专利名称：一种天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法，属于食品加工领域。
背景技术：
真菌因其营养和药用价值一直备受关注，目前已有多种具有药理作用的化合物从真菌中分离出来(如香菇多糖)。多糖在机体免疫调节、增强细胞抗肿瘤、抗氧化活性等方面具有重要的生物活性。大量研究证明，真菌多糖大多具有抗氧化活性，如木耳多糖 (Mau，2001)，冬虫夏草多糖(S. P. Li，2006)，灵芝多糖(Jing Xu, 2009)等。真菌多糖的研究与应用已渗入到医药、食品、化妆品和饲料等多种领域，多糖研究已成为目前生命科学中最活跃的研究热点之一。金福燕(Tricholoma lobayense Heim.)又名大白口蘑，属担子菌亚门层菌纲伞菌属口蘑科(白蘑科)，是一种发生于炎热季节的高温型正处于开发中的珍稀食用菌。金福菇在国内商品名称有洛巴伊口磨、洛巴口磨、大口磨等，法国真菌学家Heim最早发现于非洲， 并于1970年定名。其子实体肥厚嫩白，味微甜、脆嫩而鲜美，耐贮性好，适于鲜销和干制加工，深受市场青睐，具有较好的开发价值。目前这种食用菌在台湾售价不菲；日本近年也开始批量试种并投入市场，其商品名为白色松茸，金福菇子实体硕大，菌肉肥厚嫩白。有关专家指出，近年内金福菇将会发展成我国食用菌的主导产品。国外专家也认为“在热带、亚热带国家，金福菇的商业性栽培有光明的前景”。金福菇营养丰富，据分析每公斤干品中含蛋白质27. 56%、总糖38. 44%、粗脂肪
9.58%、粗纤维8. 20%。F. Liu(Gen. Pharmac. 1996)通过体内外抑瘤实验表明金福菇糖蛋白具有免疫调节及抗肿瘤活性；Η· X. Wang (Comp. Biochem. Physiol. Part B. 2000)阐述了金福菇提取物30kDa蛋白具有抑制体外翻译的活性；而有关金福菇多糖抗氧化活性的研究尚未见有文献报道。本发明是从金福菇中提取得到了几种天然多糖组分，对其进行抗氧化活性研究发现其中一个金福菇天然多糖组分TL-3具有很高的抗氧化活性，对超氧阴离子的清除能力与Vc几乎在同一个水平，具有重要的学术价值和广阔的商业化应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供了一种天然抗氧化剂金福菇多糖的提取方法，并对其抗氧化活性进行检测，发现一个抗氧化活性高的金福菇多糖组分，可作为一种天然的抗氧化剂，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。经HPLC检测，其分子量为4. 22X IO3Da,单糖组成及摩尔比为阿拉伯糖甘露糖葡萄糖半乳糖=15. I 2.3 3.7 I. 8。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤(I)将金福燕烘至恒重,粉碎，过O. 55mm筛；(2)称取步骤⑴所得粉末，在80-90 °C温度的热水中浸提2_4h，料液比I 10-40，提取液浓缩后，3300-3800r/min离心18-22min，取上清液；(3)将步骤(2)所得上清液浓缩至原体积的1/9-1/10，加入3. 8-4. 2倍体积的无水乙醇沉淀过夜，3300-3800r/min离心18_22min,收集沉淀物，冷冻干燥,得金福燕粗多糖；(4)将步骤(3)所得金福菇粗多糖加入到18-22倍质量的蒸馏水溶解，按体积比 I : I加入Sevag试剂，剧烈振荡25_35min, 3300-3800r/min离心18_22min,取上清液,浓缩、冷冻干燥得固体金福菇多糖；抗氧化活性检测a :将步骤(4)所得多糖配成10%溶液,用DEAE-Sephorase F. F凝胶柱纯化,上样量为10mL，0-lmol/LNaCl溶液梯度洗脱，流速为lmL/min，自动部份收集器收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测，经3. 5X IO3Da的透析袋透析后，浓缩、冷冻干燥得到纯化的金福菇多糖(TL-I)；b :将步骤a所得多糖配成O. 1%的溶液,过O. 22 μ m的过滤膜,用Superdex200层析柱分离，O. 02mol/L PBS(pH7. 2，含O. 15mol/L NaCl)洗脱，流速 lmL/min，波长 215nm紫夕卜检测，同时用苯酚-硫酸跟踪检测；收集的含糖组分用3. 5X IO3Da的透析袋透析脱盐，透析液浓缩、冷冻干燥得两个金福菇多糖组分(TL-2和TL-3)；c :对得到的多糖(TL-l、TL-2和TL_3)进行体外抗氧化活性实验，结果表明提取得到的金福菇多糖，尤其是TL-3，具有很高的清除超氧阴离子自由基(·02_)及抑制小鼠红细胞溶血(MEH)和丙二醛(MDA)的产生的活性。经HPLC检测，TL-3的分子量为4. 22X IO3Da,单糖组成及摩尔比为阿拉伯糖甘露糖葡萄糖半乳糖=15. I 2.3 3.7 I. 8。色谱图见图I和图2。本发明的有益效果提取获得的金福菇多糖是抗氧化活性较高的天然产物，对邻苯三酚自氧化体系产生的· 02_有明显的清除作用，特别是组分TL-3，当浓度为500μ g/mL时，清除率能够达到 75.6%，仅比Vc低15. 4个点；可以作为天然无毒抗氧化剂，TL-3在食品、医药和化妆品中有广阔的应用前景。目前我们所查阅资料中未发现高于此抗氧化活性的天然多糖，王普等专利(CN 101353382A)中，虫草多糖浓度达到10mg/mL时对· 02_的清除率仅为64 % JingXu等 (Carbohydr. Polym. 2009) 一文中，灵芝多糖浓度达到10mg/mL时对· O2^的清除率仅为 56%。
图1TL-3分子量测定HPLC色谱图。图2 标准单糖和 TL-3 水解物的 HPLC 色谱图(I. Rha 2. Xyl 3. Ara 4. Fru5. Man
6.Glc 7. Gal 8. Sue 9. Raffinose)。图3金福菇多糖分子筛层析苯酚-硫酸法跟踪检测图谱。图4TL-1、TL-2 和 TL-3 对· 02_ 的清除作用。图5TL-1、TL-2 和 TL-3 对 H2O2 诱导的 MEH 和 MAD 产生的影响，I. TL-3 (MEH) 2. TL-3 (MDA) 3. TL-I (MEH) 4. TL-I (MDA) 5. TL-2 (MEH) 6. TL-2 (MDA)。
具体实施例方式实施例I :以提取率为参考的粗多糖提取工艺的确定根据预试验结果，选取料液比、提取时间、提取温度三个对多糖提取率影响显著的因素，并在单因素试验基础上，通过三因素三水平的响应面分析方法分析出最佳的响应值， 试验设计、分析方案及得率结果如表I和表2。表I响应面分析因素与水平表
编码水平
因素代码 -
_-I_O_I_
提取时间(h)A2.534
料液比(g/mL)B1:251:301:40
提取温度(°c)C607080表2响应面分析方案及得率结果试验号XlX2X3多糖提取率(%广IOOO13. O2-IIO10. O3O-II10. 24-I-IO9. 75OI-I10. 66OOO12. 97-IOI10. 78OOO13. 29IIO11. O10OII11. I11IOI12. O12-IO-I9. 913OOO12. 814IO-I9. O15OOO12. 716O-I-I9. 517I-IO12. 4* :(多糖干品质量/原料质量)X 100%。各因素经回归拟合后，解得回归方程为
5
Y = 12. 92+0. 2625A+0. 3625B+0. 625+0. 075AB+0. 55AC-0. 05BC-1. 2975A2-1. 3475B 2-l. 2225C2，式中Y为多糖提取率(％ )，A为提取时间(h)，B为料液比(g/mL)，C为提取温度(。。)。根据design expert7. O通过ANOVA分析得到响应值最大时A、B、C对应的编码值分别为A = O. 89,B = O. 15,C = O. 45，对应的金福菇多糖最佳提取条件为提取温度83°C， 料液比I : 35，提取时间2. 5h，理论提取率为12.404%。用此优化方案经三次重复试验所得实际平均提取率为12. 294%，与理论值基本吻合，表明此方案对金福菇多糖提取条件的优化是可行的。实施例2 :金福菇多糖的制备将500g金福菇子实体在46°C恒温烘24小时，再于52°C恒温烘24小时，重为75g， 继续于37°C下烘至恒重63g，粉碎，过O. 55mm筛。称取20g金福菇粉末，热水浸提(温度83°C，料液比I : 35，时间2. 5h)，旋转蒸发仪浓缩提取液后，3500r/min离心20min，取上清液，浓缩至原体积的1/10后，加入4倍体积的无水乙醇沉淀，放置过夜，3500r/min离心20min,收集沉淀物,冷冻干燥,得到2. 451g浅褐色金福菇粗多糖，提取率为12. 25%。称取O. 5g粗多糖,用IOmL的蒸懼水溶解，按体积比I : I加入Sevag试剂(氯仿正丁醇=4 I, v/v),室温下剧烈振荡30min, 3500r/min离心20min,收集上层液浓
缩、冷冻干燥得固体金福菇多糖。将上述金福菇多糖配成10% (w/w)溶液，进行阴离子交换柱层析，凝胶柱为 DEAE-Sephorase F. F (2. 6cmX 50cm),上样量为 10mT,, 0-lmol/LNaCl 溶液梯度洗脱，流速为 lmL/min,自动部份收集器收集洗脱液，每管收集，苯酚-硫酸法跟踪检测，将多糖组分合并收集。将多糖溶液装入3. 5 X IO3Da的透析袋，自来水流水透析24h，除去小分子杂质，将透析袋溶液减压浓缩、冷冻干燥得到纯化的金福菇多糖(TL-I)。取5mg纯化的金福菇多糖溶于5mL超纯水中，过O. 22 μ m的过滤膜，用HiLoad 16/60(1. 6cmX60cm) Superdex 200 Prep grade (Amersham)层析柱分离，0.02mol/L PBS(pH7. 2，含O. 15mol/L NaCl)洗脱，流速lmL/min，波长215nm紫外检测，同时用苯酚-硫酸跟踪检测，以试管数为横坐标，以吸光度为纵坐标，作Superdex 200色谱柱洗脱曲线图。 分部收集含糖主峰部分，出现两个峰，见图3。收集的含糖组分分别装入3. 5X IO3Da的透析袋，自来水流水透析脱盐24h，透析液浓缩、冷冻干燥得两个金福菇多糖组分(TL-2和 TL-3)。实施例3 :体外抗氧化活性测定I、邻苯三酚自氧化作用的抑制测定取O. 05mol/LTris-HCl 缓冲液(pH8. 2)4mL,置于 25°C水浴中预热 20min，分别加入不同浓度(50、100、200、400、500 μ g/mL)的金福菇多糖组分lmL，将上述混合溶液预热到 250C，测前加O. 3ml的25°C预热好的45mmol/L邻苯三酚溶液，迅速混匀，吸光度的测定设在 420nm处，对于空白对照组的处理，采用相同体积的蒸馏水代替样品。阳性对照为相同浓度的Vc水溶液。默认为第I分钟的吸光值，在4min内每隔Imin读一次吸光值,记录的不同浓度样品不同时间内的吸光值。金福菇多糖的抑制率公式Y = (Fo-Fx)/Fo0其中Y是清除率，Fo和Fx分别是空白液和样品被测液随时间变化吸光度变化率。结果见图4。
2、小鼠红细胞溶血(MEH)和丙二醛(MDA)产生抑制率的测定小鼠股动脉取血，加入一定量的肝素钠抗凝血，2000r/min离心，去上清获得红细胞，生理盐水离心洗涤两次后， 根据红细胞的体积稀释成O. 5%红细胞悬浮液，将红细胞悬浮液与不同浓度多糖溶液按照体积比3 I进行混合，再加入一定量的H202于37°C孵育lh，孵育后在3000r/min转速下离心IOmin取上清液，其中，基础对照组不加TL-I、TL-2和TL-3，不加H202，用生理盐水补到4. 2mL ;空白对照组不加TL-I、TL-2和TL-3，加O. 2mL lmol/L H202，用生理盐水补到 4.2mL。于540nm处读出吸光度值。按试剂盒说明书的测定方法测定其MDA含量，计算混合溶液的溶血抑制率和丙二醛抑制率。根据公式如下抑制率(％) = (A空白-A样品)/ (A空白-A基础)XlOO ;MDA抑制率(％ ) = (X空白-X样品)/(X空白-X基础)X 100，结果见图5。
权利要求
1.一种天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将样品金福菇烘至恒重，粉碎，过O.55mm筛；(2)称取步骤(I)所得粉末，在80-90°C温度的热水中浸提2-4h，料液比1:10-40，提取液浓缩后，3300-3800r/min离心18_22min,取上清液；(3)将步骤(2)所得上清液浓缩至原体积的1/9-1/10，然后加入3.8-4. 2倍体积的无水乙醇沉淀过夜，3300-3800r/min离心18_22min,收集沉淀物,冷冻干燥,得金福燕粗多糖；(4)将步骤(3)所得金福菇粗多糖加入到18-22倍质量的蒸馏水溶解，按体积比1:1加入Sevag试剂，剧烈振荡25-35min, 3300-3800r/min离心18_22min,取上清液,浓缩、冷冻干燥得固体金福菇多糖。
2.根据权利要求I所述的天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法，其特征在于所述的固体金福菇多糖抗氧化活性检测a :将步骤(4)所得固体金福菇多糖配成10%溶液，用DEAE-Sephorase F. F凝胶柱纯化，上样量为10mL，0-lmol/LNaCl溶液梯度洗脱，流速为lmL/min，自动部份收集器收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测，经3. 5 X IO3Da的透析袋透析后，浓缩、冷冻干燥得到纯化的金福菇多糖TL-I ；b :将步骤a所得固体金福燕多糖配成O. 1%的溶液,过O. 22 μ m的过滤膜,用Superdex 200层析柱分离,O. 02mol/L PBS洗脱,流速lmL/min,波长215nm紫外检测，同时用苯酹-硫酸跟踪检测，收集的含糖组分用3. 5 X IO3Da的透析袋透析脱盐，透析液浓缩、冷冻干燥得两个金福菇多糖组分TL-2和TL-3 ；c :对得到的固体金福菇多糖TL-l、TL-2和TL-3进行体外抗氧化活性实验，结果表明 提取得到的金福菇多糖，尤其是TL-3，具有很高的清除超氧阴离子自由基及抑制小鼠红细胞溶血MEH和丙二醛MDA的产生的活性。
全文摘要
本发明公开了一种天然抗氧化剂金福菇多糖的制备方法，其包括以下步骤将金福菇烘至恒重，粉碎，过筛；然后将所得粉末热水浸提，提取液旋转蒸发浓缩，离心取上清液；最后将所得上清液浓缩，醇沉，离心，取沉淀物，冷冻干燥，得金福菇粗多糖。提取获得的金福菇多糖是抗氧化活性较高的天然产物，对邻苯三酚自氧化体系产生的 O2-有明显的清除作用，特别是组分TL-3，当浓度为500μg/mL时，清除率可达到75.6%，仅比Vc低15.4个点，可作为天然无毒抗氧化剂，应用于食品、医药和化妆品等领域。
文档编号C08B37/00GK102603908SQ20121001453
公开日2012年7月25日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者段培鲁, 王瑞君, 王翠, 翟天龙, 胡美丽, 陈彦 申请人:安徽大学