便携式荧光检测系统和微测定盒的制造方法与工艺

便携式荧光检测系统和微测定盒

背景技术：
领域本发明通常涉及用于在微测定盒(microassaycartridge)中执行的诊断测定中使用的紧凑型荧光检测仪器，该紧凑型荧光检测仪器具有光学系统、热系统、机械系统和气动液压系统。相关技术的描述尽管使用荧光团作为探针用于体外诊断测定的好处是公知的，但是用于这种测定的最常用的设备形式是很大的、使用复杂的、相对较慢的并且依赖昂贵的共焦光学器件。这些属性使得很多设备不适用于在远程场所和在护理点现场进行的全集成“采样-应答”测试，其中要求这种设备是坚固的、快速的、紧凑的、便宜的并且易于使用的。尽管许多年前首次提出了在微流体盒中的自动化核酸扩增(参见Wilding：美国专利5304487和5635358)，但是在受控实验室条件外部的荧光测定目标的检测仍然由于缺乏便携式和稳定的设备而受到阻碍。自它们的开始二十年以来，由于这些问题以及其它未解决的问题，在缺乏先进实验室设施的情况下分子诊断仍然相对罕见。需要设计为在专门的实验室设施外部操作的独立测定系统，以促进对分子诊断更宽阔的通路。由于核酸测定提供较高灵敏度和特异性两者，因此核酸测定正迅速地成为用于检测许多不同疾病类型(包括传染性疾病)的“黄金标准”。这种测定已经证明对于大量病理状况有高度特异性并且对于跟踪如对流行病学很重要的特定疾病的遗传品系很有用，例如在将H5N1禽流行性感冒与其它类型的流行性感冒A或者B区别开时、在确定特定病原体目标是否具有耐药菌株时以及在检测肠隔离的产毒菌株(诸如E.coliO157:H7)时。基于荧光的测定还已经表明对通常监控诸如糖尿病、心脏病、凝血病、免疫测定的状况有用，以及对检测例如食物或者药物产品中的内毒素有用。在健康护理的途径受限并且许多传染性疾病是地方病以及健康和寿命预期差的发展中国家中的大量远程健康诊所尤其需要改进的设备。在典型荧光测定系统中，荧光探针或者荧光团吸收具有一种波长或者波长范围的光并且被激发；并且荧光团随后发出荧光信号。荧光团的活动性或者不活动性指示测定结果。发射信号具有通常比激发光长(但是如在“上转换荧光团”中可能较短)的波长或者波长范围。分色光束分离器或者带通滤光片或者它们的组合随后用于将荧光信号与其它光分开，并且信号被传递至传感器。传感器通常是光电二极管，并且生成可以用于对测定进行评分的电信号。使用实时或者端点荧光测定法的定性和定量测定是可行的。在这种系统中，液体试样经由微流体通道运送到微流体盒的检测室或者通道中，在该微流体盒中，与试样混合的或者试样本来的荧光探针由激发源激发。控制可以在测定通道中并行运行或者多路复用。对发出的光进行测量以确定目标存在或者不存在。可以将多个检测通道布置在微流体盒的检测区域中。测定包括进行一个或者多个荧光测量；荧光团可以用作在扩增步骤中形成的核酸扩增子的标记，或者更一般地用于荧光测定目标的存在或者不存在的标记。用于测定评分和验证的实时荧光测定法、FRET、qPCR、热解链曲线(thermalmeltcurve)、动力学和速率端点在本领域中也是已知的。已知的荧光检测器典型地采用相对较贵的光学部件(诸如，共焦光学器件、激光器和非球面透镜)以拾取并且定位微流体盒或者微阵列内存在的荧光发射。例如，Juncosa的WO98/049543教导了单个光具组中的三个分色光束分离器，一个用于控制激发源电力以及另一个用于控制反射信号；第三分色光束分离器用于辨别探针特异性的荧光发射。一个或者多个透镜用来将激发束聚焦在试样上。Juncosa还教导使用共焦显微镜的光电倍增管和光学物镜部件的入口处的孔径，用于控制具有大约五十微米的“微位置”的分辨率的成像束。“优选地通过使用孔径，通过将照射的范围限制至给定微位置的区域或者其部分，结合将检测器的视场限制至照射区，可以实现信噪比的显著改善。”[第七页,第10-15行]。这些教导由Minsky的US3013467、Tsien的美国专利5296703、Dixon的5192980、Stern的5631734、Kambara的5730850预言，并且在Maher的美国专利6614030和Shams的6731781以及其它专利中重述。Maher使用激光器、光纤、石英片和具有微型共焦光学系统的非球面透镜来优化在微流体室的中心处十微米大小的斑点处的聚焦和发射。类似地，在US6635487中，Lee证实了将激发束的锥形聚焦在试样的平面上“提供最大强度以强化对测定芯片的分析检测测量”。因此，该教导概括了现有技术。在较近期提交的Kim的美国专利申请2008/0297792中教导由物镜将充当用于微流体芯片中的荧光检测的光源的LED的图像投射到试样上作为“光斑”。光斑聚焦在微流体芯片中的室中的流体深度的中间处。由试样发出的荧光被物镜尽可能接近地准直为平行射线并且聚焦在雪崩光电二极管上。众所周知，由于阻带将针对没有以45°角进入镜的光射线移位，因此高精度对准的要求与分色镜有关。因此，Kim的教导反映了一般公认的现有技术。在Gruler的PCT公开WO2008/101732中，描述了用于在单个光路中多路复用多个激发和检测波长的荧光检测器头，陈述了“共焦测量意味着照射光学器件或者源的聚焦分别在本质上与检测光学器件或者传感器的聚焦分别相同”。Gruler接着陈述，“[本发明的]共焦光学器件...保证共焦设计的最高信号和最低背景本征特征”，即，根据Gruler所说，用共焦光学器件获得最高可能信号和最低噪声。尽管现有技术的一致教导起于用于表面荧光显微术的共焦光学器件的专门使用，但是教导已经广泛地并且不加鉴别地应用于微流体、横向流动、毛细管电泳和微阵列应用。然而，我们已经发现该方法不太适合于需要在充满流体的通道中检测一个或者多个分子探针的液相微流体诊断测定。由于诸如光淬灭、热对流和充满流体的通道中偶尔存在的气泡或者梯度的效应，在试样室的平面中共定位激发束和发射锥体的焦点会导致结果中的不可接受的不稳定性、信号丢失、淬灭、噪声、非再现性和总灵敏度损失。由于PCR的较高温度，例如，试剂和试样的释气(outgassing)不是罕见问题，并且来自液体试样中夹带的气泡的干扰是常见问题。常规方法还需要更昂贵的光学部件并且因此不利于先进的临床实验室以外的广泛应用。第二个问题是测定验证。例如，用于验证通过PCR的传染性疾病测定的现行标准已经开始依赖加入标准的核酸模板的使用，或者更优选地内源性正常菌丛(例如，怀疑有诸如伤寒沙门氏菌或者大肠杆菌O157的大便中普遍存在的非病原大肠杆菌)的共同检测。另一个普遍存在的内源性模板是与较高质量的呼吸和血液样本相关联的人18SrRNA。内源性模板的共扩增和检测确保测定结果的信任度，但是由于用作标记的荧光团之间的可能的串扰而在实践中难以实现。在使用高增益扩增时，通常选择用于多路复用PCR的激发和发射荧光团的光谱中一定程度的交叉是典型并且期望的。因此，将通过在具有用于下游处理的共享低噪声电子设备的扫描检测器头内使用分开的光学通道隔离具有光谱重叠的肩峰的荧光信号的解决方案将是本领域中技术进步的益处。第三个问题是便携性。由于避免了因共享的试剂储存器和共享的流体接触表面的交叉污染，因此一次性盒的使用证明是有益的。然而，配置用于容纳一次性盒的精密光学仪器平台是有问题的。问题包括影响盒对准和检测器头定位的机械公差的不精确性和叠加、对在仪器中的加热源与塑料的一次性盒之间形成高传导热界面的需要、对装置上的控制伺服器与盒上的微型阀之间的气动接口进行密封的需要，以及微流体盒中可用的必定较短的光路(典型地大约或者小于1毫米)，该较短光路在不优化的情况下会导致灵敏度的损失。这些连锁问题的同步解决方案仅由广泛的实验和开发实现，最常由以该高度不可预测的技术反复试验引导。因此，在本领域中需要很多改进，这些改进的元素是此处本公开的主题。

技术实现要素：
本发明在本发明的第一方面中，通过提供在加热块上形成的反光镜面，该反光镜面与包括液体试样的检测通道或者室的下侧上的热光学窗口接触地接口，解决了在液体试样中存在气泡以及其它干扰不均匀性的情况下可靠和灵敏检测微流体盒中的荧光探针、标签、荧光团和分析物的问题。反射镜面在加热块的顶表面上形成并且在使用期间接触检测室的下部光学窗口，避免在每个一次性盒底部上制造完整反射镜的复杂度和花费，以及允许我们使用具有较低热传递阻抗力和对于盒的热光学窗口的透明光学特征的更薄、更顺应性的薄膜。反射镜面是光学上平坦的并且被抛光以提高热传递和荧光发射捕获。扫描物镜定位在微流体盒顶部上的上部光学窗口之上。激发光在打到反射镜并且反射回来之前透射通过上部光学窗口和下部热光学窗口两者。直接和反射的发射由物镜收集并且集中在检测传感器(诸如光电二极管、光电池、光伏器件、CMOS或者CCD芯片)上。此外，并且与现有技术的教导完全相反地，荧光检测的问题示出为通过配置光学器件使得激发光学器件与共同光路上的发射光学器件去耦来解决。在优选实施例中，通过反复试验，当使用后反射镜时，我们已经发现可以有利地在反光镜的平面附近或者后面放置激发锥体的焦点并且独立地定位发射锥体以使得发射优选地聚焦在检测传感器上。可选地，可以通过将会聚源束引导到物镜上将激发锥体重新聚焦在近场中。令人惊讶地，去耦增大灵敏度，提高检测极限，并且减小噪声或者气泡以及试样中其它不均匀性的干扰。与现有技术的教导相反，我们发现激发和发射信号的常规共焦定位对于在试样和工作条件的宽阔范围内生成健壮信号不太有效。因此，在本发明的一个方面中，人们发现信号可以通过将激发光的焦点从试样的平面位移至试样后面的点来提高检测的优化，这是供微流体荧光测定使用的低成本光学器件领域中的技术进步。激发和发射光学器件的去耦(即，对于激发光和发射信号的不同焦点)逆着专门用于形成共焦显微术、荧光显微镜检测和微流体荧光测定中的常规实践基础的原理(首先由Minsky在美国专利No.3013467中拥护)的几十年的现有技术而发展。现有技术教导已经引导使用非球面透镜、激光二极管和检测光学器件与激发光学器件的精确齐焦对准。相反，如这里描述的激发锥体的去定位聚焦需要的光学器件意外地非常低成本并且不要求精密装配或者维护，如对于制造低成本的便携式仪器所期望的。检测室下的加热块的顶表面上的反射镜面用于通过提高物镜的光收集能力来增大灵敏度。随着将物镜更靠近检测室放置，限定角孔径和数值孔径的透镜在收集发射中变得更高效。在没有后反射镜的情况下，现有技术的典型系统的收集效率小于2.5％(假定例如5mm的平凸透镜)。添加后反射镜可以使收集效率提高200％那么多，并且理论上可以提高400％那么多。并且将激发束聚焦在试样室后面可以通过使用反射镜增大激发路径长度协作地添加至灵敏度的任何增益。我们已经发现这对低纵横比的微流体盒尤其有利，其中盒的z轴上的光学路径长度典型地为亚毫米长度，相对于标准光学试管显著减小。愉快地，还发现该组合减少由于试样室中的不规则(诸如小气泡的存在)而产生的干扰。在一个实施例中，反射镜是铝加热块或者铜加热块上的镀铬的或者抛光的金属表面，并且还用于针对温度控制的测定来传输热量或者冷气，从而实现设计的另一个协同作用。在优选实施例中，反射镜是光学平坦的铝块上的电抛光的铬表面，选择铝是由于其优秀的热传递特征和可缩放的热惯性。块由与块的底座接触的电阻加热元件而被加热。反射镜面的平滑度和平坦度有助于最优热传递。在本发明的该方面中，反射镜面是例如用于对于PCR扩增子的荧光探针的FRET检测或者热解链分析的加热元件的上表面。在一个实施例中，由构造通过在斜升测定流体的温度时监控荧光而获得的FRET解链曲线，来说明面向反射镜的加热块的光学性质和热性质的组合应用。在另一个实施例中，面向反射镜的加热块用于在针对荧光发射扫描盒时调节或者控制微流体卡的检测室中的反应温度。供实时并且调制温度的荧光测定中的微流体盒使用的面向反射镜的加热块展示了本领域中的技术进步。根据本发明的另一方面，我们已经采用了通过使用紧密安装在扫描头中的下游信号处理固件加强的噪声消除的高增益的多级放大器。人们发现激发光锥的非常高增益的放大和平面外去定位在优化测定辨别和灵敏度中是协作的(即使在存在打断来自液体试样后面的反射镜面的镜面反射的气泡的情况下)，并且恰当地在不增加成本的情况下实现。整个光学路径使用三个透镜，第一透镜用于准直来自光源的激发，第二透镜用于将激发源投射到反射镜上以及用于收集来自试样中的任何荧光团的荧光发射作为准直的发射，以及第三透镜用于将发射聚焦在检测器上。每个荧光团由单独的光学通道光学地隔离以用于测量。分色镜、屏障滤光片和光谱特定的LED的组合用于实现每个光学通道中的近单色激发光。透镜和相关光学部件(包括针对单独激发和发射波长与光路交叉的分色镜和滤光片)设置在安装导轨的扫描头中，该扫描头跨越检测室横向地移动。为了最小化噪声，头还包括用于放大信号的所有电子部件和用于模拟和数字信号处理的板载嵌入式微处理器。即使在存在破坏数据获取的信号平均和基线减法方法的气泡泡沫干扰的情况下，可以通过转换至单个比特输出(即，1或者0)精确地评估和报告来自每个光学通道的测定扫描数据。已经发现这是用于当在一个或者多个检测室上和跨越反射镜面扫描检测器头时，对存在或者不存在来自液体试样混合物中的特定荧光团的定性评分的简单并且非常有效的手段。扫描头和轨道配置有耦合至步进电机的驱动链以用于在扫描期间精确的空间分辨率。我们已经发现整个微流体盒对接舱和光具座以倾斜角安装在仪器壳体中对在微流体盒上进行装载、润湿和混合操作期间减小气泡夹带和改善排气是有利的。在优选实施例中，以大约15度的角度安装整个光具座使得气泡从微流体回路位移，使用于浮动光具座和对接舱整个悬架安装和弹簧偏置的夹紧机构成为必需，以确保当盒装载到仪器中时光具座组件底部上的对接舱中安装的板载加热元件与可插入盒之间的热传导界面的有效形成。还必须在对接期间建立成角度的盒与装垫片的气动接口端口之间的密封界面。可以跨越检测室扫描检测器头，或者相反地，可以跨越检测器扫描微流体盒。如这里实现的，检测器安装有在成双的、成对导轨上的步进电机控制下的蜗轮或者齿条和小齿轮驱动台阶。可以通过使数据获取与电机控制同步来根据需要扫描试样；这可以使用与检测器头中的嵌入式微处理器通信的板载或者外部主机控制器来执行。令人惊讶地，尽管有许多潜在干扰，但是这种将集成的共同处理器安装在线性运动台阶上以用于在运行中采样、过滤和平均测量值的检测器头提高了系统确认和报告测定结果的能力。人们期望跨越试样井(samplewell)、检测室、检测通道或者区域(其可以是一毫米到若干毫米的宽度)的荧光强度将有变化。例如，由于来自井厚度的差、来自光学窗口的不完美、来自小的温度变化(例如，其可以引起当前检测的扩增子的杂化相关的荧光的伴随变化)和来自可能起因于除气和混合的气泡或者泡沫的混合中的不均匀性而出现这些变化。人们发现，可以通过在跨越检测室的采样横断面上进行信号数字化以使这些变化最小化。如将在下面进一步描述的，阈值可以用于辨别正测试结果和负测试结果。为了进一步地提供噪声消除，通过以已知防止由AC线波动的干扰以及其它周围电干扰或者RF干扰的频率选通激发束，以去除外来噪声，产生较干净的信号调制，产生还可以进行过滤以去除泄露到仪器壳体中的任何周围光的作用的调制信号。我们已经通过配置具有专用共同处理器的光学印刷电路板以及使用高效地最小化连接至主机仪器的数据总线上的流量的独立时钟频率和固件实现了该结果。板载光学信号处理器具有存储在驻留在光学卡上的EEPROM中的专用指令，并且在选择为限制电磁干扰的频率下使发送至源LED的脉冲与传感器光电二极管的询问同步。固件设计成评估激发光的选通照明猝发之间的信号与选通猝发之间的背景的差，并且通过该方法容易地减去由于周围光或者外部光的任何背景。产生的光学模块封装在密封的检测器壳体中并且可以扩展为具有多个光学通道一系列光学模块，用于同时扫描多个试样或者串联或者并联的荧光团。信号处理路由至嵌入在检测器头中的自主的共同处理器，并且从那儿路由至主机仪器控制器。因此，本发明包括单头/单通道实施例、双头/双通道实施例以及多头/多通道实施例，并且可以在单个试样或者多个并联试样上执行单个和多路复用的测定。通常，测定系统包括能够用于跨越试样扫描检测器头的机械系统，检测器头容纳至少一个检测通道，以及更优选地多个检测通道，每个检测通道包括物镜和配置为捕获和放大由物镜接收的光学信号的光电子电路元件，其中机械系统由检测器头外部的电路和控制器操作，以及光电子元件在驻留在与嵌入在所述检测器头内的微处理器相关联的固件中的自主守护进程的控制下。有利地，分离所有部件都紧密邻近的屏蔽的检测器头内的光学信号获取和处理，实现了用于具有可忽略信号噪声的多级放大的系统，该信号噪声将以其它方式与检测器头外部的主机仪器中发生的模拟功能相关联。在主机仪器中，光电子电路元件与任何外部电路电子隔离地操作；包括配置用于在自主守护进程控制下进行信号处理和/或信号数字化的光电子元件。我们相信这是本领域的进步。人们发现当检测器容纳为双头和多头检测器时运行地很好，其中单个壳体中的两个或更多个通道配置有完全独立的光学器件、特定于荧光团的滤波器、分色镜和源LED，减小多个荧光团之间的串扰。因此，头将可选地将包括安装在第一电路板上的多个光源和安装在第二电路板上的多个物镜以及关联检测器，并且将独立地使用共享的信号处理能力和检测器头中嵌入的固件针对多个荧光团中的每一个收集信号。为了减少噪声，不从检测器头向主机仪器传输模拟信号。以这种方法，用于每个通道中的激发的光源可以与个体荧光团匹配。不再需要提供白光和激发滤光片以确保打到试样的窄带通激发光束。该简化证明对要求成对采集“biplex”或者多路复用的目标信号和对照信号的测定协议有用。其中，关于FDACLIA弃权要求，将目标模板和对照模板两者放大，在可以报告或者宣布关于测试试样的测定结果之前必须存在正对照信号。在没有可检测对照信号的情况下，检测的任何目标信号都不是有效结果。为了满足CLIA弃权要求，需要荧光检测器不仅能够检测例如由PCR扩增的目标传染性有机体的存在，而且还能够检测与目标共存并且由例如相同PCR反应或者仪器中并行进行的PCR反应扩增的内源性人为对照有机体的存在。这种方法优选地要求荧光检测器具有将目标和对照荧光团的存在确定为共同检测室中的“biplex”(“双链体”)扩增反应混合物的能力。典型地使用具有荧光激发和发射光谱的正扩增对照荧光团，该荧光激发和发射光谱被移位为由选择性带通滤波器从针对目标荧光团的荧光激发和发射光谱很好地分辨(按照波长)(例如参见图25)。然而，根据本发明，证明可以通过使用双头检测器以及通过连续地扫描每个检测室两次(每个光学通道一次)实现优秀的分辨率，首先检测对照荧光特征，然后检测测试试样荧光特征-每个扫描途径利用如上所述单独的激发和发射光学器件。通过用完全分隔的并且独立的光路配置这些检测器发现了好处。在本发明的该方面中，使用双链体头设计确保试样中扩增对照荧光团的存在不会由于“串扰”而在目标通道中无意中地产生信号。这种情况将产生分类为“假阳性”的试样。相反地，从目标通道到对照信道没有串扰也很重要，这在多个信号共享共同的光路时是可能的。这种情况可以导致正扩增对照被无意中地认为存在(当这可能不是该情况时)，以及将导致报告无效测定，不可接受的结果。通过利用荧光素或者等效的荧光团作为用于目标的分子探针，以及利用得克萨斯红或者等效的荧光团作为用于对照的分子探针来例示这些原理。人们发现，一个检测通道优化用于检测荧光素以及另一个检测通道优化用于得克萨斯红的双头检测器惊人地灵敏、精确和健壮，两个检测通道各自具有单独的激发和检测光学器件。移动检测器头以将每个光学通道依次定位在试样上并且进行单独的荧光读取。令人惊讶地，这提高了分辨率和最小化了串扰，但由于移动检测器头的机械学而没有促进更高的噪声或者灵敏度损失。由于没有用白光进行激发，而是以对个体荧光团特定的波长作为替代进行激发，因此第二荧光团的淬灭不是问题。在本发明的另一个方面中，我们已经发现，可以通过跨越多个试样井顺序横越多头检测器以扫描多个微流体通道，每个头配置有用于单个荧光团激发和发射的独立光学器件。尽管针对每个光学通道将激发和检测光学器件分开，但是在检测器头内共享的电路中执行信号处理。检测器头在外部控制器的控制下执行扫描，同时检测器头中的守护进程自主地构造扫描期间遇到的试样井的图，该图具有根据相对于至少一个参考点的位置表示信号强度的数据对。在一个实例中，参考点是由检测器头获得的限定扫描路径上的空间坐标，其中参考点与所述盒主体的对齐特性相关联，并且可以与触发例如机械、电气或者光学开关的特性相关联。通过与井壁或者边缘或者标识井边缘的其它基准点相关联的光学信号强度的变化检测试样井。在一些实例中，参考点作为第一井的第一边缘，以及图包括关于从井中的每一个的第一边缘到第二边缘的宽度的信息，使得当引入液体时，针对每个图点的背景扫描可以从与试样相关联的任何光学信号减去。因此，在又另一个实施例中，本发明对于即时检测的分子诊断测定提供健壮的多头独立通道荧光检测系统，该检测系统具有向共同存在于共同或者并行检测室中的目标和核酸扩增对照两者的存在引导的高度特异性。较干净的信号允许较高增益电子扩增而没有信噪比的对应降低。本发明中的第一实施例实现了具有超过两个通道的荧光检测系统，例如用以检测单个检测室中混合的目标和对照，以及具有多个测定通道以用于检测多个目标。可选地，可以并排、在阵列中或者径向地(如以圆柱形)定位该头。使用独立光学路径意外地导致对透镜、分色光束分离器以及关联滤光片元件的组装精度需要的减小，提高装置的可制造性。本发明实施例包括便宜的非精密光学器件、塑料透镜、试样窗口后面的加热块上的反射镜、可移动台阶元件、选通的激发和发射、噪声抑制、可移动检测区域上的板载连续信号处理以及超过一个光学通道用于通过利用成对目标和对照荧光团进行biplex测定验证。尽管仪器有高放大增益，但是仪器已经证明有利地抵抗诸如检测室中的电噪声和气泡的干扰。附图说明图1是本发明的仪器和对接舱中的微流体盒的透视图。图2是示出了在对接舱中插入微流体盒的动画视图。图3是提供装置的功能单元、软件和固件的概述的框图。图4A是具有对接舱、光具座和夹紧机构的浮动平台的简化表示，该浮动平台用于使微流体盒与加热器模块热接触并且扫描微流体盒。图4B在概念上展示了浮动平台、对接舱、光具座和微流体盒以相对于地平面的限定角“theta”安装在仪器底架中，其中地平面是水平的。图5A和5B是从上面和下面示出了具有对接舱、光具座和扫描检测器头的悬浮安装的平台的前内部透视图和后内部透视图。图6A是从对接舱下面示出了下侧加热器模块和冷却扇的前内部透视图。图6B是具有加热块元件和镜面的加热器模块的细节图。图7A和7B是在对接舱适当位置中具有可插入盒的浮动平台的透视图。为了清楚起见，已经去除了对接鞍和附属安装元件。图8是对接舱和从对接鞍的下侧悬浮的浮动平台的细节图。浮动平台安装有四点弹簧悬挂。图9A和9B是夹紧机构的前部子组件的视图。图9B图示了夹紧齿条上的蜗杆驱动操作。图10A和10B是夹紧机构的后部子组件的视图。图10B图示了夹紧齿条和压盘臂的蜗杆驱动操作。图11A和11B是供本发明的检测系统使用的可插入微测定盒的透视图。图12是示出了微测定盒的内部部件的分解图。图13A和13B是供本发明的检测系统使用的可插入微测定盒的平面图和立面图。图14A隔离具有内部气动歧管、气动接口多端口和加热器模块的安装板；以及图14B描绘了在使用时由微测定盒占据的位置。图15是具有中央气动入口端口阵列的微测定盒鼻端的分解图。图16是具有微测定盒的安装板的平面图，示出了通过气动接口多端口的截面图的位置。图17是通过气动接口多端口的横截面视图。图18是具有微测定盒的安装板的平面图，示出了通过盒和加热器模块的截面图的位置。图19是通过加热歧管和微测定盒的横截面视图。图20以分解图示出了加热器模块组件。图21是施加在对接舱中的盒上的弹簧力的示意图。图22是装置的部分组件，示出了具有在盒和加热器模块的鼻端引导的风扇出口的箱装式鼓风机。图23是具有用于激发和发射检测的电子隔离电路板和双光学通道的检测器头的透视图。去除壳体的一半以观察内部部件。图24A和24B是具有双光学通道、安装加热块的镜和微流体盒的荧光检测器的内部光学部件的示意图。激发光学器件安装在一个电路板上以及检测光学器件安装在另一个电路板上以减少噪声干扰。图25A和25B示出了液体试样中两个荧光团的发射和激发波长，并且图示了用于去除串扰的双头光学隔离。图26A至图26D是来自在具有对照和目标信号的测定条件下的检测器头的放大器的电子迹线的视图。图27是用于控制荧光激发以及接收、处理荧光发射信号和向主机仪器传递荧光发射信号的检测器头电子设备的框图。图28A和28B是示出了数字去除气泡干扰的原始输入和数字化输出的表示。图29A是激发锥和平凸物镜相对于盒检测室和面向镜的加热块的表示。图29B是在短工作距离处用平凸物镜进行的发射采集相对于盒检测室和面向镜的加热块的表示。示出了原荧光发射和反射的荧光发射。图30是具有去耦的激发和发射光学器件的光学路径的示意性表示，其中L1’＜L1以及源束是发散的。图31是具有去耦的激发和发射光学器件的光学路径的示意性表示，其中L1’＞L1以及源束是会聚的。图32A绘制了表明通过改变镜上方的物镜高度来增强信号输出的实验结果的曲线。图32B用图表表示有和没有后镜的综合输出信号强度。人们发现如图29A所示通过在镜的后面的焦点处聚焦激发束以及如图29B所示在较短的工作距离处采集发射以优化输出信号。图33A表明正测定结果和控制的嵌套热解链曲线数据，示出了根据温度由杂化到扩增子的分子信标产生的荧光。图33B和33C分析热解链轮廓，计算指示Tm的一阶导数。具体实施方式尽管为了图示的目的下列详细说明包括具体细节，但是本领域技术人员将理解下列细节的许多变型和更改在所要求的发明范围内。阐述下列定义以帮助解释如所要求的本发明。定义此处“守护进程(Daemon)”指的是用于光学数据获取和处理(ODAP)的可编程指令集，该可编程指令集存储在由嵌入式微处理器执行的固件中作为自主后台进程而不是在交互性用户或者由主机控制器的直接控制下。守护进程可以被看作虚拟机，该虚拟机操作和控制与噪声电子隔离并且定位在检测器头中的电子电路。在三级放大器中对来自与检测光学器件相关联的多个放大器的经调节的输出进行调节和放大，并且选择三个放大器输出中的一个用于数字化，随后进行信号处理和用定位数据制表。守护进程随后将光学数据与后台扫描进行比较并且在向主机系统报告数据以用于显示给用户之前，关于荧光是否是正测定结果做出复杂的确定。在操作期间，主机系统进行多任务处理以执行各种测定功能，诸如温度和气动控制、检测器头扫描、用户界面可操作性以及故障监控，并且将与发射信号获取和处理相关的任务委托给守护进程(此处称为“ODAP守护进程”)。“孔径角”-是能够进入物镜并且参与图像形成的来自单个点的大多数发散射线之间的角。“后焦距”-对于具有进入透镜的准直光的入射束的透镜，定义为从透镜的后表面到聚焦的光的锥体的焦点的距离L。“后焦点位置”指示可以通过使光学器件与透镜的天然焦距去耦而将非准直射线聚焦在离开透镜后面替代距离处。目标分析物：或者“感兴趣的分析物”或者“目标分子”可以包括核酸、蛋白质、抗原、抗体、碳水化合物、细胞组分、脂质、受体配体、小分子(诸如药物)等等。目标核酸包括基因、基因的部分、基因的调控序列、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、cDNA并且可以是单链的、双链的或者三链的。一些核酸目标具有多态性、缺失和替代剪接序列。在单分子中可以存在多个目标域，例如免疫原可以包括多个抗原决定簇。抗体包括可变区、恒定区和Fc区，该Fc区具有固定抗体中的值。通常在制造时不为目标分析物提供盒，而是包括在要测定的液体试样中。相反，典型地为“对照分析物”提供盒并且对其进行测定以确保测定的适当性能。如在本领域中公知的，包括目标测定的加入标准的试样可以用于某个质量对照测试以及用于校准。用于扩增的装置：原始技术是聚合酶链反应(称为PCR)，在Ausubel等人的美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.4,800,159中，JohnWiley和Sons，Baltimore，Md.(1989)的CurrentProtocolsinMolecularBiology以及Innis等人(“PCRProtocols”，AcademicPress,Inc.SanDiegoCalif，1990)，对该聚合酶链反应进行了详细描述。聚合酶链反应方法需要热循环并且在本领域中是公知的。简单地说，在PCR中，制备两个引物序列，该引物序列与目标序列的相对互补链上的区域互补。过量的脱氧核苷三磷酸与DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)一起添加至反应混合物。如果试样中存在目标序列，则引物将粘合至目标并且聚合酶将通过添加在核苷酸上使引物沿着标记序列延伸。通过提高和降低反应混合物的温度，延伸的引物将与模板分离以形成反应产物，过量的引物将粘合至模板和反应产物并且重复该过程。通过添加荧光嵌入剂，能够实时地检测PCR产物。其它扩增协议包括LAMP(DNA的环介导等温扩增)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、连接酶链反应(“LCR”)、基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)，还可以使用“滚环”、“RACE”和“单侧PCR”(还称为“不对称PCR”)，具有过量合成与可检测探针互补的链的优点。这些各种非PCR扩增协议在诊断测定中具有各种优点，但是PCR仍然是分子生物学实验室和临床诊断中的主力。这里公开的微流体PCR的实施例应当认为是能够执行一种或者各种扩增协议的普通级微流体装置的代表和示例。典型地，核酸扩增或者延伸包括使可以具有不同序列一个或者多个目标核酸与包括反应组分的“主混合物”混合，用于进行扩增反应和使该反应混合物处于允许目标核酸扩增的温度条件下。主混合物中的反应组分可以包括调节反应混合物的pH的缓冲剂、提供合成核酸需要的能量和核苷酸的天然核苷酸中的一个或者多个(与A、C、G和T或者U相对应-通常以相等浓度存在)、粘合至模板以便于发起核酸合成的引物或者引物对，以及将核苷酸添加至正在合成的互补核酸链的聚合酶。然而，用于扩增的方式还包括使用修改的或者“非标准的”或者“非天然的”碱基(诸如在Prudent的美国专利7514212以及Marshall的美国专利7517651和7541147中描述的)以帮助检测核酸目标。“用于检测的装置”：如此处使用的，指的是用于显示端点(即，测定结果)的装置，并且可以包括配备有分光光度计、荧光计、照度计、光电倍增管、光电二极管、浊度计、光子计数器、伏特计、安培计、pH计、电容传感器、射频发射器、磁阻计或者霍尔效应器件的仪器。盖板中的放大透镜、光学滤光片、有色流体和标记的探针可以用于改进测定结果的检测和解释。“标签”或者“标志”包括但不限于，诸如发色团和荧光团的染料；以及如现有技术中已知的化学发光物。磁珠上装饰的QDot(诸如涂敷有ZnS的CdSe)或者QDot和顺磁性Fe3O4微粒的混合物是提高本发明的测定灵敏度的便利方法。还预期荧光淬灭检测端点。与酶链免疫测定相关联的各种基质和产物发色团也是本领域所公知，并且提供用于放大检测信号的装置以提高测定的灵敏度(例如“上转换”荧光团)。荧光和光学检测器可以包括光电二极管、光伏器件、光电晶体管、雪崩光电二极管、光敏电阻器、CMOS、CCD、CID(电荷注入器件)、光电倍增管和反向偏置的LED。检测系统可选地是定性的、定量的或者半定量的。“分子信标(Molecularbeacon)”-是单链发夹形寡核苷酸探针，设计为报告溶液中特定核酸的存在。分子信标由四个组分组成；茎、发夹环、端部标记的荧光团和相对端部标记的淬灭剂。当发夹状信标没有粘合至目标时，荧光团和淬灭剂紧密地布置在一起并且抑制荧光。在互补目标核苷酸序列存在的情况下，信标的茎打开以与目标杂化。这使荧光团与淬灭剂分离，允许荧光团发荧光。替换地，分子信标还包括在端部标记的供体附近发光的荧光团。‘波长偏移的分子信标’包括使荧光团能够更强烈地发光的另外的收获荧光团。分子信标的当前评论包括WangK等人，2009，MolecularengineeringofDNA:molecularbeacons。AngewChemIntEdEngl，48(5):856-870；CissellKAetal，2009，ResonanceenergytransfermethodsofRNAdetection，AnalBioanalChem393(1):125-35和LiY等人，2008，MolecularBeacons：anoptimalmultifunctionalbiologicalprobe,BiochemBiophysResComm373(4):457-61。最新进步包括CadyNC，2009，QuantumdotmolecularbeaconsforDNAdetection。MethodsMolBiol554:367-79。荧光核酸测定包括通过标记的引物和基于探针的检测化学物质的扩增。可以在测定结束时或者通过实时地测量扩增产物量来测定荧光产物。尽管并不是限制性的，但是TaqMan探针(AppliedBiosystems)(其依赖于具有3'淬灭剂构造的5'报告染料的位移和聚合酶介导的水解)、FRET杂交探针、基于低聚FRET的双探针(Roche)、小沟粘合剂共轭杂化探针(MGB探针，AppliedBiosystems)、Eclipse探针、LockedNA探针(Exiqon/Roche)、Amplifluor引物化学物质、Scorpions引物化学物质、LUX引物、Qzyme引物、RT-PCR等等都适合于本发明。还可以使用嵌入染料。反转录酶用于分析RNA目标并且需要单独的步骤以形成cDNA。最新进步包括KrasnoperovLN等人，2010，Luminescentprobesforultrasensitivedetectionofnucleicacids.BioconjugChem2010Jan19epub。除化学染料以外，探针包括绿色荧光蛋白质、量子点和纳米点，它们都是发荧光的。可以用荧光团来标记诸如核酸和抗体的分子以及对测定目标具有亲合性的其它分子，以形成对本发明的荧光测定有用的探针。“FRET”(荧光共振能量传递)-是使得能够研究分子相互作用的荧光技术。它取决于当两个分子在杂化时紧密邻近时从一个荧光团到另一个荧光团(即，供体和淬灭剂)的能量转移。最新进步包括CarmonaAK等人，[2009，Theuseoffluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)peptidesformeasurementofclinicallyimportantproteolyticenzymes，AnAcadBrasCienc81(3):381-92]。除非上下文另外要求，否则在整个说明书和随后的权利要求中，单词“包括”以及其变型应解释为开放的、包括在内的含义，即，作为“包括但不限于”。在整个本说明书中，提及“一个实施例”、“实施例”、“一个方面”或者“方面”的意思是结合实施例或者方面描述的特定特征、结构或者特征可以包括在一个实施例中，但不必包括在本发明的所有实施例中。此外，这里公开的本发明的特征、结构或者特征可以在一个或者多个实施例中以任何合适的方式组合。“常规的”是指示本发明所涉及的在现有技术中已知的内容的术语。“大约”和“一般地”是不精密的扩展表达，说明意义上“差不多”的“或多或少”、“近似地”或者“几乎”的情况，其中变化将是无意义的、明显的或者等效的效用或者功能，并且还指示标准、规则或者限制以外明显较小的存在。“串扰”-当试样井中两个或更多个荧光团的激发和/或发射光谱(和/或基质的自发荧光)重叠时，在荧光成像中出现串扰，使其难以单独分离一个荧光团的活性。现在转至附图，图1是在对接舱中具有微流体盒200的仪器100的透视图。示出了薄膜面板104和触摸屏显示器表面108以及紧凑型底架或者壳体106。由于在微流体盒中提供所有试剂，因此仪器具有完全独立的可操作性。图2通过绘制微流体盒前部鼻端105插入到对接舱103中的动画来补充该外视图。如将在下面更详细讨论的，对接舱是悬浮安装的并且相对于仪器底座成一定角度倾斜。图3是提供测定装置的功能单元、软件和固件的概述的框图。机械系统、气动液压系统、温度控制系统、光学系统以及输入/输出(I/O)系统由两个数字处理器协调，第一数字处理器称为“主机控制器”，其接收用户命令并输出测定结果，并且还引导测定的机械、热和气动液压过程步骤，以及第二数字处理器称为“嵌入式微处理器”，其对光学系统施加局部控制，包括检测器头内的信号获取和处理，并且向主机控制器传递数字数据。由嵌入式处理器控制的光学系统在检测器头内与装置壳体内的有噪声的模拟电路屏蔽开，允许在相对无声的环境中进行高增益放大。每个处理器设置有单独的时钟、易失性存储器和非易失性存储器，并且相互自主地执行。作为概述，仪器内的浮动平台(1000，虚线)支撑用于接收和可逆地夹紧微流体盒的对接舱(这里，1001)并且设置有扫描检测器头311。在主机控制器控制下跨越微流体盒的光学窗口扫描检测器头。检测器头包括用于提供激发光的子组件和用于在守护进程的控制下检测、放大和处理荧光发射信号的传感器，守护进程驻留在与嵌入式微处理器1841相关联的固件中。浮动平台跨置在安装至固定基板和仪器架的弹簧悬架上。固定至固定基板并且定位用于与浮动平台接口的有：具有在主机控制器1003控制下单独可控制的加热块的加热器模块、连接至安装在基板330上的气动伺服器的气动接口(还充当气动分配岐管)、连接步进电机和主机控制器的线束以及用于夹具电机和相关传感器的线束，包括用于测量夹具和微流体盒的位置的压力开关、条形码读取器和温度监控器。电力从安装在仪器架中的可再充电电池或者通过到AC转换器或者DC电源(诸如汽车)的直接连接分配至所有系统。主机控制器1003安装在母板上，该母板还包括用于操作仪器的触摸板面板和LCD显示器面板。仪器可以经由各种数字串行I/O链路(包括无线网卡或者其它远程通信器件)向外部网络或者器件传输数据。为RAM寄存器的服务接入和编程提供专用数字中继，其是在固态ROM中编码的软件。用于操作仪器的一般指令(诸如操作具有从液体试样诊断特定疾病或者病理的能力的特定微测定卡需要的气动脉冲和阀逻辑的序列)由与主机控制器相关联的可编程软件提供，该主机控制器配有易失性和非易失性存储器以用于执行测定。如果例如，条形码读取器检测特定微测定盒，则器件被编程为执行从该条形码辨识的特定测定并且以指定格式解释和显示结果。然而，信号获取光学器件的操作(包括源强度的调制、信号放大和滤波)在驻留在检测器头311内的传感器PCB上的嵌入式微处理器1841中的守护进程的控制下。因此，对噪声有高灵敏度的电信号在检测器头中与主机仪器的较嘈杂的环境屏蔽开，并且完全避免了从检测器头到主机A/D转换器的模拟信号的传输。该非常规的功能分离已经很好地证明在减小仪器对噪声的敏感性中非常有利，如完全的便携性和室外操作所需要的，并且出乎意料地允许使用高增益三级放大器，在该高增益三级放大器中将预期为有嘈杂的电子环境。机械系统具有板载光具座和对接舱的浮动平台是仪器的区别性特征。在图4中对该特征从概念上进行了介绍。图4A是仪器的主要光热机械子系统的概念性表示。浮动平台300由托盘状的底架301(虚线框)组成，该底架301由安装四点弹簧的悬架悬在倾斜平面上(由302、303指示)并且支撑对接舱103用于容纳微流体盒200。在浮动平台300上还支撑有安装在成对导轨(308、309)上的扫描检测器头311。盒不是仪器100的部分，而是在插入到浮动对接舱103中之后与仪器进行接口。在操作期间，浮动平台夹紧(由320指示)抵靠在安装板(330)上并且接合加热器模块340的区域加热块(341、342、343、344)以及关联电阻加热元件和电路的接触表面。在冷却期间提供风扇345以消散过多的热量。倾斜的安装板还设置有气动接口端口350，用于密封地对接至微流体盒的底座。通过气动接口端口从嵌入倾斜安装板330中的整体气动分配“歧管”或者系统向盒传送气动压力。气动歧管供应来自安装在倾斜安装板上的源的负压力和正压力。安装母板的、可编程主机控制器通过基板330中的内部歧管和气动接口端口350将气动驱动压力、真空和控制脉冲引导至盒上的泵和阀。检测器头311是机动化的并且在主机控制器的控制下执行盒的扫描。为了沿着成对导轨(308、309)扫描检测器头，主机控制器接合由步进电机307驱动的蜗轮。检测器头安装有具有物镜315的外窗，该物镜315扫描微流体盒的前部鼻端中的光学窗口并且采集原始光学信号。检测器头311具有它自己的嵌入式微处理器1841，该嵌入式微处理器1841具有驻留的守护进程，其独立于用于光学信号获取的主机控制器起作用。主机控制器还调节加热器模块340的加热元件(341、342、343、344)的温度，并且控制一组螺线管阀和正压力以及链接到气动接口的真空泵储存器。仪器配有用于用户交互的显示器面板和触摸面板。电力输入是灵活的，并且可选地由AC适配器、汽车适配器或者从安装在仪器下方的可再充电电池供应。还包括可选的无线IO和数字IO端口。图4B在概念上示出浮动平台301、对接舱103、检测器头311和微流体盒200可以以相对于地平面的限定角安装在仪器底架106中。使盒与地平面成一定角度倾斜改善流体装载期间的排气并且最小化润湿和混合操作期间的空气夹带。由这里公开的该创新和其它创新避免了干扰测定结果的光学询问(interrogation)和热传递的气泡累积。倾斜的安装板330建立浮动平台301、盒200以及夹紧机械部件800和光学扫描310子组件的角。我们发现气泡累积干扰核酸扩增，并且气泡累积受平台的角度量限制。已经发现该角“theta”在与地平面10-45度范围内有利，更优选地10-20度，以及最优选地大约15度。如图4B所示，检测器头311包括具有匹配的半壳(312、313)的蛤壳状(clamshell)壳体。检测器头在横向导轨308和309上滑动并且在具有蜗杆驱动器的步进电机307的主控制下。浮动平台底架301弹性地安装在四点悬架中，并且直到夹紧才与倾斜安装板330有直接连接。夹紧机构在这里由箭头320象征性地指示并且将在下面更详细地讨论。两个扫描导轨308中的一个在该视图中容易看到，并且由浮动平台底架或者托盘301支撑在任一端部处。对接舱由虚线框(103)指示，并且标记用于将微流体盒的鼻端插入检测器头311下方的开口，该检测器头使得能够如图所示(双箭头)从一侧到另一侧进行扫描。这里作为对接舱下方的升高平台示出的气动接口端口350阻挡了紧靠对接舱下方并且与对接舱对齐设置的加热器模块340和加热块341-344的视图。电力调节、AC适配器和电池存储功能安装在仪器架329下侧上方的倾斜安装板330下面，该仪器架329被设计成依靠在平坦表面上。图5A和5B是从上方示出了悬挂安装的平台的前内部CAD视图和后内部CAD视图，该悬挂安装的平台具有有光具座和检测器头311的浮动底架301以及由微流体盒200占据的对接舱。浮动平台从鞍型支撑、对接鞍400悬挂，该对接鞍400刚性地螺栓连接到倾斜安装板330。如将在下面更详细描述的，还示出了提供夹紧压力的齿条401。在图5B中，容易辨识光具座的步进电机307和导轨(308、309)。倾斜安装板330组装有泵、真空和压力储存罐、螺线管和气动控制电路(为了清楚地呈现盒对接机构和扫描检测器头而没有示出)。图6A是从对接舱下面示出了下侧加热器模块340和冷却风扇345的前内部透视图。如图6B所示，能够看出，在将微流体盒200插入到对接舱中时，加热器模块340被引入为与在对准销510上并且停靠在台阶511上的盒的下侧对准。加热系统图6B是具有加热块元件(“热元件”341、342、343、344)和镜面(500)的加热器组件340的详细图。加热器模块的上面由一个或者多个加热块组成，它们中的每一个形成与微流体盒的下侧上的限定区域的热界面，用于适当操作在测定期间发生在盒的封闭通道和腔室中的生物化学反应或者分子生物反应。这些反应可以像免疫结合或者杂化一样简单，或者像耦合至烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷或者级联凝血因子的形成或者消耗的核酸扩增或酶脱氢作用一样复杂，并且对于最优反应性和特异性通常要求相对严格的温度控制。加热块(341、342、343、344，尽管本发明不限于该配置)可以是弹簧安装的并且与夹紧机构的向下压力相对地向上推动，以建立用于热传递的高热扩散率接触区。每个加热块与电阻(Coulombic)加热元件热接触，通常为了良好的导热性借助于顺应性热衬垫。每个加热块接触微流体盒中的热窗口。每个窗口通常是一薄层柔性塑料膜，可以是小于3密耳厚，并且最常见的是顺应性透明材料(诸如聚对苯二甲酸乙二醇酯)，尽管可选地为具有良好光学透明度的环状聚烯烃或者聚酰亚胺，然而并不限定于此(参见共同转让的美国专利No.7416892)，并且还具有良好的导热性。因此，在一个实施例中，本发明是用于在控制或者调制检测室中的液体试样的温度时，反射透照微流体卡中的检测室的热光学界面。该特征对于在监控与分析物相关联的光学信号的同时进行与分析物相关联的一个或者多个反应有益。在一个示例性应用中，热解链曲线用于验证FRET杂化结果。还示出了风扇壳体345，该风扇壳体345用于消散来自加热块下面的散热器的热量，并且用作用于PID控制与电阻加热电路(图20)组合的块中的温度的附件。如将在下面描述的，第二风扇(图22)用于冷却测定盒的反应室。在这种情况下，通过用抛光的铬镜面500制造在上面上来修改加热块341，该镜面500在测定期间与微流体卡200中的热光学窗口接触并且对准。在这种情况下，热光学窗口与封装在盒主体中的检测室相对应。如将在下面更详细讨论的，镜面将来自检测器头311的光(其扫描地对盒进行透照)反射回物镜315中，并且将来自盒检测室的任何荧光发射反射回检测器头中并且从检测器头到检测传感器(典型地为光电二极管)。在该示例中，加热块341不同于其它加热块，并且通常由铝机械加工而成，然后抛光并且在施加铬镜面之前在镍下面涂敷铜底层。电抛光和/或打磨可以用于在铬表面上形成高反射光学光洁度。块的光学平坦的上表面有助于热传递并且提高荧光测定的灵敏度。恰巧地，如例如对光学测定解链曲线有用的，使用反射镜允许对检测室的流体内容物同时进行加热和光学询问。可以对其它加热区类似地修改以允许同时进行温度控制或者调制的光学监控。可以针对特定测定/盒要求修改或者改变加热区和反射镜的配置，并且不限于这里示出的配置。图6B还示出了在这里具有十个出口的气动接口端口350，每个出口独立地端口连接至来自主仪器的气动分配岐管的正压力或者负压力的源并且独立地在可编程主控制器的控制下。这些出口与微流体卡的下侧中的匹配入口接口并且密封，并且互通的气动压力的定时模式、真空和压力脉冲通过气动接口路由以驱动和控制盒中的测定。图7A和7B是在对接舱103适当位置中具有可插入盒的浮动平台子组件300的透视图。为了清楚起见，已经去除了对接鞍400和附属安装元件。在图7A中可以看出微流体盒200的下表面如何成形为与图6B的加热器模块340的匹配上表面接触。由两个附接的横向法兰609和610将盒固定和支撑在浮动平台301下，该两个横向法兰螺栓连接在适当位置并且引导插入。夹紧机构在图7B中，在浮动平台300的前部部分上明显可见形成四点悬架600的插入式元件的四个垂直柱(601、602、603、604)。这些柱配有螺旋弹簧(603a，在图8中)并且插入到形成为对接鞍构件400的部分的圆柱形悬架壳体(605、606、607、608)中。悬架600用来悬挂浮动平台300和如将在下一个附图(图8)中更详细描述的光学扫描组件。整个光具座和对接舱子组件(图7A和7B所示)浮在悬架上，并且仅在如将在图9和图10中描述的夹紧机构的向下动作时被刚性地引导为与仪器的剩余部分接触。图8是从对接鞍400的下侧悬挂的具有检测器头311和对接舱103的浮动平台300的分解图。浮动平台安装有在四个支撑柱(601、602、603、604)中的每一个上具有螺旋弹簧(603a的复制)的四点弹簧悬架。每个柱容纳在对接鞍的匹配的悬架壳体(605、606、607、608)中。尽管没有示出微流体盒200，但是可以在该视图中看出，对接舱配置用于在对接舱的突出缘515处容纳盒的鼻端，使得盒停靠在较低的横向法兰(609、610)上。对准销(616、617)确保对接舱在向下压在加热器模块340上时准确地就坐。包括导轨(308、309)和用于荧光扫描的检测器头311的浮动平台的后部部分除了在对接鞍处以外没有任何支撑，并且在操作期间由对接鞍进行悬臂式支撑。导轨在支撑扫描检测器头311的运动中的作用在该视图中是明显可见的。对接鞍设置有支架712和713，用于附接如将在下面讨论的夹紧机构800和如对自动化操作有用的条形码读取器。具有槽711的连接器臂710由如下面讨论的夹紧齿轮机构和作为单个组件升高或者降低的浮动平台300接合。连接器臂710操作地将盒压在加热块上。图9A是夹紧机构的正面视图。可以看出对接鞍400的桥接形状停靠在浮动对接舱103的前部鼻端515上。紧靠对接舱口下方的是在形成用于容纳微流体盒200的通道的横向法兰609与610之间可见的气动接口端口350。如上所述，在对接装载的盒期间，夹紧机构的功能是将具有插入盒的浮动平台和弹簧安装的底架301向下推动到气动接口端口和加热器模块上。对接鞍400螺栓连接在安装板330，以及浮动平台底架301悬挂在四点悬架600上。悬架弹簧对浮动平台施加向下压力，当该悬架弹簧在上升位置中时，该向下压力受到夹紧组件800的悬挂动作的抵抗。然后，当夹紧盒时，夹紧齿轮件804由蜗轮801和蜗轮电机802驱动，以向下弧度驱动行进轮轴803。轮轴销803a附接至凸轮块(901，在图9B中可见)。连接器臂(710，在图8和10A中可见)在四点悬架上跟随夹紧齿轮401和滑动器块901的凸轮动作向上或者向下。当脱离盒时，动作是相反的。蜗轮电机802顺时针方向运行，提高销803a和凸轮块901，从而举起连接器臂710(其是平台底架组件301的一部分)，然后反向(双箭头)。当平台底架在最高静止位置中时，可以从仪器移除微流体盒。机械基准或者对准销用于在测定期间使盒在仪器对接舱中对齐。图9B是具有齿轮梳804a和蜗杆驱动齿轮801的夹紧齿轮件804的前侧的细节图，还示出了齿轮构件的前边缘上的凸轮跟随器表面805和806，该凸轮跟随器表面由压力开关使用以监控齿轮的位置并且通过主机控制器致动协调的机械功能。为简单起见，没有示出压力开关。轮轴810是夹紧齿轮件的旋转中心并且绕销810a旋转。轮轴803在齿轮件旋转期间行进，如下列附图所示驱动与平台底架接合的滑动器块。图10A和10B是示出了夹紧机构组件800的动作的机械附图。夹紧齿轮驱动的凸轮的目的是提高和降低浮动平台301。夹紧齿轮件804以固定轮轴810为轴心转动，使得行进轮轴803向上或者向下划出弧形，驱使连接器臂710垂直地向上或者向下(双箭头)。系留在销803a上的滑动器块901在连接器臂(710，参见图8)中的槽711中从左到右滑动，以在提高或者降低浮动平台300时调节夹紧齿轮的运动的横向矢量。浮动平台的向上移动受到如前述附图所示的弹簧603a的抵抗。图10B是夹紧齿轮件804和蜗杆驱动齿轮801的后侧的细节图，示出了中央轮轴810a和偏心凸轮块轮轴803a和凸轮滑动器块(901)。这里图示的机构不是限制性的，在本发明的范围内可以以替代方式实现，例如通过从底部向上夹紧而不是从顶部向下夹紧，或者通过磁性地夹紧而不是机械地夹紧。可以从螺旋弹簧、叶片弹簧、扭力弹簧、螺旋形弹簧和诸如气动罐(例如气压弹簧)和弹性体材料的替代物或者在本领域中已知的其它等效工具中选择其它弹簧工具。图11A和11B是供本发明的装置使用的可插入微测定盒1100的透视图。这里示出的盒由具有内部工件的壳体1102和盖板1103组成。端口1104用于容纳液体试样，以及前部鼻端1105用于插入到主机仪器的对接舱中。如图13所示，盒壳体中的窗口1101是在试样井1201上形成的光学窗口。垫片1106用于与主机仪器的气动接口多端口350密封地接口。从下面示出了舱内回路卡(inboardcircuitcard)1200和舱外回路卡1204。气动液压系统图12是示出了微测定盒1100的内部部件的分解图。该特定盒1100设计用于具有FRET的PCR或者分子信标检测。优选地，由本领域技术人员根据要满足的特定要求和诊断应用来确定要采用的分析反应和盒设计的细节，并且仅为了图示而提供下列详细说明。通过入口端口1104添加试样。壳体鼻端1105的鼻端上的光学窗口1101插入到主机仪器中并且对准，使得微测定舱内回路卡1200的FRET或者分子信标检测室1201的窗口由检测器头扫描，该检测器头跟随纵长地横切光学窗口的线性路径。在舱外卡1204上提供与试样制备相关的额外的处理。所有液体试剂封装在密封的可破裂小袋1206中并且必要时在气动控制下进行分配。其它试剂以干燥形式提供在卡上。流体废物隔离在吸附棉絮1207中，该吸附棉絮1207密封在塑料盖板1103下方适当位置。尽管任何特定生物化学微测定或者分子微测定的细节都超出当前范围，但是用于使核酸目标热循环和扩增的具有内部微测定通道和井的微测定回路1200包括用于任何合成的扩增子的FRET检测的检测室1201。通过垫片1106中的10个端口引导的气动供应流体地连接至卡1200和1204两者中的回路。在卡1204中的初始试样处理期间，对卡1200中的气动元件进行致动，但由于卡是空的，因此没有效果。然后，当处理的试样转移至卡1200用于分析时，对卡1204中的气动元件进行致动，但由于不再需要该卡，因此没有效果。意外的是，这实现了多路复用阀逻辑，而不需要额外的气动端口来单独地控制两个卡1200、1204。发现十个端口对于大部分测定来说足够并且与用于泵、阀和排气口的单独压力(包括正压力和负压力两者)各自地相关联，而不需要在基板330中包括的外部气动供应歧管中额外的复杂度和冗余度。图13A和13B是供本发明的装置使用的可插入微测定盒1100的平面图和立面图。示出了盒的前部鼻端1105上的光学窗口1101(鼻端插入到主机仪器中以及光学窗口由检测器光学器件扫描)。还示出了用于将盒压紧到加热器组件340和装有垫片的气动控制接口端口350的压盘表面1107。如图所示的盒是在使用时插入主机仪器中的对接舱103中的一次性盒1100。盒壳体的横向肋1110用于结构增强和帮助对接过程。图14A是具有封闭的内部气动歧管、加热器模块340和气动接口多端口350的倾斜安装板330的透视图；图14B描绘了当对接在主机仪器中时的微测定盒。在该视图中，盒流体地接合到气动控制接口多端口上并且与加热器模块340的四个区域加热器热接触。压盘表面1107上的压力朝向热界面和气动接口推动盒。安装板包括内部气动控制歧管，该内部气动控制歧管通过气动接口多端口350向盒提供调节的气动压力。在完整的仪器中，安装板330组装有压力调节器、蓄电池和用于控制卡气动的螺线管。图15是微测定盒1100的鼻端1105的分解图，该鼻端包括光学窗口1101和舱内卡构件1200。嵌套的舱内回路卡1200和舱外回路卡1204共享共同的气动控制接口(1111a、1111b)(这里与密封垫片1106对准)，并且通过经由通孔将输入流体地连接至舱内流体回路和舱外流体回路两者来共享端口。在这种情况下，舱外流体回路负责对试样预处理；舱内回路容纳预处理的试样并且针对目标分析物对其进行分析。通过多路复用舱内卡与舱外卡之间的气动接口中的气动供应端口来实现减小的接口复杂度。气动首先可以用于舱外电路中的流体操作，然后用于舱内电路中的流体操作，令人惊奇地解决了经济地管理复杂电路的问题。更一般地，气动接口阵列包括由通孔流体连接的多个气动端口，该通孔将第一回路卡中的气动回路流体地连接至第二回路卡中的气动回路，使得多个气动端口能够接收根据可编程指令施加的多个气动脉冲并且将那些气动脉冲多路复用至第一回路卡和第二回路卡的流体回路元件，从而减少操作所述第一液压回路和所述第二液压回路需要的端口数量。例如，施加至第一通孔处的气动接口的气动脉冲通过流体连接迫使处理的液体试样从舱外回路卡到舱内回路卡，诸如将在下面更详细描述的，当第一卡设计为从试样提取核酸以及第二卡设计为扩增和检测分子目标时，这是有用的。凸台(boss)1108具有狭窄的横截面以限制舱内卡中不必要的热传递，并且还用来向围绕较大气动隔膜构件的限定圆周传递压缩载荷。销接收孔1109a、1109b用于在将新盒装载到主机仪器中时将对接舱103中的盒对准到销510a、510b上。图示的特定盒设计用于具有热循环和FRET检测的PCR。舱外卡1204旨在用于使核酸部分与试样隔离。具有用于热循环和扩增核酸目标的内部通道和室(1115、1116)的流体回路卡1200包括用于对任何合成的扩增子进行FRET检测的试样井1201。还描绘了用于cDNA合成的室1114。示出了三个平行测定通道。其它回路配置可以与本发明的微测定检测系统一起使用，并且测定不限于三个通道或者通过PCR的核酸检测。图16是没有微测定盒的安装板330的平面图，示出了通过气动接口多端口350的截面图的位置。还示出了用于接收盒和加热器组件340的对准销510。其它孔是打算用于安装与延伸穿过安装板的气动歧管流体连通的气动系统部件的端口，其可以由例如已经通过溶剂熔接熔合或者通过三维打印过程制成的层状丙烯酸脂制成。图17是通过在图16中部分切口处的气动控制接口350的截面图，示出了用于接合通向舱内卡1200中的气动通道的通孔(cf1120a，1120b)的端口。十个端口351通过通孔连接至气动通道1121表示的封装在安装板330中的气动歧管。还示出了用于使卡的气动接口端口靠着卡气动控制接口350就坐的盒对齐销510a、510b。这里在块轮廓中示出的卡1200具有内部气动工件，该内部气动工件响应于从气动分配岐管330通过气动接口多端口350施加的加压气体脉冲而工作。卡中的内部气动工件包括在由主机控制器提供的阀逻辑的控制下可操作的阀树、用于使流体移动通过回路的隔膜泵和用于在气动控制下分配流体的流体储存器。对多端口的需要涉及在卡上布局阀逻辑的方式和对多个压力的需要。通常需要处于正压力和负压力两者的气动供应，并且已经发现若干中间压力水平是有利的。尽管不限于此，已经发现有用的压力包括用于操作泵的+10psig、用于打开阀的-5psig(诸如WOPubl.No.2002/081934中描述的隔膜阀)以及零压力排气口。如此处所示，可以与盒接合多至十个气动互连。根据盒的复杂度，如果需要，可以通过对气动接口进行调整大小或者重新配置使用更少或者更多的端口。分离微测定盒1100的气动通道和气动歧管350的对应端口的是硅橡胶垫片1106，或者是一般顺应性的弹性体垫片，其在当盒装载到仪器中并且施加弹簧压力时在压缩下密封气动互连。垫片1106充当单次使用密封垫片并且有利地配有一次性盒，而不是按照传统认知作为仪器的部分。通过包括具有一次性盒1100的垫片，获得气动接口处的较好和较干净的密封，并且消除周期性替换垫片的需要。垫片通常由硅橡胶或者其它顺应性材料制成。使用本发明的气动回路，还可以通过在主机仪器中提供多个气动源来多路复用回路，其中连接歧管350中的气动供应回路可以从一个气动压力切换到另一个气动压力(诸如从正压力切换到负压力)而不需要额外的气动回路。因此，可以在多个压力状态下操作基板350中的每个歧管子回路。以这种方法，可以通过共同的气动接口端口阵列多路复用向可用较强的气动压力操作的回路元件进行的较强气动“状态”的分配和向可用较弱气动压力操作的回路元件进行的较弱气动状态的分配。类似地，可以通过共同的气动接口端口阵列多路复用向可用较强的气动压力操作的回路元件进行的较强气动“状态”的分配和向可用真空压力卡操作的回路元件进行的真空气动状态的分配。通过用共同气动接口连接第一回路卡片和第二回路卡，实现气动回路的双重功能性。通常从一系列正压力和负压力中选择压力状态，包括但不限于，-5psi、+10psi、+12psi、+15psi、+20psi、+7psi和0psi，例如，其中较高压力用于破裂试剂包，以及负压力用于打开阀等等。这些压力可以由缓冲的压力储存器提供。还可以使用拨号可变压力供应。在微处理器控制下通过歧管子回路向盒提供气动状态。每个测定由要根据使流体移动通过液压回路所需要的气动阀和泵逻辑来执行的一系列步骤组成。排气口也是回路的必要部分以及根据每个单独测定类型的要求，加压、反向压力和排气都在仪器和关联的微测定回路的能力内。图18是在使用位置中具有叠加盒1100的安装板330的平面图(接触微测定盒1100下侧的气动接口350和加热器模块340在盒下方)；示出了穿透盒和加热器模块的截面图的位置。温度控制系统图19是截面中的加热器模块和盒1100的鼻端1105的视图，引用图18上标记的横截面位置。为了标记，将盒提高到加热块341-344之上。气动互连模块350(指示了两排端口)接合盒的一次性垫片1106，参照图17和15对其进行了功能性描述。还示出了配置为接触核酸扩增回路的单独的室的四个电阻区域加热块(341、342、343、344)。成对的对齐销510对准盒壳体，使得块的热表面适当地接合流体器件。台阶511支撑盒的鼻端1105。区域加热块341是热光学界面，并且包括接触流体回路构件的镜面500。盒壳体中的光学窗口1101与镜面对准，并且检测器头沿着轨道308、309(图4)滑动，使得检测器头311的物镜组件315沿着加热块341的长轴中间下行。回路中的检测井定位为在热块和光学窗口下的镜面上排列起来。对块341进行温度控制以用于FRET确定。在启动测定之前将电阻加热块342调节至双链核酸变性温度，并且将块343设定为退火温度。退火块343设置有冷却片343a和鼓风机345，使得从变性室输送的热流体可以迅速地冷却，从而加快热循环时间的速度。如果需要，块344用于cDNA合成。流体回路可以包括覆盖加热块342和343的一对流体容室。成对的室包括如在美国专利No.7955836和No.7763453(其是共同转让的)中描述的可协作操作的气动致动的隔膜，用于使如对通过热循环进行的核酸扩增有用的变性温度与退火温度之间的流体流动往复。每个加热块是弹簧加载的并且压靠在流体回路的下侧。这里示出的弹簧是由于它们的紧凑性而选择的金属丝弹簧。图20是加热器模块的分解图。示出了四个加热块，每个块与具有电阻加热元件(347a)和居中定位的热敏电阻器(347b)的印刷电路带347相关联，电阻加热器在PID型反馈环路控制下。示意性地绘制了印刷电路上的支持电路并且该支持电路由主机控制器控制。每个块浮动在弹簧支撑348上并且设置有顺应性电连接，以在限制的垂直范围中自由地移动。块通过具有断流凹槽的绝缘体护套346彼此隔热。加热块夹到支撑安装板349中形成的槽中。金属丝弹簧348配置为用轻度的力向着卡1200的顺应性塑料下表面推动块，以减小用以热传递的电阻。图21是描绘负责盒与加热块之间的热接触的夹紧力和弹簧力的平衡的示意图。如参照图5至10所示，浮动平台301的对接舱103安装有4点悬架600，使得四个角柱(601、602、603、604)中的每一个上安装的弹簧偏置为一旦盒已经就座则在盒上向下按压。夹紧机构800是蜗轮驱动的并且相对于加热器模块中的台阶511和对齐销510挤压盒。每个加热块是通过每个块下方的独立弹簧构件相对于舱内回路卡的下表面向上推动的浮动构件。安装在加热器模块中的金属丝弹簧相对于垫片1106和舱内流体构件1200的下侧向上按压块，以相对于气动分配岐管330上安装的多端口350密封卡气动接口。以这种方法，盒由夹紧组件的较强悬架弹簧锁定在适当位置，并且加热块通过加热器模块组件的较弱弹簧与舱内卡热接触，从而要求较小的制造精度。盒由两个相反的弹簧力夹在对接舱中。横向加强肋1110加固盒；确保舱内回路卡与加热构件更顺从地热接触。跨越加热构件表面的向下弹簧悬架力是大约5psi以及向上弹簧力是大约1psi，弹簧协作地作用以夹紧盒和相对于打算加热的舱内卡的下表面按压加热块。为了图示还示出了卡1200部件，包括cDNA井1114、退火井1115、变性井1116以及在光学窗口1101下对准的检测井1201。同样如图21所示，在邻接流体室的盒壳体的内部表面上形成凸台1108。凸台将弹簧加载力集中在流体隔膜元件周围，其中需要压缩以确保下层加热块与回路的流体内容物之间的低热电阻。这些凸台1108配置为低热横截面并且通过从壳体去除质量形成，其将以其它方式增大cDNA合成和热循环室周围的寄生热消耗和热电容。由于舱内流体构件悬浮在扩增回路上具有空气间隙的盒壳体下方，因此还横向地呈现低热横截面，从而减少区域加热器之间的热串扰和传导热损耗。加热块之间插入的绝缘护套346还用于将每个热区域隔离和维持在正确温度下，并且避免电阻加热元件之间的对流热串扰。包括试样井的微测定盒的鼻端1105还形成为较薄以避免过多的热质量。图22所示的鼓风机360通过带挡板的管道361引导到盒的鼻端上并且对FRET确定有用。在FRET中，分子信标在高于目标分析物种类的解链温度的温度下与检测室中的单链扩增子混合。随后在采集荧光发射时，使用强制的冷空气降低温度。鼓风机安装在仪器底架的外墙359上。在一个说明性实施例中，随着混合物冷却，分子信标退火至目标序列，淬灭探针中的荧光。荧光的实时监控产生可以用于确认目标扩增子的身份的解链曲线。为了进行测试，使区域加热器341达到高于目标种类的解链点的温度，关断加热器以及接通鼓风机360并且将鼓风机360引导至光学窗口1101周围和下面的盒的鼻端1105处。监控反应混合物和荧光中的温度。当光学地监控荧光变化时，温度响应于循环空气而非常迅速地下降，允许重复要在每个试样井上迅速进行的FRET确定。因此，在一个实施例中，本发明是用于进行FRET解链曲线确定的方法，包括a)将包括FRET探针和目标核酸序列的试样室加热至高于二重探针的解链温度的温度；b)关断所述加热；以及，c)使用具有自主ODAP守护进程的屏蔽的检测器头，当响应于通过打开风扇和将周围空气流引导到试样室上(从而在监控荧光时迅速地冷却所述试样室)引起的试样室的温度变化，监控FRET探针的荧光变化时，跨越试样室扫描检测器头。对根据温度的荧光强度的导数的分析产生感兴趣的扩增子的解链点特征。已经证明，可以使用本发明的盒的低热质量在小于一分钟内做出这些确定。如果需要，加热块341可以设置有冷却片以及独立地空气冷却，以加速测量，但通常这是不需要的。光学系统图23是具有分别地用于对激发和发射进行检测的电子隔离电路板(1301、1302)和两个光学通道的双通道检测器头1300的透视图。在该视图中，去除壳体1303的上半部以示出检测器头的内部部件。双通道由物镜(1310、1330)和光路A和B(标记为A和B的空心箭头)标记。SMDLED激发光源(1311、1331)安装在源LED印刷电路板(1301)上，该源LED印刷电路板通过边缘型电阻销连接器(1304)成直角连接至传感器PCB(1302)。光电检测部件安装在传感器PCB(1302)上。法拉第笼元件(1306)用于屏蔽光电二极管(1317)和(1337)以及周围高增益放大电路。由表面安装的LED(1331)在目标通道(箭头A)中提供荧光激发，该LED被选择为匹配目标荧光团的激发光谱。源LED(1331)发出发散光束，以及辐射的光束随后由源激发透镜(1332)准直。源透镜(1332)是其平坦表面面向LED的平凸透镜。准直的光束可以随后穿过激发带通滤光片(1333)，在与图20相关联的描述中对其目的进一步进行了解释。准直的滤波的激发光束随后从安装在与入射束成四十五度角处的分色镜元件或者分束器(1334)反射，并且穿过平凸物镜(1330)以及通过检测器壳体中的外窗(箭头A)。在通过透镜1330之后，激发光通过嵌入微测定盒中的检测室(未示出，参见图14-17)聚焦，该检测室包括具有任何目标荧光团的试样液体。通过在微测定盒后面使用后反射镜使激发光通过试样液体的路径长度加倍。目标荧光团由入射光束激励。通常以比激发波长长的波长发射荧光团，并且该荧光团的发射移位等于目标荧光团的斯托克斯(Stokes)位移的量。从检测室中的目标荧光团返回的发射的一部分由平凸采样透镜1330采集并且在打到分色镜1334之前准直。可选地，菲涅耳(Fresnel)透镜可以用于进一步减小透镜与试样之间的工作距离，以优化发射光的采集，该发射光还由安装在检测室后面的加热块上的后反射镜强化。由于二向色分光镜1334具有激发波长与发射波长之间的波长截止，因此分色镜1334现在充当用于发出的荧光光束的通带光束分离器和用于激发光的阻带滤光片。它在反射所反射的激发光和通过物镜窗口进入光路的任何周围光时透射发出的荧光。穿过二向色分光镜1334的发射光随后穿过发射滤光片1335，在与图20相关联的描述中对其目的进一步进行了解释。离开发射滤光片1335的光随后穿过平凸传感器透镜1336，其中该光聚焦到表面安装至PCB1302并且由法拉第笼1306保护免受电噪声的光电传感器1337的表面上。在具有对照激发LED1311、平凸激发透镜1312、激发滤光片1313、二向色分光镜1314、物镜1310、对照发射滤光片1315、平凸传感器透镜1316和对照光电二极管1317的第二(对照)通道中重复上面描述的光学路径。来自两个光电二极管的输出由三级跨阻抗放大器放大，该三级跨阻抗放大器内置到紧挨着光电二极管的板中并且通过与放大器小心屏蔽的销接地到传感器PCB上的嵌入式微处理器。在一个实施例中，如通过利用荧光素和得克萨斯红作为荧光团例示的，激发LED1331是具有用于传送485±12nm的基本上单色的光的带通激发滤光片1333的470nmLED，该470nmLED用于目标通道，以及具有带通滤光片1313的590nmLED1311用于对照通道。对激发LED进行调制或者使用130Hz的选通速率选通为打开和关闭，以过滤50或者60Hz处和与荧光顶部照明相关联的谐波频率处的AC电力相关的噪声，同时滤波与杂散周围光相关的幻象(phantom)信号和可能存在于30或者60Hz处的电噪声。局部反馈传感器用于监控和稳定源LED输出强度。荧光团发射的检测监控与在由主机控制器控制的步进电机的供电下的检测器头轨道上的移动相协调。嵌入式微处理器和检测器头中的关联电路设置有RAM存储器、ROM存储器、A-D转换器、三级跨阻抗放大器以及用以处理这些功能的信号处理和命令序列固件。光电传感器1317和1337中的每一个安装在共同的PCB1302上。来自这些光电传感器中的每一个的输出信号分支直接连接到相应三级跨阻抗放大器(未示出)的前置放大器或者第一级。PCB1302广泛利用硬件噪声减小部件，尤其是嵌入式地平面和法拉第笼1306以最小化任何RF或者电磁干扰对输入信号不必要的效应。通过法拉第笼、旁路电容器、信号调节前置放大器、单独的接地层、金属化的检测器头壳体或者它们的组合将放大器与电子噪声屏蔽开，并且放大器与传感器紧密地电气邻近。光学信号获取、预调节、放大和数字化由屏蔽环境中操作的自主守护进程控制。这些硬件噪声减小元件与在检测头中的局部控制下的光学数据获取、数字化和处理方法的组合导致对不必要的噪声的效应基本上免疫的检测器设计。三级放大器可以配置为高达1014的增益，并且根据需要可选择地配置为102、103、106、1010、或者1012的增益。我们已惊讶地发现将信号处理封装在扫描头中，通过最小化信号路径长度并且允许在必要处(诸如围绕传感器二极管引线和在激发电路板与传感器电路板之间的连接处)有效使用法拉第屏蔽实现了具有提高的信噪比和灵敏度的隔离的低噪声环境。可选地，检测器壳体可以由铝制造或者涂敷导电聚合物并且接地以进一步使内部电子设备与不必要的干扰屏蔽开。有利地，在该环境中实现了较高的信号放大。图24A和24B是荧光检测器头1300的内部光学部件的示意图，示出了在微测定盒1402中具有光学窗口的外部光学界面以及在加热块1410的表面上的盒后面安装的后反射镜1400，该加热块1410用于控制或者斜升封装在盒中的检测室中的温度。不依惯例地，尽管多个独立光路或者“通道”在单个检测头中形成并且共享电子PCB和下游信号处理电路，但是激发光学器件安装在一个电路板上以及检测光学器件安装在另一个电路板上以减少噪声干扰。两个板由销连接1304安装的转角电耦合并且使用单独接地层上安装的旁路电容器电子地隔离。图24A中示出了用于激发微测定盒1402内的检测井或者试样井(1403a或者1403b)中嵌入的荧光团的光跃迁(transition)。头是扫描头并且跨越微测定盒1402移动(双箭头)。来自PCB1301上的激发LED的光由透镜1332准直并且由带通滤光片1333使其基本上单色。通过由物镜1330聚焦在试样上的入射光1420激励检测井1403a中的任何一个或者多个荧光团(无论是对照荧光团还是目标荧光团)。在图24B中，一个或者多个荧光团的发射由物镜1330采集，并且在穿过二向色分光镜1334、发射滤光片1335和传感器透镜1336之后透射到传感器1337。传感器1337与高增益晶体管的底座直接电接触，该高增益晶体管放大输出信号并且屏蔽在法拉第笼1306中。通常根据荧光团的斯托克斯位移以较长的波长发出荧光，使发射光能够在没有损耗的情况下穿过分色带通反射镜1334和发射带通滤光片1335。镜面1400用于增大目标上的发射光量、使激发路径长度加倍以及提高发射采集效率。因此，从试样室1403a返回到物镜1330的光是发出和反射的荧光1421以及反射的激发光1420的混合物。提供光阱以捕获杂散反射。反射光1420不通过分色镜1334并且返回至源，并且不干扰传感器1337处的发射强度的测量。单个通道的光学元件(包括激发源、源准直透镜、激发滤光片、分色镜、物镜、激发滤光片、传感器透镜和具有放大器的检测器)构成光学模块，该光学模块具有基本上单色源波长和用于按照目标(或者对照)荧光团的特定波长特征检测荧光的高特异性传感器。一个光学模块或者通道可以用于测定目标，另一个模块用于对照通道。串联安装的光学通道可以用于收集关于多个荧光团的数据，其中在传输至主机仪器之前通过在驻留守护进程的控制下的嵌入式微处理器对电气处理进行多路复用。如图所示，两个通道中的每一个共享两个电路板中的每一个上的电路，但是具有单独的光学器件。可选地，可以通过复制所示光学元件的过程将额外的通道并入检测器头。微测定盒1402能够相对于检测器头1300移动(双箭头)，并且检测器头或者盒托盘或者安装底架的机动化允许扫描：例如，跨越盒1402的横断面允许在试样室1403a和1403b上进行测量。通过使用并排安装在检测器头中的多个检测光学模块，可以扫描试样室以用于串联的多个荧光团。根据一个实施例，激发电子设备安装在印刷电路板(1301)上，以及检测电子设备安装在第二PCB(1302)上。边缘连接器1304电连接电路板。法拉第笼1306保护传感器和关联的高增益放大器免受杂散电磁噪声的影响。在加热块1410的上表面上制造反射镜1400，其也起热传递的作用并且在测定期间控制试样流体的温度。加热块1410的温度可以在扫描期间斜升，例如如当在自主过程中由检测头中的嵌入式处理器获取光学数据时，在主机控制器的控制下进行具有温度和运动功能的FRET解链确定中。图25A和25B示出了用于目标和对照的混合荧光团(在这里由荧光素和得克萨斯红图示)的典型系统的激发和发射光谱。如图25A所示，曲线2001是针对荧光素的激发光谱(虚线)；曲线2002是发射光谱(实线)。如图25B所示，曲线2003是针对得克萨斯红的激发光谱(虚线)；曲线2004是对应的发射光谱(实线)。在这里，对照是通道B(图25B)以及目标是通道A(图25A)，但是分配是任意的。加框区域ExA指示允许穿过目标激发带通滤光片1333的波长带。框EmA指示允许穿过目标发射带通滤光片1335的发射通带。框ExB指示允许穿过对照激发带通滤光片1313的波长带。框EmB指示允许穿过对照发射带通滤光片1315的发射通带。框指示在最大值的任一侧上存在阻带。可以从图25A和25B看出，考虑到针对这两个荧光团和具有如图所示配置的通带特征的光学滤光片的光谱，校正下列误差条件：a)来自目标LED1331的长波长激发光(大于LED峰值激发的波长)不会被错误地混淆为目标荧光发射，这是由于这些较长波长由LED激发滤光片1333截止；b)来自对照LED1311的长波长激发光(大于LED峰值激发的波长)不会被错误地混淆为对照荧光发射，这是由于这些较长波长由LED激发滤光片1313截止；C)目标荧光发射不会被(激发过滤的)对照LED1311无意中触发。否则，该误差条件将导致对照光电传感器1317从目标和对照荧光团两者接收不必要的同期信号。以及d)控制荧光发射不会被(激发过滤的)目标LED1331无意中触发。否则，该误差条件将导致目标光电传感器1337从目标和对照荧光团两者接收不必要的同期信号。测定验证意外发现地，可以在双头和多头检测器中对自主检测器头功能进行多路复用，所述双头和多头检测器包括用于检测个体荧光团的单独光学通道，使得每个通道包括用于照射激发光的LED，具有激发滤光片、发射滤光片、调谐为使能检测来自限定通带中的荧光团的发射的分色镜的至少一个光路，用于聚集所述激发光和用于采集所述发射的物镜、用于接收任何通带发射的传感器以及用于放大来自传感器的输出的高增益放大器，其中每个LED配置为照射使得通道的照射频率不重叠的频率范围中的光，每个光学通道被配置为使得通道的发射通带不重叠；以及在由嵌入在检测器头内的微处理器执行的固件中驻留的自主守护进程的控制下，将所述多个通道的所述放大器的输出多路复用地数字化并且制表在易失性存储器中。对于测定验证，提供两个传感器通道(或者更多个)用于监控两个或者更多个荧光团，两个传感器通道被配置为使得来自每个荧光团的发射通带不重叠。在优选实施例中，第一检测通道用于检测目标信号的目的以及第二检测通道用于检测对照信号的目的，以及当且仅当报告了有效对照信号时才报告测定结果。该系统已经证明对要求成对采集“biplex”或者多路复用的目标信号和对照信号的测定协议的验证有用。其中，关于FDACLIA弃权要求，将目标模板和对照模板两者并行放大，在可以报告或者宣布关于测试试样的测定结果之前必须存在正对照信号。在没有可检测对照信号的情况下，检测的任何目标信号都不是有效结果。如果满足该条件，则根据1988的临床实验室改进修正案(CLIA)，可以放弃管理简单的低风险测试的规则，并且在医生办公室和各种其它位置中在没有监督的情况下进行测试。为了满足这些CLIA弃权要求，需要荧光检测器不仅能够检测例如由PCR放大扩增的目标传染性有机体的存在，而且还能够检测与目标共存并且由相同PCR反应或者仪器中并行进行的PCR反应扩增的内源性人为控制有机体的存在。这种方法要求用于这种分子诊断测定的荧光检测器可以具有将目标荧光团和对照荧光团的存在确定为共同检测室中的“biplex”扩增反应混合物的能力。在一个方面中，使用具有荧光激发和发射光谱的正扩增对照荧光团，该荧光激发和发射光谱被定位为由选择性带通滤光片从针对目标荧光团的荧光激发和发射光谱(按照波长)很好地分辨(例如参见图25A-25B)。然而，根据本发明，证明可以通过使用双头检测器以及通过扫描每个检测室两次实现优秀的分辨率，每个头一次，首先检测对照荧光特征，然后检测目标试样荧光特征-每个扫描途径要求单独的激发和发射光学器件。通过用完全分隔的并且独立的光路配置这些检测器发现了好处。在本发明的该方面中，使用双重头设计确保试样中扩增对照荧光团的存在不会由于“串扰”而在目标通道中无意中地产生信号。这种情况将产生分类为“假阳性”的试样。相反地，从目标通道到对照信道没有串扰也很重要，这在多个信号共享共同的光路时是可能的。这种情况会导致正扩增对照在其可能不存在时被无意中地认为存在。通过利用荧光素或者等效的荧光团作为用于目标分子探针以及利用得克萨斯红或者等效的荧光团作为用于对照的分子探针来例示这些原理。一个检测通道优化用于检测荧光素以及另一个检测通道优化用于得克萨斯红的双头检测器被发现对于测定biplex扩增混合物惊人地灵敏、精确和健壮，两个检测通道各自具有单独的激发和检测光学器件。由驻留的守护进程对每个光学通道进行单独的荧光读取。令人惊讶地，该程序提高了分辨率并且最小化了串扰，但没有贡献于由于移动检测器头的机械器件较高的噪声或者灵敏度损失。图26A是在荧光目标(在该实例中根据分子诊断测定指示疟疾核酸的存在)存在于嵌入在微流体盒内的检测室中的情况下，由检测器的目标通道接收的信号水平的曲线。在该情况下，可以从轨迹看出，目标通道在900mV范围中从检测室接收荧光信号。在这种情况下，来自目标通道的“疟疾正”信号等于空检测室的“背景”信号水平的大约14倍。轨迹是平滑的并且指示屏蔽的检测器头内扩增回路中的低电子噪声水平。图26B是在荧光目标(在该实例中根据分子诊断测定指示疟疾的存在)存在于检测室中的情况下，由检测器的对照通道接收的信号水平的曲线。在这种情况下，可以从轨迹看出，对照通道具有40-50mV范围中的输出(基本上等于预扫描基线)，如当扫描仅具有目标信号而没有对照荧光团的检测井时，指示目标光学通道与对照光学通道之间串扰的可忽略水平。图26C是在荧光目标(疟疾、得克萨斯红荧光团)和荧光对照(内源性人的对照、荧光素荧光团)在嵌入微流体盒内的单个检测室中一起扩增为混合物的情况下由检测器的目标光学通道接收的信号水平的曲线。在这种情况下，上部轨迹显示在第一光学通道中接收了大约680mV的目标信号水平，其中目标信号与得克萨斯红标记的疟疾扩增子相关联。这相当于来自空检测室(下部轨迹)的信号的大约10.5倍的水平。这指示正确识别biplex试样的“疟疾正”组分的存在的检测器功能。图26D是在荧光目标(疟疾)和荧光对照(内源性人为对照)在嵌入微流体盒内的检测室中一起存在的情况下由检测器的第二光学通道接收的信号水平的曲线。biplex试样混合物与图26C的biplex试样混合物相同，并且信号与荧光素标记的内源性对照扩增子相关联，表明没有来自目标扩增子的串扰以及良好的信号稳定性和免于电噪声干扰。在这种情况下，轨迹显示由对照光学通道接收大约160mV的信号水平。这相当于来自空检测室的信号的大约3.6倍的水平。这指示关于在单独的光学通道中正确识别biplex试样的“对照正”组分的存在的检测器功能。因此，在单个井中检测到目标扩增子和对照扩增子，如按照CLIA弃权要求指示成功的“biplex”测定。由于没有用白光进行激发，而是以对个体荧光团特定的波长作为替代进行激发，因此第二荧光团的淬灭不是问题。这里描述的系统使用物理方法和信号处理方法的组合实现健壮的测定性能，诸如在临床实验室的受控环境外部进行可靠操作所需要的。图27是用于控制荧光激发以及接收、处理荧光发射信号和向主机仪器传递荧光发射信号的检测器头1300电子设备和光学器件的框图。光学通道再次由空箭头A和B标识并且终止于传感器1817和1837。通道A作为对照通道以及通道B为目标分析物通道，但角色是可互换的。每个通道中的电子功能块、源(1811、1831和关联电路块)和传感器(1817、1837和关联电路块)是相同的(除了通道A和B配置为不同波长以外)。检测系统可以配置为UV、可见区和近红外光谱的波长。具有近单色输出的可用光源、滤光片、发色团和荧光团允许在300至900nm范围内调谐激发和发射通带。对于以荧光检测模式(其是本发明的优选操作模式中的一个)的应用，装置可以配置用于具有UV和可见光谱中的激发光谱的特定荧光染料以及在UV、可见和近红外光谱中的发射。尽管红移更典型，但是还可以使用上转换的荧光团。在检测器头1300内，由130Hz频率的方形波对与源激发电路(1811、1831)关联的LED中的每一个进行调制。该调制的理由与来自下列潜在噪声源的噪声降低措施相关：1)50/60HzAC电源；2)来自荧光的100/120Hz二次电源谐波；3)50/60HzAC的三次以及更高次谐波；4)130Hz以及更高的差分频率(隆隆声)；以及5)来自光电二极管传感器、第一级反馈电阻器和放大器的宽频带白噪声。为了从有噪声的源取回有用信号，采用下列减轻方法：1)为了避免混叠并且同时限制噪声带宽对所取数据进行快速采样和取平均值；2)为了拒绝所有未校正的组分(选择130Hz的调制频率以提供与50/60Hz电源至少10Hz的差以及100、120、150和180Hz以及更高处的谐波)，以130Hz调制LED光以及与130Hz的所检测的荧光信号的相关；以及3)还对相关数据进行过滤和处理，以从50Hz或者60Hz或者其谐波的主电源消除电磁噪声。使用由FAN5612LED驱动器驱动的130Hz方形波来接通和关闭激发LED。每个驱动器能够在要求的频率下消耗高达120mA的电流(三个输出中的每一个上40mA)。检测器头微处理器的时钟频率用于选通激发LED以及使传感器二极管中的脉冲采集同步。发现这些特征在没有特定荧光信号的情况下从传感器产生安静输出并且使能更高的放大。用于源LED的电路板1801可以支撑多个LED，以及用于传感器电路的电路板1802可以支撑多个光电二极管。使用单独接地层上的单独PCB板(1801、1802)上的旁路电容器电子地隔离激发和检测电路，以进一步通过销连接1804减小任何可能的串扰。每个光电二极管被屏蔽并且与多级高增益放大器(1818、1838)紧密地相关联，以及两个电路板与单独的接地电子地隔离。在检测器头中，来自传感器光学器件的电气输出在前置放大器中进行调节并且馈送到三级放大器中。来自放大器的三个输出中的每一个具有多个对数比例的增益，其中最高放大因数高达1014。三个输出馈送到集成到嵌入式微处理器中的A/D转换器中，并且一个数字输出(由固件选择的输出)作为数字化分数总线连接至存储器。有利地，将模拟和数字信号处理电路隔离在屏蔽的检测头内实现了允许非常惊人高的增益因子(高达1014，以及在选择的实施例中为在三级中1012与1014之间)的低噪声条件。通过将数字化电子设备定位在紧挨着传感器的检测头内，以惊人的少的噪声干扰实现具有高增益的放大的信号。还向运算放大器提供缓冲的和过滤的基准电压以确保放大的信号输出中的最大稳定性，该放大的信号输出在与嵌入式微处理器1841相关联的A/D转换器中数字化；因此，在扫描检测器头内发生数字化。尽管上面是硬件的描述，但是由固件中编码的“ODAP守护进程”进行检测器头中的信号处理算法和放大器电光学器件的实际操作，该“ODAP守护进程”起“虚拟机”的作用。尽管守护进程基本上是指令集合，但驻留在与嵌入式微处理器数字地相关联的非易失性存储器中的检测器头中，并且一旦调出，则与相对于主机控制器独立地工作。固件(用于控制扫描检测器头的光电子功能和信号获取的专用板载指令集)典型地驻留在套接的EEPROM芯片1842中。守护进程控制检测器头中的嵌入式微处理器1841。在对放大的信号进行数字化之后，守护进程能够进一步地信号处理，例如将光学数据与背景扫描进行比较和/或在向主机系统报告数据以用于显示给用户之前关于荧光是否是正测定结果做出复杂的确定。我们惊讶地发现检测器头中的嵌入式微处理器、主机控制器和两个处理器可以协调为使得ODAP守护进程能够在检测器头在主机控制器的外部控制下移动时构造试样区域的空间图。ODAP功能自主地进行采集信号数据，例如，当主机控制器对检测室中的温度进行解链/退火子例程时，使得在主机控制器例程中重新编程的测定不影响或者冲击在守护进程的控制下进行数据获取和报告的操作，显著的优点在于根据从测定盒读取的条形码，可以由主机控制器执行若干测定协议中的任何一个。使用检测器头内部的嵌入式微处理器1841的一个优点是可以将“光学数据获取和处理”(ODAP)的专利方法编程到检测器头中的固件中，以在向主机控制器传递干净的数字化信号之前消除噪声。因此，ODAP守护进程是必要时由主机处理器调用一个或者多个独立的子例程-但是一旦发起，守护进程和关联的光电子学设备在嵌入固件的独立控制下自主地运行。实际上，已经证明可以在检测器头内完成整个分析并且仅仅向主机仪器传递总分或者测定结果。不同于模拟信号，从检测器头到主机仪器的数字传输不易受到由仪器壳体内发生的有噪声的模拟策划引起的干扰的影响。如当前实现的，当跨越盒线性地扫描检测头时，ODAP守护进程连续地并且自主地运行。这里“守护进程”指的是用于光学数据获取和处理的可编程指令集的操作，该可编程指令集存储在由嵌入式微处理器执行的固件中，作为自主后台进程而不是在交互性用户或者由主机控制器的直接控制下。在某种程度上，守护进程是操作和控制电子电路的虚拟机，该电子电路定位在检测器头中使得它可以免受与主机操作相关联的外部电子噪声的影响。因此，本发明包括用于使微测定自动化的方法，该方法包括操作地将测定划分为由主机控制器控制的流体过程、机电过程和热过程和由扫描检测头中驻留的自主守护进程控制的光电子过程，其中扫描检测头的运动由主机控制器控制，以及任何光学信号获取和处理由自主守护进程控制。通过图示和示例的方式，各自用于分析液体试样的三个检测室设置在由检测头扫描的光学窗口中。扫描时间为大约30秒以及扫描长度被分成大约500步长。尽管检测器在130Hz下工作，但是数字化速率更高，使得可以在每个扫描期间进行12000至24000次荧光测量。将传感器二极管输出存储并且取平均值，使得当以130Hz选通LED以消除非特定光电二极管输出时，可以从亮半周期减去暗半周期。在板载固件的控制下以100ms增量进一步地处理数据集。因此，根据步进电机的特征和扫瞄的长度，在检测头中的本地存储器中制表的数字化分数由在100ms内获取的处理的信号组成并且与线性扫描中的一个或者仅几个步骤相对应。因此，与信号相对应的“光斑大小”相当小但没有高分辨率数字像素那么精细。每个数字分数具有与在LED接通时间间隔期间累加的所有放大的电流减去在LED关闭时间间隔期间任何周围信号相对应的值。守护进程被同步以跟踪步进电机致动，并且累加荧光输出分数对比光学窗口的宽度内的扫描距离(位置)的表格。通过在测定之前进行基线扫描，随后确定由与测定反应相关联的染料、色原或者荧光团引起的任何“新”信号(即，基线上的任何改变)的数量。在完成背景减法之后，如果需要，还可以使用阈值进一步地过滤基线上的信号变化。可以通过硬件和固件装置的组合实现数据采样、滤波、数字平滑和调节，固件指的是守护进程指令集。在跨越试样井的扫描期间获取的数字分数的可编程统计分析可以是参数化的或者非参数化的。根据特定于每个试样井的每个数据集，扫描横断面上的分数分布是比在井上取的平均值、中间值或者众数值更好的测定真值(对于目标分析物或者对照为“正”或者“负”)的预测因子。基于具有许多点的分步函数的结果还优于通过以低分辨率询问井获得的光学平均的信号。平均值会导致假阴性，而我们已经发现高信号尖锋的模式(即使局限于井的特定部分)非常可能与正测定相对应。固件配置为评估数字分数的强度和信号尖锋的频率，以及使数字分数的强度和信号尖锋的频率与正测定结果对比负测定结果的期望范围相关。数据集可以被看作群体统计，其中根据强度排列的30个测量值的群体例如与根据变化的统计分析依据零假设期望的分配相比较。用于非参数化地评估数据的统计工具也是可适用的并且可以编码在固件中。因此，在优选实施例中，检测头的板载能力包括将测定结果输出为数字“一”或者“零”(与是否已经检测到分析物(真或者假)相对应)，以及还有对应对照的状态。令人惊讶地，我们已经发现通常在嵌入式固件内的守护进程的控制下，数据集中的由于气泡以及其它不规则性的像差可以由向1比特数字分数的转换来管理。对嵌入式微处理器的输入进行多路复用使得可以同时测定若干目标分析物和对照物。检测器头设置有至少两个或更多个光学通道，各自具有在离散波长下操作的独立的激发光学器件和发射光学器件。不使用白色激发光以消除多路复用的测定(诸如当目标荧光团和内部对照荧光团混合在共同液体试样中时)中不同荧光团之间的可能串扰。对于目标和对照使用“一锅法”条件起因于证明用于正对照信号的条件存在于每个试样井中(避免假阴性)的需要。但是通过分离目标和对照通道光学器件，消除了可能导致假阳性测试或者由于无效的对照结果的测试决绝的串扰。为了比较，主机控制器1800负责操作员界面(包括显示结果)以及负责执行盒上测定和检测器头扫描需要的机械和气动功能的操作。主机控制器中的单独时钟用于在扫描期间驱动步进电机。为了使检测器头位置与扫描期间获取的荧光信号相关，步进电机活动由检测器头中的固件监控。井位置辨识由在扫描检测器头中的嵌入式守护进程的控制下操作的“边缘检测”过程实现。在第一实例中，一对机械开关安装在具有与嵌入式控制器数字通信的引线的检测器头的下侧上。在空盒的首次扫描中，检测器头在步进电机的主机仪器控制下沿着其轨道滑动，以及当第一机械开关被横靠轨道的仪器底架中形成的止动器跳闸时，随后向守护进程发送电子信号。守护进程被编程为发起其活动并且将启动从主机仪器捕获步进电机数据以及使用该数据绘制跨越盒的光学窗口的X轴横断面，其中发动机的每个步长与由步进电机限定的位置和距离增量n相对应，使得对于从基准点x0的任何距离xi，(xi＝x0+(ni))。守护进程还存储首次扫描期间的光学输出。因此，守护进程把位置x0和强度I0数据对制成表格，并且随着步进电机使检测器头前进继续增量xi。由于与试样井相关联的盒光学器件中的不连续性，沿着x横断面的盒的光学扫描产生对井边缘检测有用的信号。这些信号由峰值表征，其中当检测头横穿井的近侧边缘时，由峰值条件dx/dt＝0或者基线光学输出中的突然阶跃变化(下降或者增大)来将正斜率与负斜率分开。如果阈值交叉，则与井的入口相关联的边缘效应由守护进程评分为在线性图或者x横断面上具有x坐标(电机步进数量)的井启动位置。由于检测器头安装在刚性导轨上，因此x横断面路径可以是相反的，并且扫描头能够在从相同起始点x0跨越井的后续扫描中精确地回归其路线。以这种方法，由从机械止动器跳闸的轨道上的位置到井边缘的绘制过程确立明确的物理距离。类似地，井的远侧边缘被识别。近侧边缘与远侧边缘位置之间的空井的背景光学读数被随后处理并且存储为代表性背景信号。对于所有井重复该过程，并且对于检测器头中的每个光学通道再次重复。利用合适的偏移，机械开关可以用于超过一个通道，使得x横断面在单个扫描期间被收集用于每个光学通道。类似地，随着扫描头沿着光学窗口扫描，多个井可以一次扫描一个。检测器头随后返回至其静止位置，并且根据命令，启动将检测与充满井的试样相关联的光学输出的任何变化的扫描。守护进程根据存储器中预定义的井边缘位置从检测井收集数据，并且执行计算以评估与井的内容物相关联的荧光(或者其它光学信号)的变化。这些数据还由守护进程操作的信号处理算法处理。在引入试样之后井中的每一个中的荧光变化或者没有荧光变化可以根据测定设计指示对照信号的存在和/或目标分析物信号的存在或者不存在。边缘检测可以包括诸如本领域中已知的三角形滤波器或者其它信号滤波器的滤波器。如在本领域中已知的，与盒井的边缘相关联的基准点可以包括井周围沉积或者铺设的有色层、引起光学散射的物理边缘、具有自发荧光的盒材料等等。因此，绘制例程可以替换地索引至与盒主体或者试样井相关联的基准点，使得初始参考点被光学地、电气地或者机械地确立。为初始位置x0和关联的强度I0记录一组数据对。随着井绘制逐步进行(xi＝x0+(ni))收集后续数据对(xi,Ii)，其中n是步进电机的步长数量以及i是步长距离。算法用于检测试样井边缘的信号变化特征并且为这些特征编索引使得扫描横断面中的一个或者多个试样井被索引。因此可以执行预扫描并且数字化收集的基线光学信号数据；随后，试样井充满包括感兴趣的分析物的液体并且执行第二次扫描：两个扫描之间的差表示感兴趣的目标分析物和/或对照分析物。在检测器头内的自主守护进程的控制下执行信号处理和数字化以及后续分析。图28A和28B是原始输入和数字化输出的表示，并且展示用于由守护进程数字去除气泡干扰的方法。在图28A中，呈现了放大之后的来自光电二极管的输出(1900)。对于图示，尽管噪声水平通常很低，但是由于检测室(1501，参见图29)中两个小气泡的存在信号在1901和1902处降低。守护进程向输出信号施加阈值，并且如果信号高于阈值则对信号评分为“高”(即，一)，以及如果信号低于阈值则评分为“低”(即，零)。由于除了在有与发射光学器件和滤光片匹配的荧光团的情况以外没有信号输出可以高于阈值，因此任何正信号(1903)是针对荧光团的存在的正测定。可以基于测定中临床试样的经验调节阈值比较器。因此扫描图像数据的“1比特”数字转换去除来自气泡的任何干扰。我们惊讶地发现，当荧光团存在但是多个气泡充满室时，围绕或者通过气泡折射的光将产生正信号。因此，对于定性测试，系统是非常抗误差的并且健壮的，诸如在针对传染性疾病的诊断测定中需要的。信号比较器是嵌入在检测器头中的微处理器和固件的数字功能并且独立于主机控制器功能。主机控制器功能再次参照图27，主机控制器1800负责致动守护进程，但是不控制其操作。在守护进程的操作期间，主机系统进行多任务以执行各种测定功能，诸如温度和气动控制、检测器头扫描、用户界面可操作性和故障监控。除了其它功能以外，主机控制器致动用于控制执行测定需要的气动逻辑和脉冲串例程的系统硬件(包括微测定盒中的阀和隔膜泵、与试样热循环相关联的任何电阻或者Peltier型加热元件)，以及可选地可以通过在解链期间致动电阻加热元件以及在冷却期间致动鼓风机(图22)在检测室中执行解链曲线。与主机控制器接口的可选部件包括用于感测打印在可插入微测定盒上的信息的条形码读取器。主机控制器设置有非易失性存储器和可编程指令，可编程指令用于协调测定过程的步骤以及用于以将对用户适用的形式将信号、结果或者来自嵌入式守护进程的其它数据转换和格式化为机器可读或者可图形显示的报告。用于显示测试数据的图形用户界面1820可以并入如这里所示的检测系统中或者可以通过作为网络、内联网或者因特网的部分的数据线路或者无线接口连接至检测系统。通常，提供串行异步通信接口用于与仪器母板上或者外部网络上的主机控制器通信。类似地，可以通过共同的电子接口和数据线路(诸如USB、RS232或者FireWire)以及通过无线传输系统(诸如IR传输、蓝牙、GSM、GPRS和RSID)发送结果、数据、错误代码、状态更新等等。可以通过共同的电子接口和数据线路(诸如USB、RS232或者FireWire)以及通过无线传输系统(诸如IR传输、蓝牙、GSM、GPRS和RSID等等)进行器件的编程、重新编程、校准和再校准以及系统诊断。去耦的光学器件图29A是激发模式中平凸物镜1500的表示。示出了相对于盒检测室1403和具有镜面1400的加热块1410的激发锥体1501。会聚激发锥体由从源照射物镜的发散射线形成，借此焦点位置距离L2’大于透镜的天然焦距L2。按照惯例，使用准直光确定透镜的天然后焦距L2。移位焦点位置称为“去耦”，并且在该实例中通过将源移动至更靠近源透镜实现，但是更一般地去耦可以通过使用非准直光实现。置于透镜1500与镜面1400之间的是具有检测室1403的微测定盒200。检测室以上部光学窗口1502和下部热光学窗口1503为边界。在操作中，由液体试样(这里显示为具有两个夹带的气泡1505)占据中间的体积。可以看出，焦点锥体从镜面反射，在检测室中形成源的实像(1510，实线射线)以及在镜面下形成源的虚像(1511，虚线射线)。因此，后焦点位置L2’通常等于或者大于透镜与反射镜之间的距离。打到反射镜的激发光在检测室的流体体积中反射为聚焦束，从而使通过试样的激发光的光路长度加倍并且增大激发荧光产额。后焦点位置L2’不等于透镜1500的后焦距L2；通常通过用来自源1512的发散束照射透镜来去耦该二者。图29B是发射收集模式中图28的物镜的表示。示出了原始的和反射的荧光发射(来自实像1510和虚像1511的实线和虚线)。再次示出了室1403中的气泡。打到物镜1500的平坦后表面的射线将准直(1522)并且透射到检测器。捕获的荧光信号的数量取决于透镜的角度和数值孔径。透镜1500的天然后焦距是L2。可以通过如图30和31所示重新定位源或者通过改变源透镜的形状或者折射率，来操纵透镜的后焦点位置或者使透镜的后焦点位置相对于透镜的天然焦距(L2对比L2’)“去耦”。图30是具有去耦的激发和发射光学器件的光学路径1700的示意性表示。在该附图中，激发射线显示为实线以及发射射线显示为虚线。在这里，光源1701可以是如图所示的LED、没有透镜壳体和反射器环的SMDLED、SLED、泵浦激光二极管、脊波导(FabryPerot)激光二极管、可调谐激光器等等，这种照明源优选地具有窄带宽。各种窄带宽的LED可用，例如具有630nm(红色)、470nm(蓝色)、525nm(绿色)、601nm(橙色)、588nm(黄色)等等的峰值发射。如果需要可以使用白光LED，但是通常LED输出与测定中的目标的荧光团相匹配并且可选激发屏障滤光片(未示出)可以用于根据需要来锐化带通。尽管在打到分色镜元件1704之前，由这里显示为平凸透镜的源透镜1702透射光源1701的光输出，然而还可以使用模塑的非球面，其中激发束反射到物镜1705上。用实线示出了打到微测定盒1402中的试样流体体积1720的激发锥体。不依惯例地，已经通过将源1701移动至更靠近源透镜1702来将激发锥体的焦点投射经过试样室和后反射镜1400(即，为了增大距离L2’以缩短距离L1’，其中距离L1将是透镜1702的天然后焦距)。随着距离L1’缩短，打到物镜的源射线没有由源透镜准直并且其被发散，从而增大距离L2’。物镜1705的天然后焦距是L2，其中L2小于或等于分隔物镜后面和反射镜的距离，即，优选地在试样室的平面内，使得来自试样室中的荧光团的任何发射和在反射镜中形成荧光团的虚像的任何反射的发射将进入物镜。发射锥体具有与激发光(其聚焦在反射镜后面)的焦点去耦的焦点。焦平面L2内的荧光发射和起源于焦平面的光的任何虚像由物镜有效地准直、有效地透射通过分色镜1704、带通滤光片1706以及随后由传感器透镜1707聚焦到传感器1708上，该传感器1708典型地安装在PCB或者其它固体支撑1709上。透镜1707具有通常等于物镜1705的后焦距L2的后焦距L3。然而，较大的透镜1707可以用于更好地利用传感器1707(例如光电二极管或者CCD芯片)的表面面积。信号的优化可以根据这里概述的去耦的光学系统的原理要求对每个透镜的独立调节，以及与现有技术的教导相反，可以使用非准直激发光。共同光轴上从物镜1705出现的激发光的锥体和进入物镜1705的发射光的锥体在不同焦点(分别地由焦点位置L2’对比L2指示)处可操作地去耦。距离分隔激发光的实际焦平面和物镜的天然焦距。当使用反射镜和激发锥体1501的延伸焦点位置激励时，物镜将捕获荧光发射的原点的宽阔平面中的光。发现该现象(称为“去耦”)在使用后反射镜时增大荧光发射的捕获，并且驳斥支持现有技术的共焦方法的较早的教导。尽管现有技术的教导强烈地支持进行激发和发射共焦，但是实际上在从发射锥体去耦源的聚焦和使用后反射镜1400中有先前没有看到的优势。发射光由贯穿整个试样盒的更大区域和深度产生，从而克服由于如由于小气泡、非混合区域或者淬灭探针将成为的死点或者不均匀性的任何信号缺少。尽管以针对起源于焦点处的激发的一些选择性为代价实现更大的可靠性，但是针对激发的空间选择性事实上在测定器件中并不合乎需要。这是本领域中的技术进步。为了总结，在某些实施例中，L2’可以大于L2和L3。L1可以有利地配置为使得激发光的锥体落在试样室1403的后面以及最优选地接近后反射镜1400或者在后反射镜1400后面。在优选实施例中，激发锥体的焦点落在后反射镜上或者后面。物镜通常被配置为使得发射光被高效地收集并且准直以用于由来自传感器透镜1707的发射光的对称锥体投射到检测传感器上(即，L2＝L3)。相应地，在另一个实施例中，本发明的装置采用配置为使得激发光学器件和发射光学器件去耦的透镜。在该装置的第一实施例中，光源定位在距源透镜的距离L1’处，其中L1’＜L1，借此通过将激发锥体转换到镜面处或者后面的焦点位置L2’，使得L2’＞L2，使激发光学器件和发射光学器件去耦。更一般地，源透镜配置为形成入射在物镜上的发散光束，从而将激发锥体定位在焦点位置L2’处，借此L2’＞L2。有利地，L2被配置为与L3对称(即，L2＝L3)，使得检测器1708的操作是优化的并且健壮的。传感器光电二极管优选地配置为关于透镜1705和1707的聚焦锥体足够大，以在没有损耗测定有效性的情况下适应一定程度的不对准。在去耦的光学器件的可选实施例中，物镜的天然焦点和激发光的实际焦点由距离分开，使得L2>L2’。这在图31中进行了图示，其中远离源透镜1702移动源1701以超过透镜的天然后焦距(L1’＞L1)。这种重新定位的效果是如图所示使从源透镜发出的射线随着它们接近物镜1705而会聚，以及最终效果是缩短L2’。通过将激发锥体焦点位置直接放置在光学窗口1502与1503之间的试样室1403中间，以及通过使用反射镜1400，实现试样液体中的荧光团的激发。但是在该使用去耦的光学器件的实例中，还使物镜移动至更靠近试样室并且透镜L2的天然后焦距现在定位在反射镜后面。这样的效果是增大透镜的表观角孔径，即，通过使透镜移动至更靠近荧光团，更多的光被收集并且重新引导至传感器。如前所述，来自物镜的准直输出聚焦在传感器1708，并且因此典型地L2可以等于L3。因此，图30和31所示的去耦的原理包括用于在与反射的热光学界面一起使用时使用非准直的激发光来优化信号收集效率的两个互补方法，该反射的热光学界面也是本发明的方面。去耦不仅对要求区分正测定结果或者负测定结果的测定有用，而且还对要求一定水平的定量的测定有用，如例如在恶性疟原虫情况下的裂殖体或者裂殖子拷贝数量。应当回想到，如其发明人Minsky在1957(美国专利3013467)中明确表达的共焦光学器件的原始目的是，通过在监控仅来自在任何给定时间聚焦激发锥体的样本区域的发射时，恢复跨越和通过样本的激发的焦点(xyz轴恢复)产生的粗固体样本的三维图像。相对比，在通常均匀的流体混合样本中，对于测量具有最高可能荧光捕获的样本的总体荧光，期望相反的效果。在横越样本期间进行多次测量的系统中，统计方法可以用于克服诸如由气泡引起的干扰，以及强烈的正信号(无论其起源于试样室中的何处)可能指示正测定结果。因此通过再阐述问题，我们已经能够设计具有后反射镜的新颖的光学系统，其中去耦激发和发射的焦平面，伴随愉快的结果--在存在偶然干扰的情况下荧光检测更灵敏并且更健壮。图32A绘制了表明通过改变反射镜上方的物镜高度增强荧光信号输出的实验结果的曲线。简单地说，荧光珠(ThermoFisherScientific，零件号G0300，PittsburgPA)插入到微测定检测室中并且检测室安装在检测器的物镜315下。使用数字测微计，随后改变高于微测定盒的检测器头的高度以构造曲线。在第二次配对试验中，去除了反射的表面。实线(2100)示出了在加热块上存在反射镜的情况下改变透镜高度的效应；虚线(2101)示出了在没有后反射镜的情况下改变透镜高度的效应。如可以看到的，反射镜的存在似乎将最优发射最大值移位在反射镜平面后面(即，透镜中捕获的真实和虚拟荧光发射的合成)。图32B是示出了具有(2103)以及没有(2102)后反射镜的输出信号强度的柱状图。人们发现如图29A所示通过在反射镜后面的焦点处聚焦激发束以及如图29B和30所示在较短的工作距离处采集发射以优化输出信号。在第二实验中，检测室充满包括可溶解荧光团以及以恒定速率通过室泵出以避免淬灭假象的液体试样。随后如之前一样地改变检测器头高度并且确定最优检测器高度。在相关试验中，还改变光源距离源透镜的工作距离以优化灵敏度和检测极限。我们得知当物镜以检测室为中心并且使其它透镜共焦时没有实现最优配置。当使用反射镜时，去耦的光学器件实现有利的结果，在领域中获得技术进步。图33A示出了扫描对于杂化至扩增子的分子信标收集的数据。扫描轴横切分别地表示正测试条件和负测试条件的检测井(2200、2201)，并且能够看出信号限于检测井。随着检测或者试样室中的温度系统地改变来重复地扫描试样。将扫描覆盖在曲线中以图示数据的空间分辨率。针对35℃、65℃、70℃、75℃和80℃的测试条件标记荧光扫描。如期望的，40℃、45℃、50℃、55℃和60℃处的测试曲线以及85℃和90℃曲线没有明显区别，并且没有单独地标记。能够看出，荧光信号是根据温度的。荧光淬灭被观察为随着双链探针目标解链而增大，即，信号在35℃处最大并且基本上不存在于80℃处。在图33B中，针对正(2301，实线)测试条件和负(2302，虚线)测试条件的信号对比温度而绘制数据。在图33C中，绘制了一阶导数，指示大约70℃的FRET熔融温度。示例I在该示例中，示出了对通过检测人试样(诸如血液)中的病原体的核酸诊断传染性疾病有用的本发明的装置。使用板载干燥和液体试剂，处理血液试样以及在大约30分钟或者更短的时间内检测与恶性疟原虫相关联的DNA。如在共同转让的美国专利7544506、7763453和7955836中描述的，使用具有双温度区域的两个室使从试样纯化的DNA经受PCR。随后使用引导在扩增的目标处的FAM荧光标记的分子信标来检测扩增子。可选地，由California红色标记的RNAaseP白血球外显子序列(在多路复用的扩增之后)组成的对照用于确认测定。在图33B中示出了使用本发明的热光学界面获得的代表性热解链曲线。示例II本发明的装置对凝血病的诊断有用。使用板载干燥和液体试剂，通过培养具有荧光底物的等离子体(D-Phe-Pro-Arg-ANSNH-cyclohexyl-2HCl；F.W.＝777.81，HaematologicTechnologies，EssexJunctionVT)针对凝血因子VIIa缺陷症测定血液试样，其中ANSN是荧光团6-amino-1-naphthalene-sulfonamide，其在染料与缩氨酸之间的酰胺键裂解时发光。从Calbiochem(LaJollaCA)获得组织因子(TF)并且在使用之前将其并入磷脂酰胆碱或者磷脂酰丝氨酸泡囊中。TF被过量使用。由20mMHepes缓冲剂，pH7.4，0.15MNaCl连同5nM的TF以及包括20uMEDTA组成的100uL底物反应混合物与等离子体试样一起培养10分钟以形成活性酶复合体。然后添加ANSH底物。底物的水解速率在因子VIIa的正常范围内是线性的，并且可以从标准曲线确定。可以在美国专利申请公开No.2009/0325203和其它实验性文献中找到测定发展的描述。尽管上面是本发明某些实施例的描述，但是可以使用各种替换、修改和等效物。因此，不应当参照上面的描述确定本发明的范围，而是作为替代，应当参照所附权利要求连同它们等效物的全部范围一起进行确定。除非使用短语“用于...的手段(meansfor)”在给出的权利要求中明确地叙述这种限制，否则所附权利要求将不被解释为包括手段加功能的限制。在本说明书中提到的和/或在伴随的申请数据表中陈述的美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利公开中的全部(包括但不限于美国专利申请No.61/745,329)通过引用整体地合并于此。如有必要，可以修改实施例的方面以采用各种专利、申请和公开的概念来提供又另外的实施例。