目前制约基因治疗实施的主要瓶颈。基因载体是作为基因导入细胞的工具，可以把目的基因送入靶细胞内，从而发挥目的基因的特定功能。应用于基因治疗的载体主要分为病毒载体(viral vector)和非病毒载体(non-viral vector)。病毒载体主要为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及单纯疱疹病毒，其优点是转染率高，缺点是缺乏安全性，可能引起致癌作用与不希望的自身免疫反应 (unexpected immune response)和白细胞的病毒变化，甚至可能造成病人多器官衰竭导致死亡。此外病毒载体还会引起插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶行转化，而且病毒载体携带DNA的能力有限，不利于大规模的生产。由于它的上述弱点，目前科学界已经研究重心转向非病毒技术的研究与开发。与病毒性载体相比，非病毒载体安全性高，并且具有低免疫原性、能够携带大量DNA分子、容易大批量生产及费用低廉等优点，是一个有潜力的替代路线，故人们愈来愈重视人工合成的非病毒载体的研究。阳离子聚合物是目前研究最广泛的人工合成非病毒载体。阳离子聚合物能够自发与带负电荷的基因通过电荷相互作用，可形成带正电荷纳米级的复合体(complex)，从而协助基因穿过带负电的细胞膜。此外，阳离子聚合物载体也能够保护质粒，避免被核酸酶降解，加速基因的细胞转染。近年来，随着活性/可控自由聚合(living/controlled radical polymerization, LRP)研究的快速发展，LRP技术在制备具有新颖特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大发展。LRP集活性可控聚合与自由基聚合的优点为一身，不但可得到相对分子量分布极窄、相对分子量可控、结构明晰的高分子，而且可聚合的单体多，反应条件温和易控制。所以，LRP技术具有极高的实用价值，受到了高分子化学家们的重视。迄今为止，已有原子转移自由基聚合(atom transfer radical polymerization,ATRP)、稳定自由 SMilSf^SiMiS (nitroxide mediated free radical polymerization，NMI P) 禾口可逆力口成一裂解链转移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT) 等LRP体系问世。其中，ATRP近几年得到了迅速发展并有着重要应用价值。其所用引发剂一般为卤代烷烃，基本原理是通过一交替的“活化-去活”可逆反应使体系中游离基浓度极低，迫使不可逆终止反应降低到最低程度，而链增长反应仍可进行，从而实现“活性”聚合。ATRP反应温度适中，适用单体范围广，甚至可以在少量氧存在下进行，对高分子材料的分子设计不需复杂的合成路线，是现有NMRP、RAFT等其它活性聚合方法无法比拟的，因此可以说ATRP技术的出现开辟了活性聚合的新领域。随着高分子科学、医学、生物学以及工程学等多门学科的相互交融、相互渗透和迅速发展，高分子基因载体材料进入一个快速发展的时期。目前，文献中报道一系列非病毒阳离子聚合物载体，包括聚-L-赖氨酸(poly (L-Iysine)，PLL)、 聚乙二胺树枝状聚合物(poly (amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N，N- 二甲氛基乙酉旨(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate), PDMAEMA)、聚乙炼亚胺 (polyethylenimine,PEI)等。其中PEI具有较高的转染效率，是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是上述阳离子聚合物仍具有相当高的毒性，大大限制了它们的应用。这样，开发低毒而高效阳离子聚合物是研究非病毒基因载体的核心内容。目前较为流行的方案是在阳离子聚合物中插入生物相容的成份，最常见的是聚乙二醇(PEG)。另一种常见的思路是多糖阳离子化，包括壳聚糖(chitosan)、环糊精(cyclodextrin)、葡聚糖(dextran)等。但是上述报道的非病毒载体的性能(比如安全性和转染效率)与实际应用的要求还有相当大的距离。当前，已经商品化的基因载体只有脂质体lipfect2000，但其高昂的成本让其无法成为癌症患者的选择，使得基因载体在临床治疗中无能为力。近几年研究者致力于ATRP理论和应用的研究工作，在ATRP合成生物材料以及 ATRP技术的生物材料应用方面开展了广泛的研究，取得了一定的研究成果。对多种单体 (包括DMAEMA、PEGEEMA, PEGMA以及GMA)的ATRP进行了系统的研究，积累了丰富的经验， 促进了活性可控聚合在医用生物高分子中的应用。多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6HltlO5)η表示，在自然界广泛分布，并且在免疫调节和抗病毒抗癌方面有着出色的表现。葡聚糖(Dextran)作为一种多糖在免疫调节、抗辐射、调节肠胃、帮助组织结构再生或修复、促进伤口愈合及预防心脑血管和糖尿病等方面均具有突出表现，对肝炎、肿瘤、心血管、糖尿病、降血脂、抗衰老等方面均有独特的生物活性。其特有的靶向性特点，能锁定休眠期、耐药性及亚临床病灶的“残存病毒细胞”，从而“同步”减毒增效，极大限度的保障临床治疗效果。同时，葡聚糖可以快速激活机体自身的免疫监管和识别机制，从而增强它们的战斗力，使自身免疫系统达到最佳平衡状态，保持肌体的健康。普鲁兰多糖(Pullulan)是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，它除了具备其他多糖所具有的优点之外，其本身带有一定的肿瘤靶性， 因而近几年在广泛应用于肿瘤治疗方面的研究。环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称， 通常含有6 12个D-吡喃葡萄糖单元。环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，在其空洞结构中，外侧上端(较大开口端)由C2和C3的仲羟基构成，下端(较小开口端)由C6的伯羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区。 早期的研究仅限于将CD及其小分子衍生物引入基因转染体系中。然而电荷中性的环糊精小分子，如β -⑶，HP β -⑶和 Μβ-CD等并不能与DNA形成稳定的复合物，转染水平比DNA 本身只有微小的提高，所以研究重点更多转移到环糊精阳离子聚合物上。胱胺(Cystamine，CA)，是一种有机二硫化物。由胱氨酸受热脱羧反应后形成。它是一种不稳定的液体，一般使用其二盐酸盐C4H12Nj2 · 2HC1。胱胺最主要的特性表现在它作为一种二硫化物所具有的双硫键。放置或还原剂还原时，二硫化物会分解为相应的硫醇。 亲核试剂的进攻也会打断二硫键，形成两个新的硫醇/硫醚此类型的氧化还原反应在生物体内及医药上都有很重要的用途。含有SS键的聚合物在模拟生理环境(pH 7. 4，150mM PBS, 37°C )中很稳定；但当加入2.5mM DTT(二硫苏醇)后迅速被还原，这与细胞内的还原环境(ρΗ7· 4，[R-SH] = 5mM, 37°C )非常类似。并且可以有效地将DNA凝结成纳米级(< 200nm)并使它在中性条件下带正电荷(> +20mV)。因而使得含有SS键的聚合物具有可剪切性。综上所述，尽管在利用活性可控自由基聚合法制备多糖基因载体方面已经做了很多工作，但是在技术方面还有以下问题需要解决1、在制备高性能多糖基因载体时，随着单体不断的接枝到多糖骨架上，阳离子基因载体的分子量随之增大，细胞内吞作用增大，转染效率增加，但是细胞的毒性也随之增大，如何最大限度的降低基因载体的毒性成为需要解决的问题。2、在制备高性能多糖基因载体时，接枝不同单体，可以得到不同性能的阳离子聚合物，但是不同单体的质子化能力不同，导致载体的转染效率高低不同，如何筛选出具有高效高性能的单体是需要考虑的问题。3、在制备高性能多糖基因载体时，接枝相同的单体，在不同的细胞包括癌细胞和普通细胞中，转染高低不同，如何提高在确定细胞中的转染效率是需要研究的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种活性可控自由基聚合法(ATRP法)构建的以多糖为骨架的生物可还原高效阳离子基因载体，该多糖阳离子基因载体分子量可控，分布窄、可剪切、 低毒性，高转染效率，高效无毒的特点使其具备了投入临床试验的可能。在本发明的反应体系中，引发剂的合成从多糖本体开始，激活多糖本体上的官能团，将胱胺与激活的官能团反应，使得二硫键接入到多糖本体上，之后通过引入溴作为大分子引发剂的引发点，得到多种多糖大分子引发剂，然后通过ATRP法将各种单体通过活性可控自由基聚合(ATRP法)接枝到多糖大分子引发剂的引发点上得到具有生物活性的多糖阳离子高效基因载体，并可对所得基因载体进行进一步后续修饰。本发明提供的聚合反应体系由多糖大分子引发剂、有机溶剂、单体、配体、CuBr, 水组成。其中水与多糖大分子引发剂的质量比值在0. 1-50范围，优选0. 1-45，更优选 0. 1-40 ；单体与多糖大分子引发剂的质量比值在0. 001-50范围，优选0. 01-45范围，更优选在0. 02-42范围；配体与多糖大分子引发剂的质量比值在0. 01-1范围，优选0. 01-0. 8 范围，更优选在0. 02-0. 5范围；CuBr与多糖大分子引发剂的质量比值在0. 001-1范围，优选0. 01-0. 9范围，更优选在0. 05-0. 5范围；有机溶剂与多糖大分子引发剂的质量比值在 20-500范围，优选20-450范围，更优选在25-400范围。各组分加入顺序一为先将多糖大分子引发剂溶于有机溶剂，然后加入水、单体， 再加入配体，最后加入CuBr引发活性可控自由基聚合。各组分加入顺序二为将多糖大分子引发剂溶于有机溶剂中，然后加入单体，再加入CuBr，最后加入配体引发活性可控自由基聚合。
本发明聚合反应温度0_60°C，优选5_55°C，更优选10_50°C。聚合温度升高，产物分子量增加。本发明聚合反应时间为l-500min，优选l-450min，反应完成后加入水或者甲醇， 或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，水或者甲醇的加入量为多糖大分子引发剂质量的100-500倍，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，然后将产物溶于水中，加水量与产物的比例为100-300ml/g，产物溶解后放入截留分子量为2500-4500MW的透析袋中，在去离子水中透析3- ；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得以多糖为骨架的生物可还原阳离子基因载体。 本发明的聚合反应在无氧环境下连续进行。所述的多糖大分子引发剂的结构表示为SS-R-Br，R为骨架结构，R上的羟基被如
下结构式的基团取代
权利要求
1.一种以多糖为骨架的生物可还原阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，其具体反应条件为该聚合反应体系由多糖大分子引发剂、有机溶剂、单体、配体、CuBr、水组成；其中水与多糖大分子引发剂的质量比值在0. 1-50范围，优选0. 1-45，更优选0. 1-40 ； 单体与多糖大分子引发剂的质量比值在0. 001-50范围，优选0.01-45范围，更优选在 0. 02-42范围；配体与多糖大分子引发剂的质量比值在0. 01-1范围，优选0. 01-0. 8范围，更优选在0. 02-0. 5范围；CuBr与多糖大分子引发剂的质量比值在0. 001-1范围，优选0. 01-0. 9范围，更优选在0. 05-0. 5范围；有机溶剂与多糖大分子引发剂的质量比值在 20-500范围，优选20-450范围，更优选在25-400范围；该聚合反应温度0-60°C，优选5-55°C，更优选10-50°C ；该聚合反应时间为l-500min，优选l-450min，反应完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空气中，使引发体系失活和终止聚合，水或者甲醇的加入量为多糖大分子引发剂质量的 100-500倍，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，然后将产物溶于水中，加水量与产物的比例为100-300ml/g，产物溶解后放入截留分子量为2500-4500MW的透析袋中，在去离子水中透析3- ；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得以多糖为骨架的生物可还原阳离子基因载体；该聚合反应在无氧环境下连续进行。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，聚合反应体系所述各组分加入顺序为先将多糖大分子引发剂溶于有机溶剂，然后加入水、单体，再加入配体，最后加入CuBr 引发活性可控自由基聚合。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，聚合反应体系所述各组分加入顺序为将多糖大分子引发剂溶于有机溶剂中，然后加入单体，再加入CuBr，最后加入配体引发活性可控自由基聚合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的多糖大分子引发剂的结构表示为SS-R-Br，R为骨架结构，R上的羟基被如下结构式的基团取代
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述醇类化合物选自C1-C8醇，包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、正己醇中的一种或几种；所述的酰胺类为N，N- 二甲基甲酰胺和/或N，N- 二甲基乙酰胺；所述的砜类选自二甲砜、二乙砜、二丙砜、二丁砜、二苯砜、二苄基砜、甲基苯基砜、环丁砜中的一种或几种；所述的亚砜类选自二甲基亚砜、二乙基亚砜、二丙基亚砜、二丁基亚砜、二戊基亚砜、二己基亚砜、O-乙基)己基亚砜中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，当有机溶剂为二甲基亚砜时，聚合反应体系的组分不包括水。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，聚合反应体系加入CuBr时可同时加入 CuBr2, CuBr 与 CuBr2 的质量比为(3 1)-(8 1)。
8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，当使用单体甲基丙烯酸缩水甘油醚得到的以多糖为骨架的生物可还原阳离子基因载体可进行开环反应，得到开环的以多糖为骨架的生物可还原阳离子基因载体，具体开环反应条件为单体甲基丙烯酸缩水甘油醚得到的以多糖为骨架的生物可还原阳离子基因载体，记为SS-R-PGMA，将其在30-45°C 无氧环境下，加入二甲基亚砜或者N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解，之后依次加入乙胺、三乙胺、胱胺引发开环反应，其中二甲基亚砜或者N，N-二甲基甲酰胺与SS-R-PGMA的质量比值在200-500范围，优选150-450，更优选120-350 ；其中乙胺与SS-R-PGMA的质量比值在 20-50范围，优选15-45，更优选12-35 ；其中三乙胺与SS-R-PGMA的质量比值在20-50范围， 优选15-45，更优选12-35 ；其中胱胺与SS-R-PGMA的质量比值在1_25范围，优选1_20，更优选3-15;反应1-3周以后，用乙醚沉淀聚合物直到变为粘稠状固体，放入真空干燥箱中除去乙醚，之后加入去离子水溶解，加水量与聚合物的比例为100-300ml/g，然后冷冻干燥直至除去所有水分，得到开环的以多糖为骨架的生物可还原阳离子基因载体。
全文摘要
本发明公开了属于非病毒基因载体技术领域的一种以ATRP法构建一系列以多糖为骨架，其中包括葡聚糖、环糊精、普罗兰，具有高效基因转染效率的生物可还原阳离子多糖基因载体。该ATRP法聚合反应平稳，易于调控，并可根据需要制备出多种不同分子量系列的、窄分子量分布的高性能阳离子多糖基因载体，制得的阳离子多糖基因载体储存稳定性好，放置几天或几个月后仍可保持原有性能。并且该多糖阳离子基因载体在Hepg2、Hela、C6、Cos7、HEK293等细胞中具有高于国际上已经投入商业化使用的脂质体lipfect2000的转染效率，使用方法简单，具有商业化潜力。
文档编号C08F120/32GK102492095SQ20111040696
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者徐福建, 朱韵, 杨鑫超, 柴明英, 王增辉, 胡杨 申请人:北京化工大学