专利名称：一种高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法
技术领域：
本发明属于枸杞深加工技术领域，尤其是一种采用超细粉碎技术辅助制备高抗氧化活性枸杞多糖的方法。
背景技术：
枸杞(Lycium chinense Mill)属爺科,是我国传统的药食兼用的名贵中药材，其味甘、性平，具有补肝肾、益精血和明目的功能。枸杞的药理和保健作用与其中的生物活性物质多糖有很大关系。现代科学研究表明，枸杞多糖具有调节免疫、清除自由基、抑制肿瘤、延缓衰老、降血脂、降血糖和抗疲劳等作用，具有广阔的开发应用前景。多糖的结构是影响其生物学活性的重要因素，此外其理化性质如黏度、溶解度等
也在一定程度上决定着多糖活性。多糖溶于水是其发挥生物学活性的首要条件，有研究表明，通过降低分子质量、引入支链或对支链进行适当修饰，均可提高多糖溶解度，从而增强其活性。多糖分子质量越大，分子体积越大，不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性，但也并不是多糖分子质量越低越好，因为分子质量过低，无法形成产生活性的聚合结构，Alban等人研究了分子质量与硫酸化凝结多糖抗凝血活性的关系，认为抗凝血活性与相对分子质量呈哑铃型曲线关系；不同的多糖产生生物学活性的最佳相对分子质量的范围不同，Gao等人报道，硫酸化凝结多糖在相对分子质量为(7 11) X IO3内，随着相对分子质量升高，其抗凝血活性有增强的趋势，从细菌中分离的某种果聚多糖Levans，相对分子质量达到2. IXlO5时抑制肿瘤生长的活性最强。研究表明，多糖抗氧化活性与多糖的分子量、单糖组成、糖醛酸含量、糖苷键类型、链构象等分子结构有密切关系。而分子量大小是影响抗氧化活性强弱的一个重要结构特征参数，且在一定范围内，分子量越低，则抗氧化活性越强。例如，周村山等人采用超声波技术提取条形斑紫菜多糖，其分子量降低，多糖抗氧化性相应提高；曾伟才等采用微波辅助法提取的木耳多糖，分子量为2. 77X IO4Da,实验表明其抗氧化能力较显著。现代加工技术的发展和应用使多糖原料的前处理更加精细化，比如，超细粉碎和纳米粉碎技术的应用可以极大的破坏细胞结构，甚至打破细胞壁，使存在于细胞壁内部的多糖暴露出来，提高多糖的提取得率。通过加工技术的应用改变了多糖提取得率的同时，也就改变了多糖提取物中的分子组成、平均分量、糖苷键比例、支化度等结构特点，进而改变了多糖提取物的水溶性、流变学特性、热学特性、胶体特性等加工特性及其生物活性。超细粉碎技术是近年来国际上迅速发展起来的一项高新技术。超细粉碎是指利用机械或流体动力的方法将物料颗粒粉碎至lnm-100 μ m的过程。物料经超细粉碎后由于存在表面效应、小尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应，具备一般颗粒所不拥有的一些特殊的理化性质，如良好的溶解性、分散性、吸附性等。Li等人利用高频振动式超微粉碎制得了微细化的魔芋葡甘聚糖，发现微细化的魔芋葡甘聚糖晶体结构和溶胀特性都发生了改变，而球磨的样品显著地降低了肥胖小鼠的体重，并且血液中甘油三酸酯、葡萄糖和高密度脂蛋白的含量也均有显著降低，说明微细化魔芋葡甘聚糖可以用于减肥产品的开发。梅光明等利用超微粉碎技术对茯苓多糖和茯苓粉进行微细化处理，比较处理前后其理化性质的变化，经红外扫描图谱鉴定，超微粉碎后的茯苓多糖红外吸收图谱发生变化，多糖溶出率增力口，这有利于提闻获茶在食品中的加工性能。由于多糖所具有的多种优良理化特性和生物学活性，因而可以作为增稠剂、稳定齐U、功能因子、代脂肪、成膜剂等被广泛应用于食品加工。而生产多糖所采用的各种高新技术对于多糖的分子结构和生物活性又有显著影响，进而影响到多糖在食品加工中的应用特性。因此，有必要深入开展加工技术对于枸杞多糖结构和生物活性的影响，开发出高抗氧化性枸杞多糖的生产技术，从而指导枸杞多糖的生产和在食品中的应用。通过检索，发现两篇与本发明相关的专利文献。
I、一种枸杞多糖提取方法及枸杞多糖减肥制品(CN1670036)，主要包括以下步骤枸杞子用乙醇溶液预处理；经过预处理的枸杞子用蒸馏水提取；将提取液用聚酰胺、DEAE-ceIlulose (0H-)和SephadexG_25凝胶色谱柱进行处理。枸杞多糖减肥制品是以枸杞多糖为功能成分，配以相应的辅料，按照常规技术制成。该方法不仅能够提高枸杞多糖的纯度，而且可以利用该多糖制成减肥制品。另外，由于本发明提供的枸杞多糖减肥制品是由纯天然物质制成，因而患者服用后无副作用，而且减肥效果明显。2、一种以枸杞酒渣为原料制备高免疫调节活性枸杞多糖的酶解工艺(CN101069562)，其工艺特征为用水提醇沉法提取枸杞酒渣中的初多糖；加入浓度为
O.004 O. 01 %的糖化酶液，于30 50°C水解15 40min ;将水解液煮沸lOmin，再加入95%乙醇沉淀(醇沉浓度为80% )，静置10 18小时；3000r/min离心15min，取沉淀物，真空干燥即得棕色高免疫调节活性酶解枸杞多糖(重均分子量I 3万)。本发明以枸杞酒渣为原料，提高了资源利用率，与现有技术相比，利用了枸杞多糖的生理活性与其分子量关系密切，通过酶解技术改变其分子量，将枸杞初多糖酶解为高免疫调节活性的枸杞多糖，本工艺简单，操作方便，枸杞多糖得率高，免疫调节活性强。通过对比，本发明专利申请与上述两篇专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种工艺简单，操作方便，所制得的枸杞多糖得率高、抗氧化活性强，采用超细粉碎前处理的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，在制备过程中枸杞子经超细粉碎前处理。而且，所述枸杞子经超细粉碎前处理后，90-99%的枸杞子颗粒小于700nm。而且，所述超细粉碎前处理具体步骤为枸杞子经粗粉碎，在45 °C下低温烘干3_5h，高能纳米冲击磨粉碎5-7h。而且，具体步骤如下⑴超细粉碎前处理枸杞子经粗粉碎，低温烘干，高能纳米冲击磨粉碎，粉碎后使90%以上的枸杞子颗粒小于700nm ；
⑵乙醇前处理向经超细粉碎处理的枸杞加入体积分数为80%的乙醇水溶液，料液比例g:mL为I :2-4，回流提取，弃去上清液，下层不溶物重复上述操作，得到前处理后的枸杞子；⑶水提取水与经过前处理的枸杞子按照比例mL:g为4飞1混合后，水浴浸提后，过滤，收集滤液，不溶物重复上述操作2次，合并滤液；⑷真空浓缩真空度〈O. IMPa，45飞5°C下将步骤⑶中滤液浓缩到可溶性固形物含量大于10%,得浓缩液；(5)乙醇沉淀于搅拌条件下向浓缩液中缓慢加入乙醇，使乙醇的终体积浓度大于80%，静置6小时以上，分离后，收集固体物质，挥发去除乙醇得枸杞粗多糖；(6)蛋白质脱除采用聚酰胺色谱柱法或Sevag法脱除蛋白质，浓缩到质量分数为5%以上，真空冷冻干燥，得枸杞多糖；
(7)乙醇分级沉淀将枸杞多糖配成质量浓度为2. 5%的枸杞多糖溶液，边搅拌边加入体积浓度为95%以上的乙醇，使乙醇体积浓度达到60%，静置6小时以上，分离，收集上清液，继续加入浓度为95% (v/v)以上的乙醇，至乙醇浓度达到80% (v/v)，静置6小时以上，分离，收集沉淀，挥发去除乙醇，冷冻干燥后得枸杞多糖。而且，所述步骤中⑴中枸杞子经粗粉碎，在45°C下低温烘干4h，高能纳米冲击磨粉碎6h。而且，所述步骤中⑵中料液比例g :mL为I :3，于80°C水浴回流提取O. 5h，弃去上
清液，下层不溶物重复上次操作4次。而且，所述步骤中⑶水浴浸提的条件为95°C水浴浸提95min。而且，所述步骤中(5)或(7)中分离为3400r/min离心10分钟以上，或过滤处理。而且，所述步骤中(6)中聚酰胺色谱柱法除蛋白的具体步骤为将枸杞粗多糖溶解至质量浓度为1%_2%，将其加入聚酰胺色谱柱，上样量为柱容量的15%-20%，以水洗脱，收集洗脱液，浓缩到质量分数为5%以上。而且，所述步骤中(6)中Sevag法除蛋白的具体步骤为取枸杞粗多糖，加水完全溶解，依次加入氯仿和正丁醇，多糖溶液氯仿正丁醇的体积比为25 5 :1，剧烈振摇20min静置分层，倾出上清液，弃去下层有机溶液和中间变性蛋白质层，上清液重复操作数次，直至无变性蛋白质出现为止，收集上清液，真空浓缩到质量分数为5%以上。本发明的优点和积极效果是I、本发明制备方法以枸杞为原料，采用超细粉碎技术降低多糖分子量，制备高抗氧化性枸杞多糖的工艺简单，操作方便。2、本制备方法所采用的乙醇分级沉淀方法具有得率高、低成本的优势，有望实现工业化应用。3、本发明制备方法所制备得到的枸杞多糖得率高，抗氧化活性强，与未经超细粉碎前处理的枸杞多糖比较，本方法所获得的枸杞多糖对DPPH自由基的半数抑制浓度(IC5tl)降低60%以上，对ABTS自由基的IC5tl值降低70%以上。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明实施例中所使用的试剂如无特殊说明，均为市售产品；所使用的试验方法，如无特殊说明均为常规方法；所使用的仪器如无特殊说明，均为常规仪器。实施例I :一种高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，具体步骤如下⑴超细粉碎前处理枸杞子经粗粉碎，在45°C下低温烘干3h，高能纳米冲击磨粉碎5h，粉碎后使90%以上的枸杞子颗粒小于700nm。⑵乙醇前处理称取200g经上述加工处理的枸杞，加入80% (V/V)的乙醇水溶液，料液比例g:mL为I :2 (g枸杞超细粉v乙醇溶液)，于80°C水浴回流提取O. 5h，弃去上清液，下层不溶物重复上次操作4次，得到前处理的枸杞子；⑶水提取经乙醇处理的枸杞子，挥发去除乙醇，加入蒸馏水，料/液比为(4飞)1CmL蒸馏水g枸杞子)，于95°C水浴浸提95min，过滤，收集滤液，不溶物重复上述操作2次，合并收集滤液；⑷真空浓缩在真空度〈O. lMPa，45飞5°C下浓缩，使提取液的可溶性固形物达到10%以上，得浓缩液；(5)乙醇沉淀于搅拌条件下缓慢加入乙醇到浓缩液中，使乙醇浓度大于80%，4°C静置12h，过滤，收集固体物质，挥发去除乙醇，即得枸杞粗多糖；(6)蛋白质脱除将得到的枸杞粗多糖，加蒸馏水完全溶解，得枸杞粗多糖溶液，加入Sevag试剂(枸杞粗多糖溶液氯仿正丁醇的体积比为25 5 :1，)，剧烈振摇20min静置，于转速3400r/min下离心15min,倾出上清液,弃去下层有机溶液和中间蛋白变性层，上清液重复操作数次，直至无变性蛋白质出现为止，收集上清液，浓缩到质量分数为5%以上，经冷冻干燥，得枸杞多糖；(7)乙醇分级沉淀将枸杞多糖配制成2. 5%的水溶液，搅拌下加95% (V/V)乙醇至乙醇浓度达到60% (v/v)，4°C静置6h，过滤，收集上清液，上清液中继续加入乙醇至其浓度达到80% (v/v)，4°C静置6h，过滤，收集沉淀，挥发去除乙醇，冷冻干燥，得高抗氧化活性枸杞多糖。通过检测所制备得到的高抗氧化活性枸杞多糖的得率为I. 5-1. 8g/100g原料；其数均平均分子量为54万,分子中的糖醒含量为41. 2%,中性糖含量为28. 8%,蛋白质含量为I. 6%,由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成。以上述方法获得的枸杞多糖对DPPH自由基的半数抑制浓度(IC5tl)降低60%以上(由9. Omg/mL降低至3. 5mg/mL以下),对ABTS自由基的IC5tl值降低70%以上(由3. 2mg/mL降低至O. 9mg/mL以下)。实施例2 一种高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，步骤是⑴超细粉碎前处理枸杞子经粗粉碎，在45°C下低温烘干4h，高能纳米冲击磨粉碎6h。粉碎后使90-99%的枸杞子颗粒小于700nm之间。⑵乙醇前处理经超细粉碎处理的枸杞加入80% (V/V)的乙醇水溶液，料液比例为I 3g/v,于80°C水浴回流提取O. 5h，弃去上清液，下层不溶物重复上次操作4次，得到前处理的枸杞子；
⑶水提取水与经过前处理的枸杞多子的比例为(4飞)1 (mL:g)，于95°C水浴浸提95min，过滤，收集滤液，不溶物重复上述操作2次，合并收集滤液；⑷真空浓缩真空度〈O. IMPa,45 55°C下将提取液浓缩到10%以上；(5)乙醇沉淀于搅拌条件下缓慢加入乙醇到浓缩液中，使乙醇浓度大于80%，4°C静置12h，3400r/min离心，收集固体物质，挥发去除乙醇，得枸杞粗多糖。(6)蛋白质脱除取一定量的粗多糖,加蒸懼水完全溶解,加入Sevag试剂(溶液氯仿正丁醇=25 5 :1),剧烈振摇20min静置,于转速3400r/min下离心15min,收集上清液，上清液重复操作数次，直至无变性蛋白质出现为止。收集上清液，真空浓缩冷冻干燥，得枸杞多糖； (7)乙醇分级沉淀精确称取Ig精制枸杞多糖，加入40mL蒸馏水溶解，搅拌下加95% (V/V)乙醇调醇体积分数为60%，4°C静置6h，3400r/min离心15min，收集上清液，上清液中继续加入乙醇，使其浓度达到80%(v/v)，4°C静置6h，离心，收集沉淀，挥发除去乙醇，冷冻干燥，得高抗氧化活性枸杞多糖。通过检测所制备得到的高抗氧化活性枸杞多糖的得率为I. 5-1. 8g/100g原料；其数均平均分子量为54万,分子中的糖醒含量为41. 2%,中性糖含量为28. 8%,蛋白质含量为I. 6%,由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成。以上述方法获得的枸杞多糖对DPPH自由基的半数抑制浓度(IC5tl)降低60%以上(由9. Omg/mL降低至3. 5mg/mL以下),对ABTS自由基的IC5tl值降低70%以上(由3. 2mg/mL降低至O. 9mg/mL以下)。实施例3 一种高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，具体步骤如下⑴超细粉碎前处理枸杞子经粗粉碎，在45°C下低温烘干7h，高能纳米冲击磨粉碎6h，粉碎后使90%以上的枸杞子颗粒小于700nm。⑵乙醇前处理称取200g经上述加工处理的枸杞，加入80% (V/V)的乙醇水溶液，料液比例g:mL为I :4 (g枸杞超细粉v乙醇溶液)，于80°C水浴回流提取O. 5h，弃去上清液，下层不溶物重复上次操作4次，得到前处理的枸杞子；⑶水提取经乙醇处理的枸杞子，挥发去除乙醇，加入蒸馏水，料/液比为(4飞)1CmL蒸馏水g枸杞子)，于95°C水浴浸提95min，过滤，收集滤液，不溶物重复上述操作2次，合并收集滤液；⑷真空浓缩在真空度〈O. lMPa，45飞5°C下浓缩，使提取液的可溶性固形物达到10%以上，得浓缩液；(5)乙醇沉淀于搅拌条件下缓慢加入乙醇到浓缩液中，使乙醇浓度大于80%，4°C静置12h，过滤，收集固体物质，挥发去除乙醇，即得枸杞粗多糖；(6)蛋白质脱除将得到的枸杞粗多糖，加蒸馏水完全溶解，至质量浓度为1%_2%，得枸杞粗多糖溶液，将其加入聚酰胺色谱柱，上样量为柱容量的15%-20%，以水洗脱，洗脱流速为4h-5h —个柱体积，以硫酸苯酚法检测，当有糖随流动相流出时开始收集洗脱液，至不再有糖被洗脱时为止，将所收集的洗脱液真空浓缩到质量分数为5%以上，经冷冻干燥，得枸杞多糖；(7)乙醇分级沉淀将枸杞多糖配制成2. 5%的水溶液，搅拌下加95% (V/V)乙醇至乙醇浓度达到60% (v/v)，4°C静置6h，过滤，收集上清液，上清液中继续加入乙醇至其浓度达到80% (v/v)，4°C静置6h，过滤，收集沉淀，挥发去除乙醇，冷冻干燥，得高抗氧化活性枸杞多糖。通过检测所制备得到的高抗氧化活性枸杞多糖的得率为I. 5-1. 8g/100g原料；其数均平均分子量为54万,分子中的糖醒含量为41. 2%,中性糖含量为28. 8%,蛋白质含量为I. 6%,由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成。以上述方法获得的枸杞多糖对DPPH自由基的半数抑制浓度(IC5tl)降低60%以上(由9. Omg/mL降低至3. 5mg/mL以下),对ABTS自由基的IC5tl值降低70%以上(由3. 2mg/mL降低至O. 9mg/mL以下)。
权利要求
1.一种高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于在制备过程中枸杞子经超细粉碎前处理。
2.根据权利要求I所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于所述枸杞子经超细粉碎前处理后，90-99%的枸杞子颗粒小于700nm。
3.根据权利要求I所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于所述超细粉碎前处理具体步骤为枸杞子经粗粉碎，在45°C下低温烘干3-5h，高能纳米冲击磨粉碎5-7h。
4.根据权利要求I至3任一项所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于具体步骤如下 ⑴超细粉碎前处理枸杞子经粗粉碎，低温烘干，高能纳米冲击磨粉碎，粉碎后使90-99%的枸杞子颗粒小于700nm ； ⑵乙醇前处理向经超细粉碎处理的枸杞加入体积分数为70-90%的乙醇水溶液，料液比例g :mL为I :2-4，回流提取，弃去上清液，下层不溶物重复上述操作，得到前处理后的枸杞子; ⑶水提取水与经过前处理的枸杞子按照比例ml:g为4飞1混合后，水浴浸提后，过滤，收集滤液，不溶物重复上述操作2次，合并滤液； ⑷真空浓缩真空度〈O. IMPa，45飞5°C下将步骤⑶中滤液浓缩到可溶性固形物含量大于10%，得浓缩液； (5)乙醇沉淀于搅拌条件下向浓缩液中缓慢加入乙醇，使乙醇的终体积浓度大于80%，静置6小时以上，分离后，收集固体物质，挥发去除乙醇得枸杞粗多糖； (6)蛋白质脱除采用聚酰胺色谱柱法或Sevag法脱除蛋白质，浓缩到质量分数为5%以上，真空冷冻干燥，得枸杞多糖； ⑴乙醇分级沉淀将枸杞多糖配成质量浓度为2. 5%的枸杞多糖溶液，边搅拌边加入体积浓度为95%以上的乙醇，使乙醇体积浓度达到60%，静置6小时以上，分离，收集上清液，继续加入体积浓度95%以上的乙醇，至乙醇浓度达到体积浓度80%，静置6小时以上，分离，收集沉淀，挥发去除乙醇，冷冻干燥后得枸杞多糖。
5.根据权利要求4所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于所述步骤中⑴中枸杞子经粗粉碎，在45°C下低温烘干4h，高能纳米冲击磨粉碎6h。
6.根据权利要求4所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于所述步骤中⑵中料液比例g :mL为I :3，于80°C水浴回流提取O. 5h，弃去上清液，下层不溶物重复上次操作4次。
7.根据权利要求4所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于所述步骤中⑶水浴浸提的条件为90-100°C水浴浸提90-100min。
8.根据权利要求4所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于所述步骤中(5)或(7)中分离为3400r/min离心10_50min,或过滤处理。
9.根据权利要求4所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于所述步骤中(6)中聚酰胺色谱柱法除蛋白的具体步骤为将枸杞粗多糖溶解至质量浓度为1%_2%，将其加入聚酰胺色谱柱，上样量为柱容量的15%-20%，以水洗脱，收集洗脱液，浓缩到质量分数为 5-20%ο
10.根据权利要求4所述的高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，其特征在于所述步骤中(6)中Sevag法除蛋白的具体步骤为取枸杞粗多糖，加水完全溶解，依次加入氯仿和正丁醇，多糖溶液氯仿正丁醇的体积比为25 5 :1，剧烈振摇20min静置分层，倾出上清液，弃去下层有机溶液和中间变性蛋白质层，上清液重复操作数次，直至无变性蛋白质出现为止，收集上清液，真空浓缩到质量分数为5-20%。
全文摘要
本发明涉及一种高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法，在制备过程中枸杞子经超细粉碎前处理、乙醇前处理、水提取、真空浓缩、乙醇沉淀、蛋白质脱除、乙醇分级沉淀处理制备得到高抗氧化活性枸杞多糖。本发明制备方法以枸杞为原料，采用超细粉碎技术降低多糖分子量，制备高抗氧化性枸杞多糖的工艺简单，操作方便；本制备方法所采用的乙醇分级沉淀方法具有得率高、低成本的优势，有望实现工业化应用。
文档编号C08B37/00GK102936292SQ20121047695
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者张民, 王芳 申请人:天津科技大学