人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞及其制备方法与流程

本发明涉及人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞及其制备方法。

背景技术：
白血病是危害青壮年的最主要恶性肿瘤之一，化学治疗目前仍然是白血病的最主要治疗方法，但化疗中抗癌药物诱导的药物耐受性，特别是获得性多药耐药（multidrugresistance，MDR）现象是阻碍白血病治疗效果的主要障碍，也是目前尚未解决的难题。三氧化二砷是中药砒霜的有效成分，已在各型白血病和实体肿瘤的治疗中得到广泛应用，取得了良好的临床疗效。研究证实三氧化二砷不是耐药蛋白P-gp的底物且抑制P-gp表达，不与常规化疗药物发生交叉耐药性，故单用或与常规化疗药物联合应用在耐药性、复发性及难治性白血病的治疗中取得良好疗效。临床应用三氧化二砷治疗白血病/肿瘤过程中发现部分白血病/肿瘤细胞也会逐渐产生对三氧化二砷的耐受性，即获得抗砷性，发生机制以及与MDR的关系不明。当前常用的采用阿霉素诱导的、超表达P-gp的白血病多药耐药细胞系（如K562/ADM等）照样对三氧化二砷敏感、没有抗砷性。因此，研究化疗药物诱导的MDR的机制及与抗砷性的关系，以及预防抗砷性的产生，探讨耐药性白血病细胞对其敏感抑或耐受的细胞分子机制，可为解决含砷化疗药物耐药问题以及临床是否选择As2O3作为耐药性白血病的治疗药物提供实验依据或探寻新的治疗靶点。

技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，为分析白血病细胞化疗耐药后的生物学性状的变化，筛选及判断化疗药物的敏感性，分析白血病细胞多药耐药及抗砷性机制，研究多药耐药性与抗砷性的关系，预防白血病化疗过程中MDR和/或抗砷性的产生，体外筛选耐药调整剂，提供了一种可与三氧化二砷交叉耐药的白血病多药耐药细胞系HL-60/RS。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞，所述细胞株HL-60/RS的保藏编号为CCTCCNO：C201430，保藏时间为2014年4月16日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心（地址为中国.武汉.武汉大学）。本发明的第二个目的是提供了上述的人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞的制备方法，是以人类白血病HL-60细胞系为亲本细胞，采用阿霉素模拟体内化疗过程，逐步提高药物浓度、长期、间歇性反复冲击加持续诱导的方法，诱导建立获得性白血病多药耐药细胞系HL-60/RS。其特点为对三氧化二砷具有高耐药性，并高表达MRP1、MRP2和ASNA1等砷转运相关蛋白。进一步的，上述的人白血病HL-60细胞耐药细胞株HL-60/RS细胞的制备方法，包括以下步骤：1）取对数生长期的人类白血病HL-60细胞接种在含有以体积百分比计为15%的新生牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度环境下培养，得到细胞培养体系；2）在步骤1）得到的细胞培养体系中加入阿霉素，起始冲击浓度为0.1mg/L，待细胞恢复正常生长时，再加以同浓度药物诱导，如此重复，直至细胞能在该浓度下正常存活和增殖时，再提高冲击药物浓度，进行第二轮冲击诱导，药物浓度增加的幅度为0.1mg/L；按上述方式反复间歇性冲击诱导，并随着冲击诱导次数及耐药性的增高，每轮药物浓度增加的幅度逐渐提高，初期幅度小，后期幅度加大，每轮冲击诱导药物浓度增加的幅度为0.1mg/L，0.2mg/L，0.3mg/L，0.5mg/L，0.6mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L，3.0mg/L，3.5mg/L，4.0mg/L，5.0mg/L，每轮中同幅度增加冲击浓度的次数根据细胞状态及耐药稳定性决定，一般1-3次，冲击诱导时间为20个月，至最终人类白血病HL-60细胞能够在含有40.0mg/L阿霉素的细胞培养体系中维持存活和增殖；撤离诱导药物置于无药体系中培养，耐药性保持稳定，得到具有耐药性的HL-60/RS细胞。所用药剂来源：新生牛血清：兰州荣晔生物科技公司产品，批号20100925；青霉素：华北制药股份有限公司产品，批号1105403；链霉素：华北制药股份有限公司产品，批号1112106；RPMI1640培养液：美国GibcoBRL公司产品，批号870532；阿霉素：深圳万乐药业有限公司产品，批号1103E1。本发明的原理为，以人类白血病HL-60细胞系为亲本细胞，采用阿霉素（Adriamycin,ADM）模拟体内化疗过程，逐步提高药物浓度、长期、间歇性反复冲击加持续诱导的方式方法诱导建立获得性白血病多药耐药细胞系HL-60/RS，并观察生物学特性及对三氧化二砷的敏感性。具体实施技术如下：①对数生长期HL-60细胞接种在含15%新生牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。②在细胞培养体系中加入阿霉素，起始冲击浓度为0.1mg/L，待细胞恢复正常生长时，再加以同浓度药物诱导，如此重复，直至细胞能在该浓度下正常存活和增殖时，再提高冲击药物浓度，进行第二轮冲击诱导，药物浓度增加的幅度为0.1mg/L。如此反复间歇性冲击诱导，并随着冲击诱导次数及耐药性的增高，每轮药物浓度增加的幅度亦逐渐提高，初期幅度较小，而后期幅度加大，每轮冲击诱导药物浓度增加的幅度为0.1，0.2，0.3，0.5，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0mg/L，历时20个月，最终HL-60细胞能够在含40.0mg/L阿霉素的培养体系中维持存活和增殖。撤除诱导药物后在无药体系中培养，HL-60细胞长期稳定维持耐药性。诱导后的耐药细胞在液氮中冻存3个月后复苏，细胞耐药性维持稳定。最终获得的具有耐药性的HL-60/RS细胞。对以上述方式，采用“逐步提高浓度冲击+持续诱导”建立的具有多药耐药性的HL-60/RS细胞系，进行生物学特性检测：2.1耐药谱：收集对数生长的HL-60细胞和HL-60/RS细胞，采用MTT法检测对阿霉素以及顺铂、长春新碱、依托泊苷、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶的敏感性，即细胞按1×105/ml接种96孔细胞培养板，加入相应浓度的药物，置于CO2培养箱培养48h和72h，培养终止前4h每孔加入10μlMTT溶液（5mg/ml），继续培养，每孔加入10%含0.01mol/LHCl的SDS溶液终止反应，并置37℃过夜，自动酶标仪在570nm波长测定吸光度（A）值，并计算相应药物的抑制率和半数抑制量（IC50）值以及耐药倍数。HL-60/RS细胞对阿霉素的耐受性及耐药谱如图1所示，以IC50比较，HL-60/RS细胞对阿霉素的耐受性为其亲本HL-60细胞的85.68倍。HL-60/RS细胞对顺铂、长春新碱、依托泊苷和阿糖胞苷具有不同程度的交叉耐受性，但对5-氟尿嘧啶的敏感性无明显改变。2.2形态学改变：收集生长状态良好的HL-60细胞和HL-60/RS细胞，Wright-Gimsa染色、光镜观察，同时在透射电子显微镜下观察细胞器与细胞核的改变、扫描电子显微镜下观察细胞表面形貌变化，HL-60细胞和HL-60/RS细胞的光镜及电镜形态学特点如图2所示。与对照HL-60细胞比较，HL-60/RS细胞形态未见明显差异，胞核呈较均一的圆形或椭圆形、直径增大，核/浆比例显著增加，无类分叶核或类杆状核。在扫描电镜下HL-60/RS细胞则表面较光滑、缺少微绒毛；超微结构上胞质较致密，细胞核内染色质致密、异染色质增多。从形态学上观察显示，经ADM诱发耐药的HL-60/RS细胞表型更为原始和幼稚，分化程度更低。2.3耐药蛋白表达：收集生长状态良好的HL-60细胞和耐受不同浓度ADM的HL-60/RS细胞，细胞浓度调至106个/ml，检测P-gp时加入鼠抗人P-gp单抗MRK-16作为一抗，室温避光孵育20min，PBS洗涤后重悬，再加入羊抗鼠PE-IgG2a作为二抗，室温避光孵育20min，PBS洗涤。检测BCRP时加入FITC标记的鼠抗人BCRP抗体。流式细胞仪分别检测P-gp和BCRP的表达阳性率。HL-60细胞和HL-60/RS细胞耐药蛋白的表达变化如图3所示，结果表明，P-gp和BCRP的表达随HL-60细胞耐受ADM浓度的增高而增高，当HL-60细胞耐受ADM的剂量达到5mg/L时，存活细胞就已几乎100%表达P-gp，BCRP阳性率为6.2%。达到最高耐受浓度（40mg/L）时，P-gp+和BCRP+细胞分别为100%和24.2%，分别为HL-60细胞的78.7倍和25.0倍。2.4药物外排功能（细胞内ADM含量）：HL-60和HL-60/RS细胞悬于PBS中，加入终浓度30mg/L的ADM，37℃避光孵育30min，冷PBS洗涤2次后，将细胞分为两部分：一部分细胞重悬于1ml冷PBS中，FCM检测细胞内ADM蓄积量（荧光强度）。另一部分细胞置于37℃继续避光孵育60min，冷PBS洗涤2次，FCM检测细胞内存留的ADM量（荧光强度），计算外排出量。HL-60细胞和HL-60/RS细胞药物外排功能（细胞内ADM含量）变化如图4所示，HL-60/RS细胞内ADM的含量（荧光强度）仅为HL-60细胞的59%；继续无药孵育60min，仅63%的HL-60/RS耐药细胞内可测到ADM，且可测到的ADM含量仅为HL-60细胞的25.7%，约有66.5%的ADM被排出细胞外，而对照HL-60细胞仅排出22.6%。上述结果证明HL-60/RS细胞高表达的P-gp和BCRP的药物外排活性是其耐药性的主要机制之一。2.5三氧化二砷敏感性：收集HL-60细胞和HL-60/RS细胞，并选择同为ADM诱导的经典多药耐药白血病K562/ADM细胞及其亲本敏感K562细胞为对照，按1.0×105个/mL接种于96孔培养板，加入不同浓度的As2O3，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24-72h，离培养终点4h，加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h，加入10%SDS，37℃静置过夜。全自动酶标仪于570nm波长处测定每孔的吸光度(A值)，计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)。HL-60细胞和HL-60/RS细胞对三氧化二砷的敏感性（与K562/ADM细胞和K562细胞比较）如图5所示，结果表明，K562/ADM细胞较K562细胞对As2O3更敏感，其24、48和72小时的IC50值分别为K562细胞的0.75，0.82和0.80倍；而但与之相反，HL-60/RS细胞则远较HL-60细胞对As2O3耐受，IC50值则分别为HL-60细胞的7.39、10.87和12.89倍。HL-60/RS耐药细胞对As2O3的敏感性远低于K562/ADM耐药细胞，其IC50值分别为K562/ADM细胞的9.51、9.78和10.89倍，但它们的亲本细胞HL-60和K562细胞对As2O3的敏感性相近。结果揭示出，尽管HL-60/RS细胞和K562/ADM细胞均为阿霉素诱导选择的、mdr1/P-gp高表达的MDR细胞，但对As2O3的敏感性却完全相反。2.6砷转运蛋白表达：分别收集HL-60细胞、HL-60/R细胞、K562细胞和K562/ADM细胞，提取RNA和蛋白质，分别采用实时荧光定量RT-PCR法和Westernblot法检测与砷转运相关蛋白ABCCl（MRPl）、ABCC2（MRP2）和砷激活的ATP酶（arsenite-stimulatedATPase,ASNA1）的表达水平。①定量RT-PCR：TRIZOL法抽提细胞总RNA,反转录合成cDNA,定量PCR总体系25μl，包括2×SYBRGreenbuffer12.5μl上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA2μl，PCR引物序列如表1所示。表1。反应条件：95℃、10sec，然后95℃5sec，60℃30sec共40个循环，扩增结束后进行融解曲线分析产物的特异性。基因表达定量采用比较域值法进行分析。②收集细胞PBS洗涤，RIPA裂解液抽提总蛋白，BCA法对蛋白质进行定量后，加入5×上样缓冲液，混匀，100℃煮沸5min使蛋白质变性，每个样分别取50μg进行上样，8-10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h或者4℃过夜后分别加入抗-MRP1抗体、抗-MRP2抗体、抗-ASNA1抗体和抗β-actin抗体，4℃过夜或室温孵育1-2h，用PBS-T洗涤3×5min，分别加入IRDye700DX标记的羊抗兔和IRDye800CW标记的羊抗鼠二抗室温孵育2h,PBS-T洗涤5×10min后，PBS洗涤10-30min，Odyssey红外激光扫描仪进行扫描并分析。HL-60细胞和HL-60/RS细胞MRPl、MRP2和ASNA1的表达水平，并与K562/ADM细胞和K562细胞比较如图6所示，结果表明，耐药的K562/ADM细胞和HL-60/RS细胞MRP（MRP1和MRP2）的表达均高于其亲本敏感细胞，且HL-60/RS细胞高于K562/ADM细胞；HL-60/RS细胞中ASNA1的表达远高于K562/ADM细胞、HL-60细胞和K562细胞，分别为K562/ADM细胞的7.34倍、HL-60细胞的2.45倍、K562细胞的6.16倍。而K562/ADM细胞的表达量是K562细胞的0.83倍。两对细胞MRP1、MRP2和ASNA1的表达与其对三氧化二砷的敏感性基本一致。表明HL-60/RS细胞对三氧化二砷耐受性缘于砷相关转运体的MRP1和MRP2，特别是ASNA1的表达相关联。本发明的有益效果为：本发明诱导建立的白血病多药耐药HL-60/RS细胞系，是采用“逐步提高浓度冲击+持续诱导”的诱导方法，有别于目前肿瘤耐药研究多采用浓度梯度递增法和大剂量间歇短时冲击方式，建立的耐药细胞株具有耐药谱广和耐药性稳定等特点；HL-60/RS细胞的多药耐药性与目前最经典的K562/ADM细胞类似，且高表达药物转运蛋白P-gp、MRP和BCRP；与K562/ADM等耐药白血病细胞比较，除具有广谱的耐药性外，还对三氧化二砷具有高耐药性，且高表达MRP1、MRP2和ASNA1等砷转运相关蛋白。HL-60/RS细胞系的特点是多药耐药且与三氧化二砷交叉耐受和高表达ASNA1基因，可用于研究肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性、耐药性及抗砷性的机制，以及筛选具有可靠性的耐药逆转剂；临床ASNA1基因的检测可预测对砷剂类药物的敏感性，特别是复发性、难治性和耐药性白血病能否换用砷剂类药物治疗。附图说明图1为本发明提供的HL-60/RS细胞系对阿霉素的耐受性及耐药谱，其中，A：不同诱导条件下的耐药性；B：耐药谱。图2为HL-60细胞和HL-60/RS细胞的光镜及电镜形态学特点。图3为HL-60细胞和HL-60/RS细胞耐药蛋白的表达变化，其中，A：Westernblot所测P-gp、MRP和BCRP的表达水平；B：诱导过程中P-gp和BCRP的动态变化。图4为HL-60细胞和HL-60/RS细胞药物外排功能（细胞内ADM含量）变化。图5为HL-60细胞和HL-60/RS细胞对三氧化二砷的敏感性，是与K562/ADM细胞和K562细胞比较得到的结果。图6为HL-60细胞和HL-60/RS细胞MRPl、MRP2和ASNA1的表达水平，并与K562/ADM细胞和K562细胞比较（A：定量RT-PCR所测mRNA的表达水平；B：Westernblot所测蛋白表达水平）。附图中的英文标识的中文翻译如下所示：ADM（阿霉素）；TolerantADMconc.（耐受阿霉素浓度）；50%inhibitoryconcentration（IC50，半数抑制浓度）；Cisplatin（顺铂）；5-Fluorourid（5-氟尿嘧啶）；Daunorubicin（柔红霉素）；Cytrarabine（阿糖胞苷）；Vincristine（长春新碱）；Etoposide（依托泊苷）；Relativeexpression（相对表达量）；Positiverate（阳性率）；MFI（平均荧光强度）；P-gp（P-糖蛋白）；BCRP（乳腺癌耐药蛋白）；MRP1（多药耐药相关蛋白1）；MRP2（多药耐药相关蛋白2）；ASNA1（砷激活的ATP酶）。具体实施方式实施例1：以阿霉素为诱导剂，诱导HL-60细胞建立多药耐药细胞系。①HL-60接种在含15%新生牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。②在细胞培养体系中加入阿霉素，起始冲击浓度为0.1mg/L，待存活细胞恢复正常生长时，再加以同浓度药物诱导，如此重复，直至细胞能在该浓度下正常存活和增殖时，再提高冲击药物浓度，进行第二轮冲击诱导，药物浓度增加的幅度为0.1mg/L。如此反复间歇性冲击诱导，并随着冲击诱导次数及耐药性的增高，每轮冲击药物浓度增加的幅度亦逐渐提高，初期幅度较小，而后期幅度加大，每轮冲击诱导药物浓度增加的幅度依次为0.1，0.2，0.3，0.5，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0mg/L，历时20个月、最终HL-60细胞能够在含40.0mg/L阿霉素的培养体系中维持存活和增殖，建成白血病多药耐药细胞系HL-60/RS细胞。③HL-60/RS细胞在无阿霉素培养体系中培养，HL-60细胞长期稳定维持耐药性。液氮中冻存3个月后复苏，细胞耐药性维持稳定。诱导建立的HL-60/RS细胞的耐药指数为85.68，对顺铂、长春新碱、依托泊苷和阿糖胞苷具有交叉耐受性；高表达耐药蛋白P-gp和BCRP。实施例2：HL-60/RS细胞的诱导建立方式与实施例1相同。HL-60/RS细胞稳定生长后1个月后进行对三氧化二砷敏感性的测定。HL-60/RS细胞（选择HL-60敏感细胞、K562/ADM多药耐药细胞及其亲本K562细胞为对照），按1.0×105个/mL接种于96孔培养板，加入0.1-5.0mg/L的As2O3，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24-72h，MTT法测定细胞增殖抑制和IC50。HL-60/RS细胞对三氧化二砷高度耐受，耐受性是亲本HL-60细胞的12.89倍、是K562/ADM耐药细胞的10.89倍。实施例3：HL-60/RS细胞的诱导建立方式与实施例1相同。HL-60/RS细胞以及对照HL-60细胞、K562细胞和K562/ADM细胞，采用TRIZOL法抽提细胞总RNA和RIPA裂解液抽提总蛋白，分别用实时荧光定量RT-PCR法和Westernblot法检测与砷转运相关蛋白MRPl、MRP2和ASNA1的表达。HL-60/RS细胞MRP（MRP1和MRP2）的表达明显高于HL-60细胞和K562/ADM细胞；HL-60/RS细胞ASNA1的表达显著高于HL-60细胞和K562/ADM细胞，分别为K562/ADM细胞的7.34倍和HL-60细胞的2.45倍。K562/ADM细胞的表达量是K562细胞的0.83倍。MRP和ASNA1的表达水平与三氧化二砷的敏感性一致。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>兰州大学<120>白血病多药耐药细胞系HL-60/RS及其制备方法<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tgcagaaggcggggagaacctc22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gtcgtccgtttccaggtccacg22<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3agacgcagtccaggaatcatgctgg25<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4gtctgcctccggactgtccagg22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5gccggcttatgcagatcaaga21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gttcgctgactgagcggatg20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7tgctcctcctgagcgcaagta21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8ccacatctgctggaaggtgga21序列表<110>兰州大学<120>白血病多药耐药细胞系HL-60/RS及其制备方法<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tgcagaaggcggggagaacctc22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gtcgtccgtttccaggtccacg22<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3agacgcagtccaggaatcatgctgg25<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4gtctgcctccggactgtccagg22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5gccggcttatgcagatcaaga21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gttcgctgactgagcggatg20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7tgctcctcctgagcgcaagta21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8ccacatctgctggaaggtgga21