专利名称：磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法
技术领域：
本发明涉及一种磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法。
背景技术：
糖基磷酸酯类化合物，特别是葡萄糖基磷酸酯类化合物的合成及其生物活性的研究早有报道。研究表明多糖的磷酸酯类衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和免疫调节剂等生物活性。果糖、葡萄糖等单糖本身不具有抗肿瘤、抗病毒等生物活性，但对其磷酯化后就具有这些活性。Hayachi等发现葡萄糖基磷酸酯衍生物具有抗肿瘤、抗病毒等生物活性，并作为药物而应用于临床。磷酸果糖可用于治疗重型脑梗死、拮抗庆大霉素肾毒性以及用于辅助治疗心律失常等。陈茹玉等合成的N，N-二(2-氯乙基)果糖基磷酰胺酯的抗肿瘤活性实验结果表明该类化合物对L1210细胞和S-180腹水癌有一定的抑制作用。
在糖基上引入磷酸根，可使一些本无活性的糖类化合物具有了活性，并能提高某些多糖、寡糖的生物活性。因此就很有必要研究各种寡糖、多糖及其类似物的磷酸酯的生理功能，以期能够找到磷酰化后产物的生理功能的一些规律，研究磷酸基团在生理功能中的作用，为设计生理活性更好的磷酸酯衍生物提供参考数据。由于从自然界分离得到的寡糖或多糖的磷酸酯数量有限，种类也不多，影响对糖的磷酸酯的生物活性及磷酸酯在生物体内的作用进行系统的研究，为了深入研究糖的磷酸酯衍生物，转向了人工合成。但用人工合成磷酸酯化龙眼肉多糖的方法尚未见有报道。
发明内容
本发明目的是提供一种磷酸酯化龙眼肉多糖及其合成方法，它能够用人工合成的方法制备磷酸酯化龙眼肉多糖。本发明通过以下技术方案达到上述目的一种磷酸酯化龙眼肉多糖，该多糖由葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸、果糖和山梨糖组成，磷酸酯化龙眼肉多糖的分子量为112518. 5。该多糖的结构片段为
’4)- ct-D -Glcp-( I ’4)- α-D -GalpA -(I*·4)-α -D-Glcp-(I *4}-p-D -Glcp-( I —
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—^2VP~D~Fraf~(l—^2)~L~sorbose所述的磷酸酯化龙眼肉多糖的合成方法，包括如下步骤(I)龙眼肉多糖分离提取将龙眼干果剥壳去核，按质量体积比为龙眼肉蒸馏水=1 :4，采用热水提取，控制温度在90°C下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，65°C下旋转蒸发仪浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍于其体积的95%乙醇中，密封静置，醇沉物为龙眼肉粗多糖，(2)除蛋白及色素称取一定量的龙眼肉粗多糖用蒸馏水配制成5. 00g/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为Ig/ml,然后置于50°C恒温水浴锅中保温3h，最后于100°C灭酶5min，4000r/min离心15min,去掉沉淀物,合并上清液，即得去除蛋白多糖溶液，将已去除蛋白的粗龙眼肉多糖配成5. 00g/ml的水溶液，滴加30%H202去除色素，用量为多糖溶液体积的15. 00%，用O. IOmoI/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8. O,于45°C水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8. 0，4h后终止反应，冷至室温，用O. 10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5. 00g/ml，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量达35 40%，在冰箱中4°C放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45°C减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖，(3)去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖二乙胺基乙基纤维素柱分级纯化
二乙胺基乙基纤维素作为柱填料，柱参数为Φ2. 5cmX40cm，分别用双馏水、0. 125mol/L的NaCl、0. 30mol/L的NaOH溶液作为洗脱液进行洗脱，控制流速6s/滴，每10ml收集一管，用改良的苯酚-硫酸法跟踪检测，合并正态峰的收集液，50°C减压浓缩，浓缩液透析48小时后再浓缩、干燥，得到氯化钠馏分的龙眼肉多糖，(4)氯化钠流分的龙眼肉多糖丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱纯化取氯化钠流分的龙眼肉多糖，用Φ2. 0cmX40cm的丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱作进一步纯化，洗脱液为蒸馏水，洗脱条件为I滴/4s，洗脱流分分别进行减压浓缩后进行醇沉，离心，沉淀真空干燥，取第一个洗脱流分干燥后的多糖，命名为龙眼肉多糖A，并用龙眼肉多糖A进行磷酸酯化，(5)磷酸酯化龙眼肉多糖的合成配制0. 025g/ml的龙眼肉多糖A溶液，取I. OOml磷酸酯化试剂POCl3，加入3ml的吡啶，O°C反应15min后，缓慢加入0. 025g/ml的龙眼肉多糖A溶液20. 0ml，在(TC下进行反应60min，再加入浓度为lOmol/L的NaOH溶液调至pH=7. 0，再透析24h，除去游离的磷、盐和吡啶，透析结束后，倾出溶液，加入I. 5倍于倾出溶液的无水乙醇，醇沉，3000r/min离心lOmin，取沉淀物，再用90%的乙醇洗涤沉淀物3次，45°C减压干燥即得磷酸酯化龙眼肉多糖。本发明的有益效果在于 I.利用人工合成方法制备出磷酸酯化龙眼肉多糖。2.通过核磁共振、高效液相色谱、红外光谱初步分析龙眼肉多糖A的化学结构。并通过Sephadex G-100凝胶柱对磷酸酯化龙眼肉多糖进行分子量测定，红外光谱确定磷酸酯化龙眼肉多糖的结构。
图I是龙眼肉多糖A完全水解后的高效液相图谱。图2是单糖标准品的高效液相色谱图。图3是龙眼肉多糖A的13C-NMR。图4是龙眼肉多糖A的DEPT135。
图5是龙眼肉多糖A的HMBC。图6是龙眼肉多糖A的1HNMIL图7是龙眼肉多糖A的红外图谱。图8是磷酸酯化龙眼肉多糖后红外图谱。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。本发明所述磷酸酯化龙眼肉多糖的合成方法，包括如下步骤(I)龙眼肉多糖分离提取
将龙眼干果剥壳去核，按质量体积比为龙眼肉蒸馏水=1 :4，采用热水提取，控制温度在90°C下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，65°C下旋转蒸发仪浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍于其体积的95%乙醇中，密封静置，醇沉物为龙眼肉粗多糖，(2)除蛋白及色素称取一定量的龙眼肉粗多糖用蒸馏水配制成5. 00g/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为Ig/ml,然后置于50°C恒温水浴锅中保温3h，最后于100°C灭酶5min，4000r/min离心15min,去掉沉淀物,合并上清液，即得去除蛋白多糖溶液，将已去除蛋白的粗龙眼肉多糖配成5. 00g/ml的水溶液，滴加30%H202去除色素，用量为多糖溶液体积的15. 00%，用O. IOmoI/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8. O,于45°C水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8. 0，4h后终止反应，冷至室温，用O. 10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5. 00g/ml，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量达35 40%，在冰箱中4°C放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45°C减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖，(3)去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖二乙胺基乙基纤维素柱分级纯化二乙胺基乙基纤维素作为柱填料，柱参数为Φ2. 5cmX40cm，分别用双蒸水、
0.125mol/L的NaCl、0. 30mol/L的NaOH溶液作为洗脱液进行洗脱，控制流速6s/滴，每10ml收集一管，用改良的苯酚-硫酸法跟踪检测，合并正态峰的收集液，50°C减压浓缩，浓缩液透析48小时后再浓缩、干燥，得到氯化钠流分的龙眼肉多糖，(4)氯化钠流分的龙眼肉多糖丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱纯化取氯化钠流分的龙眼肉多糖,用Φ2. 0cmX40cm的丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱作进一步纯化，洗脱液为蒸馏水，洗脱条件为I滴/4s，洗脱流分分别进行减压浓缩后进行醇沉，离心，沉淀真空干燥，取第一个洗脱流分干燥后的多糖，命名为龙眼肉多糖A，并用龙眼肉多糖A进行磷酸酯化，(5)磷酸酯化龙眼肉多糖的合成配制0. 025g/ml的龙眼肉多糖A溶液，取I. OOml磷酸酯化试剂POCl3，加入3ml的吡啶，O°C反应15min后，缓慢加入0. 025g/ml的龙眼肉多糖A溶液20. 0ml，在(TC下进行反应60min，再加入浓度为lOmol/L的NaOH溶液调至pH=7. 0，再透析24h，除去游离的磷、盐和吡啶，透析结束后，倾出溶液，加入I. 5倍于倾出溶液的无水乙醇，醇沉，3000r/min离心lOmin，取沉淀物，再用90%的乙醇洗涤沉淀物3次，45°C减压干燥即得磷酸酯化龙眼肉多糖。单糖组成分析I.多糖的水解精确称取龙眼肉多糖A50.0mg置安瓿中，加5mL1.0mol/L三氟乙酸，封管，置102°C烘箱内水解6h，冷却至室温，转移到IOml量瓶中，用3mol/LNa0H溶液中和至pH=7.0后加水定容至刻度，摇匀，4000rpm离心lOmim，取上清液作为I-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化的供试品溶液。2.衍生物的制备配制对照品混合溶液，含甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖7种单糖对照品，每种单糖对照品的浓度均为O. 2mg/ml，分别精密吸取供试品溶液和对照品混合溶液各O. 4ml，置于不同的试管中，依次加入O. 4mL0. 5mol/LI-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液和O. 4ml0. 3mol/LNaOH溶液，混勻，置70°C水浴加热lOOmin，并不时振摇，取出后室温冷却lOmin，用O. 5ml0. 3mol/L HCl溶液中和，并加双蒸 水补充至2. Oml,加入5. Oml氯仿萃取,充分振荡，静置分层。取上层水相，过O. 45 μ m微孔滤膜。3.色谱条件色谱柱Agilent TC-C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m);柱温25°C ;检测器为紫外检测器=PD-IOA VP Plus ;检测波长250nm ;进样量10μ I ;流动相0. 05mol/L乙酸铵溶液+乙腈(80+20);流速:1. Oml/min ;洗脱时间35min从图2中可以得出高效液相色谱各标准品的出峰时间甘露糖10. 8min、鼠李糖14. 3min、半乳糖醒酸19. 5min、葡萄糖21. 8min、半乳糖24. 6min、木糖26. 3min、阿拉伯糖27. Omin0龙眼肉多糖A完全水解液高效液相分析图的洗脱峰与标准品洗脱峰对比，葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸三种单糖洗脱保留时间一致，且峰形明显，初步说明龙眼肉多糖A主要由葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸等组成。核磁共振NMR分析龙眼肉多糖A结构1HNMR 测试条件为 600MHz，22°C，溶剂为 DMS0_d6，13CNMR 测试条件为 125MHz，22°C，溶剂为DMS0-d6O由图S1HNMR可知,龙眼肉多糖A异头氢的化学位移5. 27ppm,5. 09ppm为α-卩比喃型糖残基的异头氢，4. 5Ippm为β -吡喃型糖残基的异头氢。由图 313CNMR(125MHz,22°C, DMS0_d6)和图 4DEPT135 可知，103. 60ppm，98. 03ppm,
95.82ppm,92. 13 和 92. 02 为糖环异头碳。103. 60ppm，98. 03ppm 的 C 在 DEPT135 中不出现峰，说明这两个化学位移的C是季碳，103. 60ppm为果糖的异头碳,98. 03ppm为山梨糖的异头碳，9(T67ppm的C峰为正峰,是糖环上的次甲基的碳,6(T65ppm的C峰为负峰，是糖环上亚甲基的碳。179. 93ppm是半乳糖醒酸6位上的C, 71. Ilppm为半乳糖醒酸4为上的C,从图5HMBC确定糖环的链接方式。表I为龙眼肉多糖A的1H NMR和13C NMR化学位移归属，表2为龙眼肉多糖A的HMBC数据分析。表I龙眼肉多糖A的1H NMR和13C NMR化学位移
权利要求
1.一种磷酸酯化龙眼肉多糖，其特征在于，该多糖由葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸、果糖和山梨糖组成，磷酸酯化龙眼肉多糖的分子量为112518. 5。
2.一种磷酸酯化龙眼肉多糖，其特征在于，该多糖的结构片段为
3.如权利要求I所述的磷酸酯化龙眼肉多糖的合成方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)龙眼肉多糖分离提取 将龙眼干果剥壳去核，按质量体积比为龙眼肉蒸馏水=I :4，采用热水提取，控制温度在90°C下提取4小时，过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，65°C下旋转蒸发仪减压浓缩，待提取液浓缩至粘稠状，趁热缓慢倒入4倍于其体积的95%こ醇中，密封静置，醇沉物为龙眼肉粗多糖， (2)除蛋白及色素 称取一定量的龙眼肉粗多糖用蒸馏水配制成5. OOg/ml溶液，往溶液中加入木瓜蛋白酶，使其终浓度为lg/ml,然后置于50°C恒温水浴锅中保温3h，最后于100°C灭酶5min，·4000r/min离心15min,去掉沉淀物,合井上清液，即得去除蛋白多糖溶液,将已去除蛋白的粗龙眼肉多糖配成5. OOg/ml的水溶液，滴加30%H202去除色素，用量为多糖溶液体积的·15. 00%，用O. IOmoI/L的NaOH溶液调节多糖液的pH值为8. O,于45°C水浴中反应，每隔·30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8. 0，4h后终止反应，冷至室温，用O. 10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度为5. 00g/ml，然后缓慢加入无水こ醇，使其含量达35 40%，在冰箱中4°C放置过夜，次日离心收集沉淀，经无水こ醇、丙酮反复洗涤后，45°C减压干燥，得到去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖， (3)去除蛋白及色素后的龙眼肉粗多糖ニこ胺基こ基纤维素柱分级纯化 用ニこ胺基こ基纤维素作为柱填料，柱參数为Φ2. 5cmX40cm，分别用双馏水、·0.125mol/L的NaCl、0. 30mol/L的NaOH溶液作为洗脱液进行洗脱，控制流速6s/滴，每IOml收集一管，用改良的苯酚-硫酸法跟踪检测，合并正态峰的收集液，50°C减压浓縮，浓缩液透析48小时后再浓缩、干燥，得到氯化钠流分的龙眼肉多糖， (4)氯化钠流分的龙眼肉多糖丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱纯化 取氯化钠流分的龙眼肉多糖，用Φ2. OcmX 40cm的丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱作进ー步纯化，洗脱液为蒸馏水，洗脱条件为I滴/4s，洗脱流分分别进行减压浓缩后进行醇沉，离心，沉淀真空干燥，取第一个洗脱流分干燥后的多糖，命名为龙眼肉多糖A，并用龙眼肉多糖A进行磷酸酯化， (5)磷酸酯化龙眼肉多糖的合成 配制0. 025g/ml的龙眼肉多糖A溶液，取I. OOml磷酸酯化试剂POCl3,加入3ml的吡啶，(TC反应15min后，缓慢加入0. 025g/ml的龙眼肉多糖A溶液20. 0ml，在(TC下进行反应60min，再加入浓度为lOmol/L的NaOH溶液调至pH=7. 0，再透析24h，除去游离的磷、盐和吡啶，透析结束后，倾出溶液，加入I. 5倍于倾出溶液的无水こ醇,醇沉，3000r/min离心IOmin,取沉淀物，再用90%的こ醇洗涤沉淀物3次，45°C减压干燥即得磷酸酯化龙眼肉多糖。
全文摘要
一种磷酸酯化龙眼肉多糖，由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、果糖和山梨糖组成，磷酸酯化龙眼肉多糖的分子量为112518.5。磷酸酯化龙眼肉多糖的合成方法，包括如下步骤(1)龙眼肉多糖分离提取，(2)除蛋白及色素，(3)龙眼肉多糖二乙胺基乙基纤维素柱分级纯化，(4)龙眼肉多糖丙烯葡聚糖凝胶S-300HR柱纯化。(5)用磷酸酯化试剂POCl3对龙眼肉多糖进行酯化。采用本发明能够用人工合成的方法制备磷酸酯化龙眼肉多糖，制备得的多糖含有葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、果糖和山梨糖。
文档编号C08B37/00GK102775513SQ20121030540
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者何舟, 唐小丽, 宁苑灵, 李福森, 李雪华, 肖庆, 蒋洁, 蒙法艳, 魏涌标, 黄燕军 申请人:广西医科大学