专利名称：一种螺旋藻多糖的提取方法
技术领域：
本发明涉及同时获得多种分子量范围的螺旋藻多糖的提取方法。所制的不同规格的多糖可用于药品、食品、保健品及化妆品等。
背景技术：
螺旋藻是海洋中古老的单细胞藻类，含有大量的氨基酸、蓝藻素、类胡萝卜素、Y亚麻酸、肌醇等营养物质。螺旋藻多糖是从螺旋藻藻体、螺旋藻培养液中提取分离出来的一类具有促进细胞生长、提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功能的重要天然生物活性物质，有防治多种疾病同时还能显著增强机体免疫力的双重作用。螺旋藻中存在大量的蛋白质，和多糖一样均属于高分子物质，部分水溶性蛋白质和多糖一起被溶剂提取出来。去掉蛋白质是螺旋藻多糖提纯的关键步骤，常利用氯仿正丁醇的二元溶剂体系或三氯乙酸使蛋白质变性析出。前者使用的溶剂有一定毒性且具强挥发性，给环境和操作人员一定的危害；后者使用的三氯乙酸有一定毒性，脱蛋白后生产的盐与多糖类似的溶解性，去除困难，也有一定的毒性，因此该方法得到的粗品运用受到限制。常利用多糖不溶于乙醇的特性对螺旋藻多糖粗提物进行精制，但该法所得到的多糖纯度不高，无法除尽蛋白质，还会掺杂色素、胶质等其他杂质，而且所得物分子量范围较宽。还有利用DEAE纤维素柱离子交换层析法、葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶的凝胶柱层析等分离得纯度高的、不同分子量范围的多糖。但由于柱填料价格昂贵，大批量生产需要较多根柱子，生产成本超高，分离操作无法自动化 ，生产周期较长。而且柱层析需耗费大量的酸碱再生树脂，造成二次污染，能耗大、成本高。该法不太适合大规模的多糖原料制备，仅适合实验室和中小试运用。大多数提取方法为了提高多糖的收率，会采取偏碱性条件下进行提取，之后再通过调酸中和，如1994年公开的专利“螺旋藻多糖的提取方法”(授权公告号为CN1056852C)中采用氢氧化钠、氢氧化钾等强碱进行提取；2012年公开的专利“螺旋藻多糖的应用”(申请号201210134354.6)中S180小鼠移植模型的药效学试验中研究过螺旋藻水提多糖的相对肿瘤增值率T/C (%)高于螺旋藻碱提多糖，也就是说中性条件下提取得到的多糖对肿瘤的抑制作用优于碱性条件下。虽然碱性溶剂的提取方法可以提高提取的收率，PH值较高时破坏多糖的结构，最终得不到活性最强的多糖，不能全完发挥螺旋藻多糖的优势。1994年公开的专利“从螺旋藻中提取蛋白质和多糖的方法”(授权公告号为CN1036067C)中使用低温浸泡提取同时得到蓝藻蛋白和螺旋藻多糖，该方法虽然简单，但是低温浸泡提取提取效率低，所得的螺旋藻含量较低。2008年公开的专利“一种水溶性螺旋藻多糖的提取方法”(公开号为CN101575626A)中使用冷冻离心法，调酸和酶解的方法获得螺旋藻多糖，该方法通过酶水解蛋白质，提高多糖的收率。但是酶价格昂贵，生产成本增高。酶解会造成蛋白质水解为水溶性的多肽或是水溶性氨基酸。由于分子量接近，而且与多糖同样溶于水，无法有效分离，导致多糖纯度降低。而且酶提取法要求的条件苛刻，容易失活，对实验设备要求高，不适合大规模工业化生产。
所报道的螺旋藻多糖的方法虽然很多，各有利弊。但目前没有一种可以保证产品杂质少、纯度高、高生物活性、低成本的，且可以实际运用于大生产的工艺路线。对于食品和药品安全性意识益增的今天，质量和成本都是企业的生命线。一种可以运用于工业化生产中，能有效保证螺旋藻多糖的活性、生产操作简单、对环境和产品无污染的、产品收率和纯度高的提取方法，是保证产品品质和成本所必须的，也是企业迫切需要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经济、节约能源、无环境污染、安全无毒、提取率高、纯度高、保留生物活性成分的高效价的，可进行工业化生产的螺旋藻多糖提取方法。本发明的技术方案为:
同时获得多种纯度规格的螺旋藻多糖的提取方法按以下步骤进行:
(一)螺旋藻粗多糖的制备
(1)取螺旋藻，加4-10倍量的95%乙醇，回流提取f3次，每次f 3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水4-20倍量，提取I飞次，每次2 10小时，提取温度为6(TlO(rC，合并提取液，于彡15000 r/min转速下离心,上清液合并,备用；
(2)取上述(I)得到上清液合并液，过<1.5μπι的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万以上分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机流出液和超滤机内的浓缩液，干燥，得到I种以上的水提螺旋藻粗多糖，总糖含量> 10%，分子量为
0.5万以上；
(二)高纯度螺旋藻多糖的制备
(1)取螺旋藻，加4-10倍量的95%乙醇，回流提取f3次，每次f 3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水4-20倍量，提取I飞次，每次2 10小时，提取温度为6(TlO(rC，合并提取液，于彡15000 r/min转速下离心,上清液合并,备用；
(2)取上述(I)得到上清液合并液，浓缩，除杂处理，处理后的溶液于彡15000r/min转速下离心，取上清液，过<1.5 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万至20万分子量间的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机流出液和超滤机内的浓缩液，干燥，得到I种以上的水提螺旋藻多糖，总糖含量> 40%，分子量为0.5万 20万。(3)上述的浓缩，可以是利用加热使上清液合并液体积减少至螺旋藻投料量的5倍以下。或将上清液合并液通过<1.5μπι的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量以上的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液。(4)上述的除杂处理，可以是在浓缩物中加入50 95%的乙醇至醇度达到40_90%，搅匀，静置12 72小时，于彡15000 r/min转速下离心，收集沉淀，加水溶解。也可以在浓缩物中加入蛋白沉淀剂，加热0.5^3小时，于彡5°C下冷藏12 72小时，于彡15000 r/min转速下离心分离沉淀，上清液中再加入蛋白沉淀剂，加热，冷藏，此除杂操作重复多次至无明显沉淀析出。上清液加入20%的氢氧化钠水溶液或10%盐酸溶液调pH值至中性。所述的蛋白沉淀剂，可使用1-50%三氯乙酸水溶液或0.1-50%的硫酸铵溶液或是0.1-10%的氢氧化钠水溶液其中的一种或几种。 上述的超滤，可根据产品所需不同分子量范围，将超滤得到的浓缩液再反复进行超滤。2次以上连续超滤操作时，超滤机流出液即为前后两种分子量间的浓缩成分。超滤机内的浓缩液即为选用分子量以上的多糖成分。本发明步骤(I)为提取工艺:利用乙醇回流提取去除脂溶性成分，提高多糖的提取率。利用水直接提取，不改变溶剂的酸碱度，不影响多糖的结构，获得活性最强的多糖。步骤(2)利用离心和微孔滤膜过滤去除溶液中的固体物质，有效提高超滤的效率。通过第一道的离心、微孔过滤和超滤的联用，获得总糖含量> 10%，分子量为0.5万以上的多糖和水溶性蛋白质混合物，该部分中的蛋白质也有一定的生理活性，因此该混合物可作为要求成分营养丰富的食品、保健品、化妆品等产品的原料。相比其他传统的粗提方法，该方法操作简单，不需要加热也不需要加入试剂，尽可能的保持了多糖和水溶性蛋白质的活性。另外提取过程中还可获得低分子量的如水溶性维生素等其他水溶性附加产物。如果需要进一步对多糖纯度分级，将含有粗品的溶液，通过除杂处理，去除蛋白质，提高螺旋藻多糖的含量。除蛋白质的过程中会生成三氯乙酸钠、氯化钠等盐，还有留有过量的三氯乙酸、硫酸铵等蛋白沉淀剂。离心、微孔过滤去除不溶性杂质或是变性的大分子蛋白质胶体。利用超滤滤材膜不同分子量的截留范围，从水和其他液体中分离出很小的胶体和大分子。借此除去三氯乙酸钠、氯化钠、三氯乙酸、硫酸铵等低分子量的水溶性杂质，起到脱盐的作用。被截住的大分子量的浓缩物，还可以使用分子量更大的的膜材继续超滤，起到分级和浓缩作用，最终获得总糖含量> 40%，多分子量范围的高纯度多糖。该工艺可生产作为对原料纯度要求高的保健品和药品的原料。本发明与现有技术相比，有以下优点:1、传统分离方法获得的多糖需要检测才能知道大概的分子量范围，而且是各种分子量的混合体；而且本发明可以根据对产品纯度不同的需求，在工艺路线不同的阶段选择合理的处理措施，不需要检测即可获得预定分子量规格的高纯度多糖，而且可以同时获得多种规格。这是其他传统方法所不可能达到的优势。2、利用乙醇回流提取去除螺旋藻中的脂溶性成分的前处理，保证了水提取多糖时，杂质减少，更利于多糖的提取。利用水从螺旋藻中提取多糖，通过温度的控制，保证了螺旋藻多糖不被破坏。提取阶段的收率与碱法提取率接近，并远高于低温提取方法。获得的多糖活性高于碱水提取的。3、将螺旋藻水提取液通过离心、微滤、超滤的联用处理后，得到含蛋白质较多的多糖粗提物:相比传统的粗提取，操作过程中无高温，无化学变化，尽可能保证提取过程中多糖和蛋白质活性没有被破坏，保持活性不变，并成分高度富集。同时还可获得其他低分子水溶性成分的附加产物。4、螺旋藻水提取液浓缩后，利用乙醇、三氯乙酸、氢氧化钠、亚硫酸铵使蛋白质变性，通过离心、微滤、超滤的联用，先离心、微孔过滤去除不溶性杂质或是变性的大分子蛋白质胶体。利用超滤滤材膜不同分子量的截留范围，去除除蛋白质过程过产生的小分子量的盐，如三氯乙酸钠、氯化钠等盐，甚至将分子量较低的多余的蛋白质沉淀剂如三氯乙酸、亚硫酸铵等也一并去除。除杂效果彻底，过程安全、无污染、无残留。也不增加新的杂质，也没有传统有机溶剂法的试剂残留问题。所获得多糖纯度高、规格多、不破坏多糖的生物活性。该发明方法有效弥补了常规化学除蛋白质方法留有残留物不易除尽的缺陷。
5、传统分离方法由于柱子填料贵，柱层析操作不连续，难以工业化生产。本发明通过离心、微滤、超滤的联用，由于受渗透压的阻碍作用小，所以在相当低的压力差下，仍具有高流通率。因此，生产连续自动化操作，耗能低，生产周期短。超滤膜材本身无毒，具有孔径分布率窄，分离精度高，抗微生物能力强，化学稳定性好，机械强度大，膜易再生，使用寿命长，清洁方便等优点，因此降低了生产成本，给生产操作带来便捷，还可弥补其他方法的诸多缺点。6、 本发明可以选择不同分子量截流值的超滤滤材，实现多糖的进一步分级纯化，具有分离效率高、无副作用、设备简单、操作简便等优点，分级可连续进行:如先进行I万分子量的超滤，超滤浓缩液再通过2万分子量的超滤，再将超滤浓缩液通过5万分子量的超滤，再将超滤浓缩液通过8万分子量的超滤，再将超滤浓缩液通过10万分子量的超滤，最终可以得到1-2万、2-5万、5-8万、8-10万这四种分子量范围的多糖提取物。本发明可同时获得多种分子规格的高纯度的螺旋藻多糖，这是以往提取分离方法所不具备的。7、本发明中化学除蛋白与离心-微孔过滤-超滤技术联用，使得分离所得的多糖收率高、纯度高、保留生物活性成分的高效价。相比凝胶柱层析和离子交换树脂层析等常用精制方法，生产周期明显缩短、成本和能耗更低、设备简单、无污染、无残留。生产操作简单，可连续自动化生产，更适合工业化生产的需要。8、螺旋藻游浮于水体中生产，吸收了较多水中的微生物，虽然提取过程中也会使部分微生物灭活。但残留部分会使提取液容易变质，甚至残留到产品中使产品很快微生物超标。传统工艺制的多糖需要通过高温、紫外线、辐射等手段来减少微生物。而本发明不需要单独对产品进行灭菌，微孔滤膜和超滤过程本身可以有效去除产品中微生物，可以抑制环境中的病毒、细菌、热源、内毒素的产生，降低最终产品被微生物污染的机会，增强的产品稳定性，延长保存期限 。这是其他提取分离方法所不具备的。总之，从经济、清洁、环保的生产环境要求及可获得多层次、高质量产品两方面来看，本发明的方法非常适合螺旋藻多糖粗提物或精提物的大生产运用。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但本发明不限于实施例。实施例1
取螺旋藻100kg，加4倍量的95%乙醇，回流提取I次，每次I小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水4倍量，提取I次，提取2小时，提取温度为60°C，提取液于15000 r/min转速下离心，上清液，过1.5 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，干燥，得到水提螺旋藻粗多糖17kg,总糖含量12%,分子量为0.5万以上。实施例2
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小时，提取温度为100°C，合并提取液，于9000 r/min转速下离心，上清液合并，过1.2 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择I万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液和流出液。分别干燥，得到分子量5万以上的水提螺旋藻粗多糖8kg，总糖含量15% ;分子量1-5万间的水提螺旋藻粗多糖10kg，总糖含量25%。
实施例3
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小时，提取温度为100°C，合并提取液，于15000 r/min转速下离心，上清液合并，加热使其体积减少至螺旋藻投料量的5倍。在浓缩液中加入50%的乙醇至醇度达到40%，搅匀，静置12小时，吸走上清液，收集沉淀，加水溶解。于15000r/min转速下离心，取上清液，合并，过1.5 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择
0.5万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，干燥，得到水提螺旋藻多糖1.7kg,总糖含量彡55%,分子量为0.5万以上。实施例4
取螺旋藻100kg，加4倍量的95%乙醇，回流提取I次，每次I小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水4倍量，提取I次，提取2小时，提取温度为60°C，提取液于3000 r/min转速下离心，上清液合并，加热使其体积减少至螺旋藻投料量的I倍。在浓缩液中加入95%的乙醇至醇度达到90%，搅匀，静置72小时，吸走上清液，收集沉淀，加水溶解。于9000r/min转速下离心，取上清液，合并，过1.2 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液和流出液。分别干燥，得到总糖含量78%，分子量为0.5万-5万间的水提螺旋藻多糖Ikg ;总糖含量72%，分子量为5万以上的水提螺旋藻多糖0.6kg。实施例5
取螺旋藻100kg，加4倍量的95%乙醇，回流提取I次，每次I小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水4倍量，提取4次，每次2小时，提取温度为60°C，合并提取液，于3000 r/min转速下离心，上清液合并，加热使其体积减少至螺旋藻投料量的3倍。在浓缩物中加入50%的三氯乙酸水溶液，加热0.5小时，于1°C下冷藏72小时，9000r/min转速下离心，上清液加入10%的三氯乙酸水溶液加热搅拌I小时，于1°C下冷藏72小时，9000r/min转速下离心，无沉淀析出，上清液加入10%的氢氧化钠水溶液调pH值至中性。溶液于9000r/min转速下离心，取上清液，合并，过0.05 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用10万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液和流出液。分别干燥，得到总糖含量78%，0.5万-5万分子量的水提螺旋藻多糖0.8kg ;总糖含量85%, 5-10万分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg ;总糖含量75%,分子量为10万以上的水提螺旋藻多糖0.56kg。实施例6
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小时，提取温度为100°C，合并提取液，于9000 r/min转速下离心，上清液合并，加热使其体积减少至螺旋藻投料量的2倍。在浓缩物中加入50%的硫酸铵溶液，加热3小时，于5°C下冷藏12小时，9000r/min转速下离心，上清液加入30%的硫酸铵溶液，加热2小时，于5°C下冷藏12小时，9000r/min转速下离心，无沉淀析出，上清液加入10%的氢氧化钠水溶液调pH值至中性。溶液于9000r/min转速下离心，取上清液，合并，过0.05 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中,选择0.5万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用10万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液和流出液。分别干燥，得到总糖含量78%，0.5万-5万分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;总糖含量80%，5-10万分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;总糖含量65%，分子量为10万以上的水提螺旋藻多糖
0.6kg。实施例7
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小时，提取温度为100°C，合并提取液，于9000 r/min转速下离心，上清液合并，加热使其体积减少至螺旋藻投料量的4倍。在浓缩物中加入20%的氢氧化钠水溶液，加热0.5小时，于I°C下冷藏72小时，9000r/min转速下离心，上清液加入10%的氢氧化钠水溶液，加热I小时，于1°C下冷藏48小时，9000r/min转速下离心，上清液加入0.1 %的氢氧化钠水溶液,加热3小时,于1°C下冷藏24小时，9000r/min转速下离心，无沉淀析出，上清液加入10%盐酸溶液调pH值至中性。溶液于9000r/min转速下离心，取上清液，合并，过1.5 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对部分浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用8万分子量以上的滤材对部分浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液。再使用10万分子量以上的滤材对部分浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液和流出液。分别干燥，得到总糖含量78%，0.5万-5万分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;总糖含量80%，5-8万分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;总糖含量80%，8-10万分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg，总糖含量65%，分子量为10万以上的水提螺旋藻多糖0.2
kg ο实施例8
取螺旋藻100kg，加4倍量的95%乙醇，回流提取I次，每次I小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水4倍量，提取3次，每次2小时，提取温度为60°C，合并提取液，于3000 r/min转速下离心，上清液合并，通过0.05 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量的滤膜进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液。在浓缩物中加入1%的三氯乙酸水溶液，加热0.5小时，于1°C下冷藏12小时，15000r/min转速下离心，上清液加入1%的三氯乙酸水溶液加热0.5小时，于1°C下冷藏12小时，15000r/min转速下离心，无沉淀析出，上清液加入10%的氢氧化钠水溶液调pH值至中性。溶液于15000r/min转速下离心，取上清液，合并，过1.5 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用10万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液和流出液。分别干燥，得到总糖含量78%，0.5万-5万分子量的水提螺旋藻多糖0.6kg;总糖含量80%, 5-10万分子量的水提螺旋藻多糖0.4kg ;总糖含量65%,分子量为10万以上的水提螺旋藻多糖0.6kg。
实施例9
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小时，提取温度为100°C，合并提取液，于9000 r/min转速下离心,上清液合并，通过1.5 μ m的微孔滤膜过滤,将滤液加入超滤机中,选择0.5万分子量的滤膜进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液。在浓缩物中加入0.1%的硫酸铵溶液，加热3小时，于5°C下冷藏72小时，9000r/min转速下离心，上清液加入0.1 %的硫酸铵溶液,加热3小时,于5 °C下冷藏72小时,9000r/min转速下离心,无沉淀析出，上清液加入10%的氢氧化钠水溶液调pH值至中性。溶液于9000r/min转速下离心，取上清液，合并，过1.2μπι的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用10万分子量以上的滤材对浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液和流出液。分别干燥，得到总糖含量78%, 0.5万-5万分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;总糖含量80%,5-10万分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;总糖含量65%,分子量为10万以上的水提螺旋藻多糖0.6kg。实施例10
取螺旋藻100kg，加10倍量的95%乙醇，回流提取3次，每次3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水20倍量，提取5次，每次10小时，提取温度为100°C，合并提取液，于9000 r/min转速下离心,上清液合并，通过1.5 μ m的微孔滤膜过滤,将滤液加入超滤机中,选择0.5万分子量的滤膜进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液。在浓缩物中加入20%的氢氧化钠水溶液，加热I小时，于5°C下冷藏72小时，9000r/min转速下离心，上清液加入10%的氢氧化钠水溶液，加热2小时，于5°C下冷藏72小时，9000r/min转速下离心，上清液加入0.1%的氢氧化钠水溶液，加热3小时，于5°C下冷藏72小时，9000r/min转速下离心，无沉淀析出，上清液加 入10%盐酸溶液调pH值至中性。溶液于9000r/min转速下离心，取上清液，合并，过1.5 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择I万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对部分浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用8万分子量以上的滤材对部分浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液。再使用10万分子量以上的滤材对部分浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液和流出液。分别干燥，得到总糖含量78%, I万_5万分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;总糖含量80%，5-8万分子量的水提螺旋藻多糖0.5kg ;总糖含量80%，8-10万分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg ;总糖含量65%,分子量为10万以上的水提螺旋藻多糖0.2 kg。实施例11
取螺旋藻100kg，加8倍量的95%乙醇，回流提取2次，每次2小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水12倍量，提取3次，每次6小时，提取温度为80°C，合并提取液，于6000 r/min转速下离心，上清液合并，通过0.45 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择I万分子量的滤膜进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液。将浓缩液的一半，干燥，得到总糖含量20%，I万分子量以上的水提螺旋藻粗多糖9.0kg ；
在另外一半的浓缩液中加入10%的氢氧化钠水溶液，加热I小时，于2°C下冷藏24小时，6000r/min转速下离心，上清液加入10%的氢氧化钠水溶液，加热I小时，于2°C下冷藏24小时，6000r/min转速下离心，无沉淀析出，上清液加入10%盐酸溶液调pH值至中性。溶液于6000r/min转速下离心，取上清液，合并，过0.8 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择I万分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用8万分子量以上的滤材对部分浓缩液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液，再使用5万分子量以上的滤材对超滤机的流出液进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机 内的浓缩液。分别干燥各部分浓缩液，得到总糖含量78%，I万-5万分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg ;总糖含量80%, 5-8万分子量的水提螺旋藻多糖0.3kg ;总糖含量65%,分子量8万以上的水提螺旋藻多糖0.2 kg ο
权利要求
1.一种螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于按以下步骤进行: (1)取螺旋藻，加4-10倍量的95%乙醇，回流提取f3次，每次f 3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水4-20倍量，提取I飞次，每次2 10小时，提取温度为6(TlO(rC，合并提取液，于彡15000 r/min转速下离心,上清液合并,备用； (2)取上述(I)得到上清液合并液，过<1.5μπι的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万以上分子量的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机流出液和超滤机内的浓缩液，干燥，得到I种以上的水提螺旋藻粗多糖，总糖含量> 10%，分子量为0.5万以上； 一种螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于按以下步骤进行: (1)取螺旋藻，加4-10倍量的95%乙醇，回流提取f3次，每次f 3小时，倾去乙醇，固体物晾干，加入水4-20倍量，提取I飞次，每次2 10小时，提取温度为6(TlO(rC，合并提取液，于彡15000 r/min转速下离心,上清液合并,备用； (2)取上述(I)得到上清液合并液，浓缩，除杂处理，处理后的溶液于彡15000r/min转速下离心，取上清液，过<1.5 μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万至20万分子量间的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机流出液和超滤机内的浓缩液，干燥，得到I种以上的水提螺旋藻多糖，总糖含量> 40%，分子量为0.5万 20万。
2.根据权利要求2所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于所述的浓缩是加热使上清液合并液体积减少至螺旋藻投料量的5倍以下。
3.根据权利要求2所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于所述的浓缩是将上清液合并液通过<1.5μ m的微孔滤膜过滤，将滤液加入超滤机中，选择0.5万分子量以上的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机内的浓缩液。
4.根据权利要求4中所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于根据产品所需不同分子量范围，将超滤得到的浓缩液再反复进行超滤，2次以上连续超滤操作时，超滤机流出液即为前后两种分子量间的浓缩成分，超滤机内的浓缩液即为选用分子量以上的多糖成分。
5.根据权利要求2所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于除杂处理是在浓缩物中加入50 95%的乙醇至醇度达到40-90%，搅匀，静置12 72小时，于彡15000 r/min转速下离心，收集沉淀，加水溶解。
6.根据权利要求2所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于除杂处理是在浓缩物中加入蛋白沉淀剂，加热0.5^3小时，于彡5°C下冷藏12 72小时，于彡15000 r/min转速下离心分离沉淀，上清液中再加入蛋白沉淀剂，加热，冷藏，此除杂操作重复多次至无明显沉淀析出，上清液加入20%的氢氧化钠水溶液或10%盐酸溶液调pH值至中性。
7.根据权利要求7所述的螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于所述的蛋白沉淀剂是1-50%三氯乙酸水溶液或0. 1-50%的硫酸铵溶液或是0.1-20%的氢氧化钠水溶液其中的一种或几种。
全文摘要
本发明是一种螺旋藻多糖的提取方法。取螺旋藻经提取工艺得到提取液，将该提取液经微孔滤膜过滤、超滤、浓缩液，干燥，得到1种以上的水提螺旋藻粗多糖，总糖含量≥10%，分子量为0.5万以上；或将提取液浓缩，除杂处理，处理后的溶液于≤15000r/min转速下离心，微孔滤膜过滤，超滤，选择0.5万至20万分子量间的滤材进行超滤，至超滤机出口无液出时，收集超滤机流出液和超滤机内的浓缩液，干燥，得到1种以上的水提螺旋藻多糖，总糖含量≥40%，分子量为0.5万~20万。本发明根据对产品纯度不同的需求，在工艺路线不同的阶段选择合理的处理措施，不需要检测即可获得预定分子量规格的高纯度多糖，而且可以同时获得多种规格的螺旋藻多糖。这是其他传统方法所不可能达到的优势。
文档编号C08B37/00GK103073652SQ201210582368
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者梅艳, 李俊 申请人:昆明振华制药厂有限公司