一种食品及饲料中驴源成分检测侧向流试纸条检测试剂盒及其应用的制作方法与工艺

本发明属于分子生物学和免疫学领域，食品及饲料中驴源DNA的PCR核酸扩增以及侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。

背景技术：
为防止牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy,BSE)经添加在动物饲料中的牛肉、牛骨传播，1994年欧盟和1997年美国分别在1994年和1997年制定禁止在反刍动物的饲料中添加反刍动物源性蛋白的法规，2000年欧盟将这项禁令扩大到禁止向用于食用的动物饲喂加工过的哺乳动物、鸟类和鱼类蛋白成分。我国农业部于2004年颁布的《动物源性饲料产品安全卫生管理办法》中规定禁止在反刍动物饲料中使用动物源性饲料产品（乳及乳制品除外），但在动物饲料中人为掺入反刍动物（主要是牛、羊）肉和骨制品的现象时有发生。近年来，国内外食品市场上假羊肉、假牛肉等以假乱真现象层出不穷，动物源性食品掺杂掺假等各种食品安全事件的频发越来越让老百姓心惊胆颤。2013年初，欧洲的“马肉风波”愈演愈烈，使得消费者“闻马色变”。之后欧美的“鱼肉风波”又再一次拉响了食品安全的警钟。要保证食品及饲料的安全，需要灵敏、便捷、准确的检测方法提供基础。传统的食品及饲料中动物性成分鉴定主要通过显微镜检、基于蛋白质检测的免疫学方法以及基于核酸检测的各类PCR方法，近年还发展了近红外检测法(NIRS)。食品及饲料成分中掺入的各种动物源成分在高温处理和加工过程中易于受到破坏，不同种属动物的蛋白质序列之间差异不大，难以区别，发明专利“SDS-PAGE法鉴别肉及肉制品中动物源性成份”（公开号：CN102213720A）提供了一种以蛋白质的SDS-PAGE电泳方式鉴定猪、牛、羊、鸡、鱼的动物蛋白的方法，但不同来源和处理方式的蛋白电泳谱带不同，带来结果判别的障碍，对于饲料中的动物成分更难以实施。因为基因编码序列的简并性特征和非编码序列的存在，核酸成为较蛋白更易检出差异的靶分子，特别是线粒体DNA，拷贝数高，存在物种间差异，对其差异片段的分析是主要的鉴定方法，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速，主要的方法包括普通/荧光PCR方法及基因芯片技术。在以线粒体DNA序列进行物种的种属鉴别时，常用的区域包括编码细胞色素B的Cytochromeb基因（cytB）、核糖体小亚基12SRNA编码序列（12SribosomalRNA）、细胞色素C亚基I（cytochromeCoxidasesubunitI）的编码基因coxI、编码ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制区D-loop片段。这些区域的序列变异适中，即在种内有一定的保守性，又体现出一定的种间差异。荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR技术使定性检测迈上了可以量化的台阶，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。在物种鉴定应用方面，国内已经发布的国家标准或行业标准涵盖了驴、羊、鹿、骆驼、马、驴、猪、兔、狗和鱼等哺乳动物或水生生物。鉴于反刍动物的重要性，发明专利“鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用”（公开号：CN101659996A）描述了一种能同时鉴别牛、羊和山羊的荧光PCR方法，以三条探针进行动物来源甄别，公开号为CN102311999A的发明专利“驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针”提供了以特定探针鉴别驴来源成分的荧光PCR方法，而公开号为CN102311998A的发明专利“马或马源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针”则提供了一种鉴定马来源成分的荧光PCR方法。公开号为CN102876805的发明专利“鹿猪牛羊马驴兔鸡的PCR鉴定用引物体系”提供了一组可以鉴别驴、牛、羊、猪、马、鹿、鸡等脊椎动物的引物序列和常规PCR-凝胶电泳方法，在对驴成分的检测中，发明专利“一种鉴定动物皮张的方法（公开号：CN1605868）”以驴皮制品为对象，设计了一套用于常规PCR扩增和检测的引物，为提高灵敏度和特异性，法发明专利“驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针（公开号:CN102311999）”以探针法荧光PCR方法替代常规PCR方法，明显提高了检测的灵敏度。在其他物种的鉴定也有类似的方法描述，比如在禽类动物源鉴定方面，发明专利“一对鹅源性成分PCR检测用引物”（公开号：CN102337337A）描述了一种以常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳进行鉴定的方法，公开号为CN101270392A发明专利“PCR-mtDNA检测总禽源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法”则进一步提供了以一对引物检测多种禽类来源线粒体DNA的方法，上述方法中，实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测，常规的PCR扩增检测需要对产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度。通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率。通过将PCR扩增使用的引物标记特定的蛋白质或化合物可以在其扩增产物中引入同时包括两种化合物/蛋白质标记的核酸复合物，这个标记的产物可以通过抗体或者配体以类似双抗体夹心的方式进行检测，这个过程类似常规的免疫金标记检测技术，这种方法已经在单核苷酸多态性以及恒温扩增靶基因的方法中使用，特别是对病原微生物或疾病关联基因的鉴定，公开号为CN102134596A的发明专利“-一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法”即以此方法进行单核苷酸多态性的检测。而公开号为CN102520172A的发明专利-“单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用”描述了一种分别采用生物素和地高辛标记引物的单增李斯特氏菌基因组检测方法。因此类方法仅对扩增产物的有无进行判断，不对产物的分子量确认，因此在扩增反应中的干扰因素更多一些，常见的引起假阳性的原因包括：非特异性扩增、引物二聚体、扩增产物间的异常复性，解决引物二聚体、异常退火造成的干扰可以从PCR聚合酶的选择、引物序列优化、dNTP底物、杂交过程的控制几个方面开展。选择具有热启动（Hot-start）功能的DNA聚合酶可以明显降低引物二聚体和非特异扩增产物的形成。在引物优化方面，公开号为CN102146432A的发明专利-“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”描述了一种在引物5′端带有短回文序列的引物设计方法，该引物常温下自身环化，避免形成异源二聚体，公开号为CN102719547A的发明专利-“检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂”也采用了类似的方法用于实时定量PCR的扩增；公开号为CN101842494A的发明专利-“使用嵌合引物降低异源二聚体形成”描述了一种使用嵌合引物进行扩增的方法；在对反应底物的优化中，公开号CN101171343A的发明专利“含有假异胞嘧啶核酸碱基衍生物的3′修饰寡核苷酸及其作为引物或探针的应用”提供了一种使用特别修饰的核苷酸作为底物以减少引物二聚体形成的方法，使用探针或者引入内控探针也可以降低非特异扩增的干扰，公开号为CN101957373A的发明专利-“一种加入内控核酸对病原体核酸进行半定量检测的方法”即采用内控探针来降低干扰，上述方法中，使用热启动技术和环化引物是通行的方法，其余方法或者采用了特殊合成的底物及底物，或者需要通过探针引入第二次杂交过程，都会增加检测过程的复杂程度，特别是探针杂交方法，因需要保温过程而失去了试纸条方法的便利性。本发明引物设计中，在保持特异性基础上，对引物对及引物内5′及3′末端退火的自由能进行评估后选择合适的区域避免二聚体的形成，针对试纸条检测方法二聚体的干扰情况以适当的扩增子长度，配合展开缓冲液中去污剂及变性剂的浓度优化，可以实现引物二聚体和非特异扩增产物的有效清除。

技术实现要素：
将生物小分子或化合物标记的核酸分子可以被该小分子或化合物的抗体特异性识别，从而通过免疫学方法检测。常见的可用于核酸分子标记的分子包括半抗原分子生物素（Biotin）、地高辛（Digoxin），荧光染料分子罗丹明(RBITC)、异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、Cy3、Cy5等。上述标记分子中，地高辛、异硫氰酸荧光素都易于获得特异的抗体，而生物素分子与其配体-链亲和素具有高度特异的结合特性，因此这几种分子都可以选择用于核酸分子的标记和免疫学检测。本发明旨在将抗原或半抗原小分子标记单链寡核酸作为引物，对待检的靶核酸特异性扩增，形成的复合物分子同时具备两种抗原或半抗原标记，免疫原性的，该复合物即可用与特异抗体或特异配体结合，实现核酸扩增产物的免疫胶体金检测。因此，一方面，本发明提供一种试纸条法检测食品及饲料中驴源成分的检测技术，主要包括：1)设计两条独特的扩增引物，其中正向引物Donkey-D-F具有如下序列：5′-CCATATCAGCTCAACATACAATACTC-3′，用抗原或半抗原分子生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）或地高辛（Digoxin）中的一种标记；下游引物Donkey-D-R的序列为5′-CCGTAGAAACCCCCACGTTTAG-3′，以不同于上游引物的一种标记；在适宜的扩增条件下，可扩增驴线粒体基因组atp8-atp6区域一段长度为270bps的DNA片段；当无被检核酸模板存在时，无特异性核酸片段扩增产物；2)将一种标准的通用抗体，如抗FITC抗体与胶体金颗粒交联，在颗粒表面形成包被的抗体；3)将另一种标记分子的抗体或配体，如抗地高辛抗体或生物素分子的配体-链亲和素分子以线条状固定于膜上形成检测线；4)当存在待检的特异性扩增产物时，因上、下游引物的作用，扩增产物中同时带有上述三种标记物中的两种，形成标记分子1-扩增产物-标记分子2的复合物；5)将步骤4)形成的标志物1-扩增产物-标志物2与胶体金颗粒表面包被的标志物1的抗体结合，形成了抗标志物1抗体-标志物1-扩增产物-标志物2有色颗粒复合物；6)将步骤5)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至涂布有标志物2的抗体或配体的线条上，复合物因与标志物2的抗体（配体）结合而沉积，滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，判定为阳性；7)当特异性扩增产物不存在时，不发生上述步骤4)-6)，不能形成标志物1-扩增产物-标志物2复合物，也就不能形沉积于检测线上标志物2的抗体（配体）之上，不形成可见的条带，判为阴性。另一方面，本发明还提供了用于核酸序列检测的展开液，该展开液可以减少引物二聚体对实验结果的干扰；另一方面，本发明提供了用于食品及饲料中驴源成分的快速检测的试纸条，其包括在带有不干胶的衬垫，按顺序有：1：吸水滤纸垫；2：结合物垫，附有第一种核酸标记物的抗体或配体的生色颗粒（胶体金或乳胶）；3：侧向层析基质（硝酸纤维素膜或尼龙膜）；4：检测带，附有第二种核酸标记物的抗体；5：质控带，附有可结合特定种属来源抗体的抗体；6：衬底；7：吸水垫。另一方面，本发明还提供了用于检测核酸扩增产物的通用标准试纸条。最后，本发明还提供了上述检测方法和试纸条在食品及饲料中驴源成分检测中的用途。本发明说明书中所使用的技术术语解释：引物：DNA合成的起始物。一般为一对单链寡核苷酸，在与模板杂交后，DNA合成从其3′末端开始。标记：将可检测的信号分子(如半抗原，荧光，放射性等)与单链寡核苷酸相偶联的方法。杂交：特指互补的DNA单链通过碱基配对形成双链结构。展开：经扩增反应的PCR产物在展开缓冲液的层析作用下由试纸条吸水垫底端开始向检测线、质控线方向移动的过程。核酸：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。抗原和半抗原：具备免疫原性的物质。通常为大分子蛋白质或细胞组分。但有些小分子也具备免疫原性，被称为半抗原((Hapten)。半抗原常被用于标记探针。抗体：能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。复合体：由两种或两种以上分子特异性结成的结合物。引物二聚体：在聚合酶链式反应（PCR）过程中，因引物对间、或单条引物相互退火形成的二聚体分子，由两条不同引物构成的二聚体为异二聚体，因带有两种标记而可能引起与种抗体（配体）的结合而造成假阳性，由单一引物退火形成的二聚体为同二聚体，仅带有一种标记而不会引起假阳性，但过多的二聚体形成会降低扩增效率。免疫试纸条：用于快速检测的医学工具。又称为呈色薄膜层析。核酸聚合酶：合成核酸长链的酶类。分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。有益效果：由于本发明是以标记的特异性引物扩增适当长度的基因片段，能够保证检测的高度特异性，从而保证了检测结果的准确性。本发明的新颖之处避免了扩增产物稀释和探针杂交等流程，保持了免疫胶体金(试纸条)技术直观、快速、方便、成熟、廉价等优点，又具备PCR扩增方法高度灵敏度、高度特异性的特点，因此，本发明的方法是一种有效的驴源动物成分检测方法。作为一个核酸扩增产物检测的通用技术平台，本发明的方法及其试纸条可以广泛用于食品及饲料中动物源成分的鉴定及食源性病原微生物的检测，在农牧业、海关检验检疫都有广泛的应用前景。目前虽有多种基于PCR的动物源成分鉴定方法，但其引物设计和产物片段都适于探针法或凝胶电泳，而对于胶体金试纸条法中降低引物二聚体及非特异复性的干扰去除缺乏必要的考虑，解决方法也并不适用。本发明目的在于提供一种基于免疫胶体金方法检测食品及饲料中驴源动物成分的PCR引物、扩增和检测方法，以及该方法的应用。其他常见物种，如羊、猪、牛、驴、兔、骆驼、羊、鹅、鸡、狐狸、貂、鹿等的鉴定都可以采用与此类似的方法完成。核酸试纸条检测方法的发明将大大简化核酸扩增后的检测程序。结果判读简单明了、直观(检测示意结果如附图2)。本专利所申请的食品及饲料中驴源成分快速检测试纸条技术作为一种新型的核酸扩增后检测技术，具有以下优点：操作简单：只需要把核酸扩增后的样品直接滴到核酸试剂检测版上即可，不需要专业人员操作，便于推广；快速：检测5分钟后判读结果；灵敏：与琼脂糖凝胶电泳相比，检测灵敏度提高近1000倍以上；特异性高：由于在检测过程中加使用的为特异性标记引物，使结果更加准确；价格便宜：费用大大低于传统的凝胶电泳和ELISA检测。附图说明图1显示本发明的核酸序列扩增产物检测的试纸条的基本结构；1：吸水滤纸垫；2：结合物垫，附有第一种核酸标记物的抗体或配体的生色颗粒（胶体金或乳胶）；3：侧向层析基质（硝酸纤维素膜或尼龙膜）；4：检测带，附有第二种核酸标记物的抗体；5：质控带，附有可结合特定种属来源抗体的抗体；6：衬底；7：吸水垫。图2是核酸检测试纸条的检测结果示意图；图3是显示用实施例1的方法，采用特异性标记引物检测食品及饲料中来自动物源的驴原材料PCR-试纸条的检测结果；图4是显示用实施例2的方法，采用检测食品及饲料中来自动物源的驴原材料特异性标记引物的特异性PCR-试纸条的检测结果；图5是用实施例2的方法，显示核酸扩增后试纸条与凝胶电泳检测法的敏感度比较结果。具体实施方式如下实施例举例说明本发明的检测方法及其检测效果。实施例仅用来举例，并不构成对本发明保护范围的任何限制，本发明的保护范围在所附的权利要求书说明。实施例11材料与方法材料：驴线粒体DNA1.2引物设计1.3PCR扩增体系：模板DNA：驴线粒体DNA1.0μlPrimerF/R0.8μldNTP2.0μl10XPCRbuffer2.0μlHSTaqDNApolymerase0.2μlddH2O13.2μl总体积20μl反应条件：95℃5min94℃30sec55℃30sec72℃30sec72℃5min共30循环同时分别取5μl用于核酸试纸条检测，取5μL扩增产物，加入到95μL展开液中进行检测点于样品垫，5分钟后观察结果。1.4PCR特异性实验利用建立起来的PCR反应体系对1：鼠；2：驴；3：兔；4：马；5：羊；6：狗；7：猪；8：猫；9：鸡；10：牛；11：鹅；12：NTC空白对照（水）验证其特异性。2结果2.1PCR反应体系及条件采用TaKaRa公司的HSTaqDNApolymerase，总反应体系为20μl。用Bio-RadPCR仪进行检测，反应参数为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s进行扩增，30个循环后转入72℃5min，4℃保存。取5μl产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳后判断有无特异性条带。核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的检测结果显示于附图4中。2.2特异性试验本发明建立的PCR方法对驴基因组DNA具有较好的特异性，对其他哺乳动物及家禽类物种等无交叉反应。实施例2核酸试纸条检测方法的灵敏性，将PCR模板以1/10，1/102，1/103，1/104，1/105，1/106，1/107，1/108，1/109，1/1010的比例稀释后，按已建立的PCR体系进行扩增。1材料与方法驴线粒体DNA1.2引物设计1.3PCR扩增体系：模板DNA：质粒DNA10μlPrimerF/R0.8μldNTP2.0μl10XPCRbuffer2.0μlHSTaqDNApolymerase0.2μlddH2O4.2μl总体积20μl反应条件：95℃5min94℃30sec57℃30sec72℃80sec72℃5min共30循环分别取5μl用于琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳条件为：1XTBE缓冲液，电压100V，电泳时间30分。同时分别取5μl用于核酸试纸条检测，取5μl样品点于样品垫，加入到95μL展开液中进行检测，5分钟后观察结果。2结果2.1PCR反应体系及条件采用TaKaRa公司的HSTaqDNApolymerase，总反应体系为20μl。用Bio-RadPCR仪进行检测，反应参数为：94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃80s进行扩增，30个循环后转入72℃5min，4℃保存。取5μL产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳后判断有无特异性条带。核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的敏感度比较结果显示于附图5中，由附图5的结果可以看出，与传统的凝胶电泳相比，其敏感度增加1000倍以上。CCATATCAGCTCAACATACAATACTCTATTAATACCCTATGTACATCGTGCATTAAATTGTTCACCCCATGAATAATAAGCATGTACATAATATTATTTATCTTACATGAGTACATCATATTATTGATCGTACATACCCCATCCAAGTCAAATCATTTCCAGCCAACACGCATATCACCACCCATATTCCACGAGCTTAATCACCAAGCCGCGGGAAATCAGCAATCCCTCCAATTACGTGTCCCAATCCTCGCTCCGGGCCCATCTAAACGTGGGGGTTTCTACGG