用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法

用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法
【专利摘要】一种聚氨酯多孔膜，其由简单方法制成，以用于细胞培养和癌细胞生长抑制中的至少一种应用。用于细胞培养和癌细胞生长抑制中的至少一种应用的聚氨酯膜的制造方法包括：第一步骤，在基材上形成未固化的聚氨酯材料层；以及第二步骤，向形成于基材的聚氨酯材料层中远离基材的暴露表面供给水蒸汽，从而使聚氨酯材料固化，并且使聚氨酯材料层具有这样的多孔结构：其具有位于暴露表面上的多个凹凸体。
【专利说明】用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求享有2013年7月9日提交的日本专利申请P2013-143371和2014年5月14日提交的日本专利申请P2014-104225的优先权，这两件申请的全部内容在此以引用方式并入本文。

【技术领域】
[0003]本发明涉及一种用于细胞培养和癌细胞生长抑制的至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法。

【背景技术】
[0004]作为可用于包括药物发现和再生医学在内的多种领域的技术，细胞培养技术近来受到了关注。将作为细胞支架(cell scaffold)的基材(substrate)用于贴壁依赖性细胞的培养。关于细胞培养所使用的基材，如本领域已知的，基材表面上的微小物理结构以及化学性质很重要。已知基材之一是这样一种基材，其由聚合物材料制成，并且在表面上具有微小的凹凸体。可以采用多种技术来提供带有微小凹凸体的、由聚合物材料制成的基材，例如，缩合技术、纳米压印技术、光刻或乳胶技术(例如，JP2009-242495A)。


【发明内容】

[0005]然而，细胞培养基材的现有生产方法都是相当复杂的，并且需要许多步骤，因此难以降低制造成本。另外，现有技术方法通常难以制备具有贯通至下表面的孔的多孔膜。在细胞培养使用具有通孔的多孔膜的情况下，多孔膜的上表面和下表面二者都能用于细胞培养。例如，在上前表面和下表面上可以培养不同类型的细胞。这会扩大细胞培养技术的应用。为此目的，需要开发一种具有通孔的细胞培养片材。尤其是，尚未有已知的方法来制备具有孔径小于10微米的通孔的细胞培养用多孔膜。由于标准细胞尺寸为大约10微米，希望使用具有孔径小于10微米的通孔的多孔膜，以允许对不同类型细胞之间的相互作用进行分析。因此，需要开发具有孔径小于10微米的通孔的多孔膜。
[0006]已知的是，一些在其上表面上形成有微小凹凸体的多孔膜对细胞生长抑制是有效果的(例如，JP2005-152526A)。希望对癌细胞生长抑制具有效果(作为对细胞生长抑制的效果的一个例子)的多孔膜能够用于癌症治疗，用于抑制癌症复发或癌症转移，或者用于癌症研究。因此，需要通过简单的制造工艺来生产具有这种对细胞生长抑制效果的多孔膜。
[0007]为了解决上述问题中的至少一部分，通过以下方面和实施方式完成了本发明。
[0008](I)根据一个方面，提供了一种用于细胞培养和癌细胞生长抑制中的至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法。这种聚氨酯多孔膜的制备方法包括:第一步骤，在基材上形成未固化的聚氨酯材料层；以及第二步骤，向形成于基材上的聚氨酯材料层中远离基材的暴露表面供给水蒸汽，以使聚氨酯材料固化，并且向聚氨酯材料层提供具有位于暴露表面上的多个凹凸体的多孔结构。
[0009]根据本方面的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法，该方法通过向聚氨酯材料层供给水蒸汽这样的简单工艺，制备了用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。这有利地降低了聚氨酯多孔膜的制造成本。
[0010](2)根据(I)所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜制备方法的一个实施方案，在第二步骤中所提供的聚氨酯多孔膜的多孔结构可以包括向暴露表面开放的多个孔，并且仅有单一的孔沿聚氨酯多孔膜的膜厚度方向存在。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法能够制备适于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。
[0011](3)根据(2)所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜制备方法的另一实施方案，聚氨酯多孔膜可以具有0.1?100微米的厚度。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法，使得能够制备适于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。
[0012](4)根据(3)所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜制备方法的另一实施方案，通过对条件进行调节，可以将聚氨酯多孔膜的厚度控制到0.1?100微米，所述条件选自:第一步骤中形成为层的聚氨酯材料的组成，第二步骤中的反应温度，以及第二步骤中的反应时间。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法能够容易地制备适于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。
[0013](5)根据(2)所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法的另一实施方案，聚氨酯多孔膜在暴露表面上可以具有0.1?100微米的平均孔径。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法能够制备适于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。
[0014](6)根据(5)所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法的另一实施方案，通过对条件进行调节，可以将聚氨酯多孔膜的暴露表面上的平均孔径控制到0.1?100微米，所述条件选自:第二步骤中的反应温度、第二步骤中的反应时间、以及第二步骤中供给至暴露表面的水蒸汽的量。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法能够容易地制备适于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。
[0015](7)根据(I)?(6)中任意一项所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法的另一实施方案，第二步骤中提供的多孔结构可以包括朝向暴露表面开口的多个孔，以及，所述多个孔中的至少一部分形成为贯通至聚氨酯材料层与基材相邻的表面的孔。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法能够制备适于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。这也提供了一种两个表面都能用作细胞培养支架的聚氨酯多孔膜。使用这样的聚氨酯多孔膜能够进行这样的细胞培养，提供在各自表面上所培养细胞之间的相互作用。
[0016](8)根据(7)所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法的另一实施方案，通过对条件进行调节，可以使多个孔中的至少一部分成为贯通至聚氨酯材料层与基材相邻的表面的孔，所述条件选自:第一步骤中形成为层的聚氨酯材料的组成、第二步骤中的反应温度、以及第二步骤中的反应时间。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法能够制备适合于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。这也提供了两个表面都能用作细胞培养支架的聚氨酯多孔膜。使用这样的聚氨酯多孔膜能够进行这样的细胞培养，提供在各自表面所培养细胞之间的相互作用。
[0017](9)根据(7)所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法的另一实施方案，第一步骤可以包括:混合步骤，将至少包括多元醇和异氰酸酯的聚氨酯材料混合；以及层形成步骤，将在混合步骤中所混合的聚氨酯材料形成为层。通过对条件进行调节，可以使多个孔中的至少一部分成为贯通至聚氨酯材料层与基材相邻的表面的孔，所述条件选自:混合步骤与层形成步骤之间的时间，以及，混合步骤与层形成步骤之间时聚氨酯材料的环境温度。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法能够制备适合于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜。
[0018](10)根据⑴?(9)中任意一项所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法的另一实施方案。所述聚氨酯多孔膜的制备方法可以进一步包括第三步骤，在第二步骤之后进行，停止水蒸汽的供给，进一步固化聚氨酯材料。根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法提供了这样的聚氨酯多孔膜:其在暴露表面上具有较小的平均孔径，并且朝向暴露表面开口的孔的孔径的变化较小。
[0019](11)根据另一方面，提供了一种通过⑴?(10)中任意一项所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法而制备的聚氨酯多孔膜。所述聚氨酯多孔膜具有第一表面以及与该第一表面相对的第二表面，并且具有包括多个孔的多孔结构。各孔朝向第一表面开口，并且具有朝向所述第二表面凸起的弯曲内壁面。所述多个孔中的至少一部分可以是贯通至第二表面的孔。
[0020]还可以通过除上述制备方法之外的其他方面实现本发明:例如，通过用于制备适于培养细胞和癌细胞生长中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的方法而制备的聚氨酯多孔膜，以及，用于制备适于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的聚氨酯材料组成的确定方法。
[0021]本发明的用于制备适于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的方法，通过向聚氨酯材料层供给水蒸汽这样简单的工艺，生产聚氨酯多孔膜。这有利地降低了聚氨酯多孔膜的制造成本。

【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1是示意性示出示例性聚氨酯多孔膜的结构的截面图；
[0023]图2是示意性示出另一示例性聚氨酯多孔膜的结构的截面图；
[0024]图3是示意性示出另一示例性聚氨酯多孔膜的结构的截面图；
[0025]图4是示出聚氨酯多孔膜的制备方法的流程图；
[0026]图5是图示在基材上形成聚氨酯材料层的工艺的图；
[0027]图6是图示随着供给水蒸汽使聚氨酯固化的工艺的图；
[0028]图7是示出聚氨酯多孔膜另一制备方法的流程图；
[0029]图8是示出聚氨酯膜的材料组成以及固化条件的图表；
[0030]图9是示出聚氨酯膜的观察结果的图表；
[0031]图10是示出聚氨酯膜的材料组成以及固化条件的图表；
[0032]图11是示出聚氨酯膜的观察结果的图表；
[0033]图12是示出聚氨酯膜的材料组成以及固化条件的图表；
[0034]图13A和图13B是示出聚氨酯膜的观察结果的图表；
[0035]图14是示出聚氨酯膜的材料组成以及固化条件的图表；
[0036]图15A和图15B是示出聚氨酯膜的观察结果的图表；
[0037]图16A和图16B是示出聚氨酯膜的材料组成和固化条件以及测量结果的图表；
[0038]图17是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0039]图18是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0040]图19是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0041]图20是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0042]图21是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0043]图22是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0044]图23是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0045]图24是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0046]图25是示出聚氨酯膜的观察结果的照片；
[0047]图26是示出聚氨酯膜的材料组成和固化条件以及测量结果的图表；
[0048]图27是示意性图示细胞培养装置的透视图；
[0049]图28是示出在聚氨酯多孔膜的两个表面上进行细胞培养过程的图；
[0050]图29是示出将HUVEC接种于上表面的单侧培养结果的照片；
[0051]图30是示出将HUVEC接种于上表面的单侧培养结果的照片；
[0052]图31A和图31B是示出双侧(上侧和下侧)培养结果的照片，将AoSMC接种于上表面，以及，将HUVEC接种于下表面；
[0053]图32A和图32B是示出双侧(上侧和下侧)培养结果的照片，将AoSMC接种于上表面，以及，将HUVEC接种于下表面；
[0054]图33是示出聚氨酯膜的材料组成和固化条件以及测量结果的图表；
[0055]图34是示出培养T0V21G的细胞生长率的柱状图；以及
[0056]图35是示出培养Caov3的细胞生长率的柱状图。

【具体实施方式】
[0057]A.聚氨酯多孔膜的结构
[0058]图1是示意性图示聚氨酯多孔膜10结构的截面图，其作为通过本发明一个实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法制备的示例性膜。聚氨酯多孔膜10由聚氨酯制成，并且具有多个孔30。聚氨酯多孔膜具有作为第一表面的上表面22、以及作为第二表面的下表面24，其中，多个孔30全部朝向上表面22开口。孔30在上表面20上的平均孔径是例如0.1?100微米。
[0059]如图1中所示，仅有单一的孔30沿聚氨酯膜10的膜厚度方向设置。孔30的内壁通常形成为大致曲面。但是，孔30的内壁面并不必须是光滑表面，而是可以具有多个微小凹凸体。形成于孔30内壁面上的微小凹凸体是(例如)宽度不大于膜厚度的20%的凹凸体，或者，优选的是，宽度不大于膜厚度的10%的凹凸体。孔30朝向上表面22开口，并且具有朝向下表面24凸起的弯曲内壁面。更具体而言，随着更靠近孔30中心轴，从下表面24至孔30的内壁面底部之间的距离逐渐减小，其中内壁面底部位于比上表面22更接近于下表面24 —侧，所述孔30的中心轴是平行于聚氨酯多孔膜10的膜厚度方向的横截面中的中心轴。图1中，平行于聚氨酯多孔膜10膜厚度方向的横截面中的孔30的中心轴表示为中心轴O。孔30的底部与下表面24之间的距离随着越靠近此中心轴O而减小，这一情形由箭头不出。
[0060]图2是示意性图示聚氨酯多孔膜110结构的截面图，其作为通过本发明实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法而制备的另一示例性膜。在聚氨酯多孔膜110中，类似于聚氨酯多孔膜10的构成部分用相同的附图标记表示，这里不再具体描述。聚氨酯多孔膜110具有多个孔130，而不是多个孔30。孔130具有与孔30类似的形状，但结构与孔30不同，不同之处在于多个孔130中的至少一部分贯通至下表面24。从下表面24至孔130底部之间的距离随着与孔130中心轴的距离的减小而逐渐减小，并在孔130贯通到下表面24的位置处达到零，其中所述孔130的中心轴是平行于聚氨酯多孔膜110的膜厚度方向的横截面中的中心轴。聚氨酯多孔膜110的上表面22上的孔130的平均孔径为例如0.1?100微米。
[0061]图3是示意性图示聚氨酯多孔膜210结构的截面图，其作为通过本发明实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法制备的又一示例性膜。在聚氨酯多孔膜210中，类似于聚氨酯多孔膜10的那些构成部分用相同的附图标记表示，这里不再具体描述。聚氨酯多孔膜210具有多个孔230，而不是多个孔30。孔230没有确定的形状。
[0062]如上所述，至少在上表面22上，通过本发明实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法制备的聚氨酯多孔膜可以具有与上述聚氨酯多孔膜10、110的凹凸体不同的凹凸体。在任意情况下，聚氨酯多孔膜的膜厚度为例如0.1?100微米。聚氨酯多孔膜的膜厚度表示:聚氨酯多孔膜上表面22所形成凹凸体中的凸起部最高位置与下表面24之间的距离(即:凸起部最高位置与基材之间的距离，这是因为，根据下文所述的实施方案，聚氨酯多孔膜是在基材上形成的)。在下文说明中，将这种膜厚度称为“峰处膜厚度”。在下文说明中，将聚氨酯多孔膜上表面22之上所形成的凹凸体的凸起部最深位置与下表面24之间的距离(即凸起部的最深位置与基材之间的距离)称为“谷处膜厚度”。就根据本发明实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法制备的膜而言，相比于峰处膜厚度，谷处膜厚度优选为不大于95%、更优选为不大于85%、还优选为不大于50%。谷处膜厚度可以等于0% (这意味着孔贯通了膜)。
[0063]通过用扫描电子显微镜(SEM)观察聚氨酯多孔膜的横截面，确定聚氨酯多孔膜的峰处膜厚度和谷处膜厚度。例如，具体过程可以在聚氨酯多孔膜横截面的SEM图像中选择三个可见区域，测量各可见区域中随机选择的五个不同部位处的膜厚度，计算各可见区域中测量值的平均值，以及确定各个可见区域平均值的中值(mean value) 0
[0064]通过用扫描电子显微镜(SEM)观察聚氨酯多孔膜的表面，确定聚氨酯多孔膜的平均孔径。例如，具体的过程是:测量聚氨酯多孔膜表面的SEM图像上在指定可见区域中观察到的所有孔中的最大长度，并且确定测量值的平均值。最大长度表示外切于孔的矩形的侧边长度的最大值。
[0065]根据上述实施方案的聚氨酯多孔膜可以用作细胞培养基材，利用具有凹凸体的表面(例如，孔开口所在的上表面)来提供细胞培养支架。将本实施方案的聚氨酯多孔膜用作细胞培养支架这种应用的一个例子是细胞芯片(cell chip)应用，其中通过布置细胞或使细胞形成图案以使细胞分布均衡从而使细胞响应稳定化。另一例子是在再生医疗领域中的应用，其中使用聚氨酯多孔膜作为细胞支架来制造假体组织，例如假体血管，用构成血管的细胞对其进行涂覆。
[0066]具有贯通至下表面的孔的聚氨酯多孔膜可以通过利用该膜的两个表面来进行细胞培养。在这种情况下，在上表面和下表面上可以培养不同类型的细胞，并且可以评估不同类型细胞之间的相互作用。特别是，当贯通至下表面的孔的孔径(平均孔径)小于10微米(其为标准细胞尺寸)时，通过在允许物质(例如，来自各自细胞的分泌物)转移的同时阻碍细胞在上表面和下表面之间进行迁移，能够以更高的精确度具体地分析不同类型细胞之间的相互作用。
[0067]除了细胞培养应用之外或者作为替代方式，本实施方案的聚氨酯多孔膜可以用于癌细胞生长抑制的应用。例如，聚氨酯多孔膜可用于癌症治疗，用于抑制癌症复发或癌症转移，或用于癌症研究。在将聚氨酯多孔膜用于癌症治疗或用于抑制癌症复发或癌症转移的应用时，聚氨酯多孔膜优选具有孔30，这些孔30的底部远离聚氨酯多孔膜的下表面24，如图1中所示的聚氨酯多孔膜10。可以将聚氨酯多孔膜置于体内，使得具有凹凸体的上表面22与癌细胞相接触，或者与所关注组织相接触，以抑制癌细胞生长的目的。这抑制了癌细胞通过聚氨酯多孔膜中的通孔从上表面22向下表面24迁移。当将聚氨酯多孔膜用于如上所述癌细胞生长抑制的目的时，可以将抗癌药附加地设置在聚氨酯多孔膜的上表面22和下表面24中的至少之一上。
[0068]B.聚氨酯多孔膜的制备方法
[0069]图4是示出根据本发明实施方案的用于制备聚氨酯多孔膜方法的流程图。所述聚氨酯多孔膜的制备方法首先提供未固化的聚氨酯材料(步骤S100)。聚氨酯材料包括多元醇或多羟基醇、异氰酸酯、以及稀释溶剂。将构成聚氨酯材料的各成分混合的步骤对应于上述解决问题的方案中所述的“混合步骤”。
[0070]所使用的多元醇可以是已知的多元醇，并且是例如具有20?570羟基值的多元醇。多元醇的官能团数优选为两个或更多，从而能够继续与异氰酸酯进行良好的反应。多元醇的官能团数优选为八个或更少，从而能够使孔的形成反应顺利进行。多元醇的数均分子量优选为不小于100，且优选为不小于1000，从而能够保证聚氨酯多孔膜的柔韧性。多元醇的数均分子量还优选为不大于20000、更优选为不大于10000，从而能够降低聚氨酯材料的粘度。多元醇的可用示例包括聚醚多元醇、聚合物多元醇、聚酯多元醇、丙烯酸系多元醇、以及聚碳酸酯多元醇。这些多元醇的任意一种可以单独使用，或者可以将这些多元醇的两种或两种以上组合使用。其中，聚醚多元醇和聚合物多元优选适宜的；以及聚醚多元醇是尤其优选的。
[0071]所使用的聚醚多元醇可以是例如聚丙烯乙烯多元醇(polypropylene ethylenepolyol)和/或聚四亚甲基醚二醇。特别优选的是聚丙烯乙烯多元醇。优选使用的聚合物多元醇是通过在聚醚多元醇中聚合不饱和乙烯单体(如苯乙烯或丙烯腈)所产生的聚合物。
[0072]所使用的异氰酸酯可以是已知的异氰酸酯，并且是例如在分子末端含有15质量％?50质量％的异氰酸酯基(NCO)的异氰酸酯。更具体地，所使用的异氰酸酯可以选自例如芳族异氰酸酯以及脂肪族异氰酸酯。特别优选的是芳族异氰酸酯。芳族异氰酸酯的可用示例包括二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、甲苯二异氰酸酯(TDI)以及它们的混合物。其中，二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)是优选的。
[0073]所使用的MDI可以是例如在一个分子中具有两个异氰酸酯基团和两个苯环的单体MD1、在一个分子中具有三个或更多异氰酸酯基团和三个或更多苯环的聚合MD1、或者其混合物。所使用的MDI并不局限于单体MDI和/或聚合MDI，但也可以是通过MDI与多元醇反应而得到的MDI预聚物。
[0074]使用稀释溶剂来调节包括多元醇和异氰酸酯在内的材料的粘度，并且稀释溶剂优选是基本上不与聚氨酯材料的其它组分发生反应的溶剂。稀释溶剂还优选是能够溶解多元醇和异氰酸酯以制备均质聚氨酯材料的溶剂。所使用的稀释溶剂可以选自例如四氢呋喃、丙酮以及甲基乙基酮。四氢呋喃是尤其优选的。
[0075]在根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法中，步骤SlOO中所提供的聚氨酯材料可以另外包括水作为改性剂。作为改性剂添加至聚氨酯材料的水起到此作用，改善聚氨酯材料对用于形成聚氨酯多孔膜的基材的湿润性。更具体地，作为改性剂的水的作用是，在下述步骤SllO在基材上滴加或施加聚氨酯材料的过程中避免聚氨酯材料凝结成块，并且便于在基材上形成均质聚氨酯材料层。就保证聚氨酯材料对基材的润湿性而言，相对于100质量份多元醇，添加至聚氨酯材料的水的量优选为不少于3质量份，更优选为不少于5质量份。还优选的是，在进行下述固化步骤之前，使作为改性剂添加至聚氨酯材料的水大部分去掉或挥发。因此，相对于100质量份多元醇，添加至聚氨酯材料的水的量优选为不超过15质量份，更优选不超过10质量份。只要在下述步骤S120中能够没有困难地形成聚氨酯材料层，也可以不向聚氨酯材料加水。
[0076]另外，在根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法中，可以向在步骤SlOO所提供的聚氨酯材料中加入分子量低于上述多元醇(例如，分子量为60?500，或优选分子量为60?300)的含羟基化合物，作为交联剂。交联剂的可用示例包括:二醇类，如乙二醇、二甘醇、I，2-丙二醇、I，3-丙二醇、I，2- 丁二醇、I，3- 丁二醇和I，4- 丁二醇；二醇化合物如二乙醇胺；三醇，如甘油；以及三醇化合物，如三乙醇胺和三羟甲基丙烷。
[0077]在根据本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法中，可以将用于加速固化和发泡的催化剂添加至在步骤S10所提供的聚氨酯材料。所使用的催化剂可以是已知的催化剂，并且可以是例如选自胺催化剂(如三乙胺、三丙胺和三丁胺)以及有机金属催化剂(如有机锡化合物)的催化剂。另外，适当时，可以添加任意已知的各种添加剂和辅助剂，包括:泡沫稳定剂，如表面活性剂；着色剂；抗氧化剂，如氧化抑制剂和紫外线吸收剂；填料如碳酸钙和硫酸钡；阻燃剂；增塑剂；以及脱模剂。然而，聚氨酯材料的组成越简单(即，包括在聚氨酯材料中的组分的数量越少)，越宜于减轻后述对细胞的潜在影响。另外，适宜的是不添加用于加速固化的催化剂，因为这会导致发泡反应进展缓慢，并且便于控制孔径。
[0078]在步骤SlOO提供聚氨酯材料之后，所述制备方法在基材上形成聚氨酯材料层(步骤SI 10)。这个步骤SllO对应于解决问题的方案中所描述的“层形成步骤”，并且步骤SlOO和步骤SllO对应于解决问题的方案中所描述的“第一步”。步骤SllO中所使用的基材可以是任意基材，只要其基本上不与聚氨酯材料发生反应、在制备聚氨酯多孔膜的过程中所用的温度条件下保持稳定、并且用于形成聚氨酯材料层表面足够光滑。所使用的基材可以是由选自下述材料制成的膜:聚丙烯(PP)、氟树脂如聚四氟乙烯(PTFE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯、聚偏二氯乙烯、聚酰胺以及聚酰亚胺。
[0079]图5是图示在基材44上形成聚氨酯材料层40的一个示例性过程的图。步骤SllO所采用的在基材上形成聚氨酯材料层的方法是例如这样的方法:在基材上滴加聚氨酯材料，并且使用旋转涂布机、刮条涂布机、或唇式涂布机、喷涂法、或者辊涂法来形成聚氨酯材料的膜。图5图示使用旋转涂布机通过旋转涂布法形成聚氨酯材料层的过程。更具体地，图5图示在基材44 (其被紧固在置于旋转涂布机回转台的玻璃板42上)上形成聚氨酯材料层40的过程。在此处说明中，在基材上形成聚氨酯材料层以制备聚氨酯膜的情况下，得到的聚氨酯膜中，远离基材的暴露表面称为“上表面”，而与基材相邻的相对表面称为“下表面”。
[0080]步骤SllO所形成聚氨酯材料层的厚度为例如0.1?20微米。为了保证聚氨酯多孔膜的强度并且改进处理能力，聚氨酯材料层的厚度优选为不小于I微米，且更优选为不小于3微米。为了在下述步骤120得到具有贯通至与基材相邻的相对表面的孔的聚氨酯多孔膜，聚氨酯材料层的厚度优选为不大于15微米，且优选为不大于10微米。
[0081]聚氨酯材料中所包括的稀释溶剂一般是高挥发性的，因而，当在步骤SllO形成聚氨酯材料层时，稀释溶剂会迅速从所形成聚氨酯材料层中挥发出来。随着在步骤SllO中用于形成聚氨酯材料层的聚氨酯材料中所包括的稀释溶剂的比例增加，在步骤SllO中形成的聚氨酯材料层的厚度相应减小。还优选的是，在后述固化聚氨酯的步骤S120之前，在步骤SllO使聚氨酯材料层中所包括的水充分挥发。更具体地，优选的是使聚氨酯材料层中所包括的水的量降低至这样的水平:即聚氨酯材料中的水基本上不会在后述固化聚氨酯的步骤S120中起到发泡剂的作用。当在步骤SllO采用旋转涂布法来形成聚氨酯材料层时，随着聚氨酯材料层的形成，能同时使稀释剂和水挥发。
[0082]在步骤SllO形成聚氨酯材料层之后，所述制备方法随着向聚氨酯材料层供给水蒸汽以使聚氨酯材料层固化(步骤S120)，从而完成聚氨酯多孔膜。这制备了例如图1至图3中所示的聚氨酯多孔膜10、110、210。步骤S120对应于解决问题的方案中所述的“第二步骤”。
[0083]更具体地，所述制备方法随着向远离基材44的聚氨酯材料层40的暴露表面供给水蒸汽，使聚氨酯材料固化。所采用的向聚氨酯材料层40暴露表面供给水蒸汽的方法是例如这样的方法:将形成于基材44上的聚氨酯材料层40置于饱和蒸汽压环境下。另一可用方法是使用例如水蒸汽喷嘴向聚氨酯材料层的暴露表面喷洒水蒸汽。
[0084]图6示意性图示将聚氨酯材料层40置于饱和蒸汽压环境下以制备聚氨酯多孔膜的工艺的图。此工艺使用了带有盖件52的气密容器54，并且在气密容器54中加入水56的情况下，将基材44施加至盖件52的里侧，以使聚氨酯材料层40的暴露表面与水56相对。例如，将气密容器54放置在设定为预定温度的恒温浴中，以维持气密容器54的内部温度处于预定温度，并且控制气密容器54中的蒸汽压为处于预定温度的饱和蒸汽压。以水蒸气的形式向聚氨酯材料层40供给水56的过程，在图6中用箭头示出。步骤S120中的反应的温度(称为“反应温度”)表示发生反应的聚氨酯材料层的温度，并且等于放置有气密容器54的恒温浴的设定温度(在图6所示的方法中)。在如上所述使用水蒸汽喷嘴的应用中，反应温度是例如待喷洒水蒸汽的温度。
[0085]固化反应在聚氨酯材料层中进行，在聚氨酯材料层中混合多元醇和异氰酸酯。在聚氨酯材料层中，涉及发泡的反应在供有水蒸汽的暴露表面上进行。更具体地，在聚氨酯材料层中，当向暴露表面供给水蒸汽时，聚氨酯材料中的异氰酸酯与水蒸汽反应生成二氧化碳，这在固化的过程中使聚氨酯发泡(以形成孔)，以构成多孔。根据本实施方案，水蒸气相应地起到聚氨酯发泡剂的作用。孔的形成是在供有作为发泡剂的水蒸汽的暴露表面上进行的，因而，在如图1至图3中所示的所得到的聚氨酯多孔膜中，孔通常形成为朝向暴露表面(上表面22)开口。
[0086]在本实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法中，通过调节条件，可以对聚氨酯多孔膜的结构进行控制，所述条件选自步骤S120的反应时间(称为“反应时间”)、步骤S120供给至聚氨酯材料层的水蒸汽的量(称为“水蒸汽供给量”)、以及聚氨酯材料的组成。这里聚氨酯多孔膜的结构包括:形成于聚氨酯多孔膜中的孔形状、孔直径、孔直径的变化、以及聚氨酯多孔膜的膜厚度。
[0087]使聚氨酯固化的反应(称为“固化反应”)以及使聚氨酯发泡的反应(称为“发泡反应”)二者均为化学反应。步骤S120中反应温度升高，继而增强了各反应的活化程度，而步骤S120中反应时间的增加使各反应更多地进行。因此，调节步骤S120的反应温度和/或反应时间能够改变固化反应与发泡反应之间的平衡，从而控制所得到的聚氨酯多孔膜的结构。就保证聚氨酯多孔膜的生产率以及保证聚氨酯膜的足够孔隙率而言，反应温度优选为不低于20°C，更优选为不低于30°C，进一步优选为不低于40°C。为了控制在聚氨酯多孔膜中所形成孔的尺寸，反应温度优选为不高于120°C，更优选为不高于80°C，进一步优选为不高于60°C。可以根据反应温度来适当地设定反应时间。就保证聚氨酯多孔膜的生产率而言，反应时间优选为不长于24小时，更优选为不长于17小时，进一步优选为不长于60分钟。就保证聚氨酯膜的足够孔隙率而言，反应时间优选为不短于I分钟，更优选为不短于10分钟。
[0088]对于改变所得到聚氨酯多孔膜中形成的孔形状而言，步骤S120中的反应温度和反应时间是重要参数。更具体地，对反应温度和反应时间进行适当地设定能够控制孔的形状，使得孔的内壁通常形成为大致弯曲的表面，并且孔朝向聚氨酯多孔膜的暴露表面开口。另外，这样的设定能够控制孔的形状，使得仅有单一的孔是沿膜的厚度方向设置(在膜的厚度方向上不会连续形成多个孔)(参见图1和图2)。
[0089]对于改变聚氨酯多孔膜的暴露表面(上表面22)上的平均孔径以及孔径变化，步骤S120中的反应温度和反应时间也是重要参数。通过调节反应温度和/或反应时间，可以将聚氨酯多孔膜的平均孔径控制在0.1?100微米范围内。为了将平均孔径控制在上述范围内，反应温度优选为不低于20°C，更优选为不低于30°C，进一步优选为不低于40°C。为了将平均孔径控制在上述范围内，反应温度还优选不高于120°C，更优选为不高于80°C，进一步优选为不高于60°C。可以根据反应温度适当地设定反应时间。为了将平均孔径控制在上述范围内，反应时间优选为不长于24小时，更优选为不长于17小时，进一步优选为不长于60分钟。为了将平均孔径控制在上述范围内，反应时间还优选为不短于I分钟，更优选为不短于10分钟。
[0090]发泡反应的活化程度随着反应温度的升高而增大。将反应温度设定为较低，相应地减小所得到聚氨酯多孔膜中形成的孔的孔径(平均孔径)，并且减小孔径的变化。为了充分减小孔的直径并且降低孔径的变化，反应温度优选为不高于55°C，更优选为不高于45°C。另一方面，就生产效率而言，反应温度优选为不低于35°C，更优选为不低于38°C。除了调节上述的反应温度和/或反应时间之外或者作为替代方式，通过调节供给至聚氨酯材料层暴露表面的水蒸汽的量，也可控制聚氨酯多孔膜暴露表面(上表面22)上的平均孔径。这是因为随着作为发泡剂的水蒸汽的供给量的增加，发泡反应的活化程度会提高。当如图6所示在添加水的同时在气密容器中进行固化反应时，设定的温度越高，使反应温度升高，并且饱和蒸汽压也增大，从而增加了水蒸汽供给量。这导致发泡反应的活化程度会升高，从而增大了平均孔径。聚氨酯多孔膜中孔的增大尺寸随着孔中谷处膜厚度而增大。
[0091]另外，对于改变聚氨酯多孔膜的膜厚度(峰处膜厚度)，步骤S120的反应温度和反应时间是重要参数。通过调节反应温度和/或反应时间，聚氨酯多孔膜的厚度可控制在I?100微米范围内。发泡反应活化程度的提高会增大得到的聚氨酯多孔膜的膜厚度。将反应温度设定为较低，相应地减小聚氨酯多孔膜的膜厚度。为了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述范围内，反应温度优选为不低于20°c，更优选为不低于30°C，进一步优选为不低于40°C。为了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述范围内，反应温度优选为不高于120°C，更优选为不高于80°C，优选为不高于60°C。可以根据反应温度来适当地设定反应时间。为了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述范围内，反应时间优选为不长于24小时，更优选为不长于17小时，进一步优选为不长于60分钟。为了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述范围内，反应时间还优选为不短于I分钟，更优选为不短于10分钟。
[0092]除了上述调节反应温度和/或反应时间之外或作为替代方式，通过调节聚氨酯材料的组成，也可控制聚氨酯多孔膜的膜厚度。更具体地，由于稀释溶剂的挥发，材料中所包括稀释溶剂的比例升高会导致经过步骤S120反应后的聚氨酯材料层的厚度减小。这导致所得到的聚氨酯多孔膜的膜厚度减小。为了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述范围内，相对于材料中所包括的100质量份多元醇,材料中所包括稀释溶剂的比例优选为不少于40质量份，更优选为不少于80质量份。为了控制聚氨酯多孔膜的膜厚度在上述范围内，相对于材料中所包括的100质量份多元醇,材料中所包括的稀释溶剂的比例还优选为不大于500质量份，更优选为不大于350质量份。
[0093]在步骤S120的固化反应和发泡反应进行期间，聚氨酯材料层越薄越容易形成贯通至基材侧(下表面)的孔。因此，通过如上所述提高稀释溶剂的比例来形成较薄的聚氨酯材料层，使得更容易得到具有更多数目的贯通至下表面的孔的聚氨酯多孔膜。为了得到具有这种通孔的聚氨酯多孔膜，相对于材料中所包括的100质量份多元醇，材料中所包括的稀释溶剂的比例优选为不少于90质量份，更优选不少于150质量份。为了得到具有这种通孔的聚氨酯多孔膜，相对于材料中所包括的100质量份多元醇，材料中所包括的稀释溶剂的比例还优选为不大于500质量份，更优选为不大于350质量份。
[0094]通过调节下列条件中的至少之一，可以控制聚氨酯多孔膜中所形成的孔深度(或者下文所述的谷处膜厚度)和/或平均孔径，所述条件即，步骤S10准备聚氨酯材料的“混合步骤”与步骤SllO形成聚氨酯材料层的“层形成步骤”之间的时间、以及上述“混合步骤”与上述“层形成步骤”之间聚氨酯材料的环境温度。例如，对上述条件的调节能够控制将在所得聚氨酯多孔膜中形成的孔的至少一部分，使之成为贯通至与基材44相邻的下表面24的通孔。
[0095]更具体地，“混合步骤”与“层形成步骤”之间时间的增加、或者“混合步骤”与“层形成步骤”之间温度的升高，使混合聚氨酯材料的固化反应更多地进展。在步骤S120，聚氨酯材料层中固化反应的进展越多，越难以通过供给水蒸汽形成孔。因此，“混合步骤”与“层形成步骤”之间时间的增加、或者“混合步骤”与“层形成步骤”之间温度的升高，易于使孔的深度减小，并且易于使平均孔径减小。换而言之，“混合步骤”与“层形成步骤”之间时间的减少、或者“混合步骤”与“层形成步骤”之间温度的降低，使得更容易形成通孔(作为聚氨酯多孔膜中所要形成的孔的至少一部分)，并且易于增大平均孔径。
[0096]根据上述本发明实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法，能够通过向聚氨酯材料层供给水蒸汽这样简单的技术，制备用于细胞培养和癌细胞生长抑制中的至少一种应用的聚氨酯多孔膜。这使得聚氨酯多孔膜的制造成本降低。
[0097]根据本发明实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法，能够通过调节条件来容易地形成贯通至下表面的多个孔，所述条件选自:在供给水蒸汽的同时进行固化反应期间的反应温度、反应时间、水蒸汽供给量、以及聚氨酯材料的组成。这样能够使膜的两个表面都能够用作细胞培养支架。另外，使用这样一种聚氨酯多孔膜能够以提供细胞之间相互作用的特定模式在各自的表面上进行细胞培养。
[0098]根据本发明实施方案的聚氨酯多孔膜的制备方法，能够将贯通至下表面的孔的孔径(平均孔径)减小至小于10微米(这是标准细胞尺寸)。使用这样的膜能够允许物质(例如，来自各自细胞的分泌物)发生转移的同时阻碍细胞在各自表面之间进行迁移，由此能够更详细地分析各自表面上的细胞之间的相互作用。
[0099]使用水(液态水)作为发泡剂来制备多孔聚氨酯的方法在本领域是已知的。将液态水与聚氨酯材料混合使水与异氰酸酯反应，从而生成二氧化碳和泡沫聚氨酯。然而，本实施方案与现有技术的不同之处在于并不是使用处于液态水状态的水作为发泡剂，而是使用处于水蒸汽的汽化状态的水作为发泡剂。
[0100]除了液态水之外，还已知的是使用氟碳化合物和环戊烷作为发泡剂来制备多孔聚氨酯。通过使用液态水或氟碳化合物所形成的孔的尺寸通常为约数百微米。因此，使用液态水或氟碳化合物难以满足作为用于细胞培养的多孔膜的要求。使用液态水或氟碳化合物作为发泡剂在膜内形成孔，相应地难以形成朝向膜上表面开口的孔以提供具有足够凹凸体的膜表面，或者难以形成贯通至膜下表面的孔。另一方面，本实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法将水蒸汽作为发泡剂供给到暴露表面上，由此制备在上表面上具有凹凸体的膜，其适合作为用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的多孔膜。
[0101]用于制备聚氨酯多孔体的另一已知技术是用在普通状态下或者在超临界状态下将二氧化碳气体、氮气或空气充入样品并且调节温度，从而获得气体和聚合物的熔融状态，由此形成细孔。然而，这种已知方法将孔形成为闭孔结构，因此难以形成朝向膜上表面开口的孔以提供具有足够凹凸体的膜表面、或者难以形成贯通至膜下表面的孔。该方法还难以在发泡过程中将膜厚度控制在一定范围内。另一方面，本实施方案的聚氨酯多孔膜制备方法能够制备在上表面上具有凹凸体、具有期望膜厚度的多孔膜，其适合作为用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的多孔膜。
[0102]C.变化
[0103]图7是示出根据本发明实施方案的聚氨酯多孔膜的变化例制备方法的流程图。图7中与图4相同的步骤用相同的步骤编号示出，并且在此不再具体说明。在图7的变化流程中，步骤SlOO?步骤S120与图4流程中的是相同的。与图4流程的不同之处在于这样的附加步骤:在步骤S120之后，停止水蒸汽的主动供给，在干燥条件下，使聚氨酯加速固化(步骤S130)。更具体地，当如先前所述在步骤S120中使用气密容器54时，本过程除去了气密容器54中的液态水，并且进一步继续进行固化反应。在另一示例中，当在步骤S120中使用水蒸汽喷嘴时，本过程停止使用喷嘴喷洒水蒸汽，并且进一步继续进行固化反应。
[0104]这种变化例流程在制备聚氨酯多孔体的步骤之后具有附加的步骤，以使聚氨酯进一步继续固化，因而，可以通过主要考虑期望的孔隙率程度来设定步骤S120的条件。这能够以更高的精确度来控制孔隙率程度(更具体地，例如，平均孔径、贯通至下表面的通孔的比例、以及由于发泡导致的膜厚度变化程度)。与图4的制备方法相比，图7的制备方法通过在步骤S120中设定较低的反应温度和较短的反应时间，进一步减小位于膜上表面的平均孔径，并进一步降低孔尺寸的变化
[0105]实施例
[0106]〈制备聚氨酯多孔膜〉
[0107][样品I和样品2]
[0108]图8是示出样品I和样品2的聚氨酯膜的材料组成和固化条件的图表。样品I的聚氨酯膜根据图4中所示的制备方法制备。如后所述，样品2的聚氨酯膜的制备方法的不同之处仅在于，在与图4的步骤S120相对应的步骤中，在没有供给水蒸汽的情况下进行固化。制备样品I和样品2的聚氨酯膜的过程在步骤SlOO中提供了具有图8中所示组成的材料。如图8中所示，使用聚醚多元醇作为样品I和样品2的聚氨酯膜生产中的多元醇。更具体地，所使用的多元醇是具有约4000数均分子量和37羟值的聚丙烯乙烯多元醇。所使用的异氰酸酯是多元醇改性的二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)，在其分子末端含有28.0质量％的异氰酸酯基(NCO)。所使用的交联剂是二甘醇(DEG)。所使用的稀释溶剂是四氢呋喃(THF)。所使用的改性剂是水或者更具体的是超纯水(Mill1-Q(商标名)水)。图8示出了各自成分相对于100质量份多元醇的质量比、以及作为材料中各成分组成的各组分混合重量。关于四氢呋喃，所加入的溶剂的量示于图8中。基于溶剂中四氢呋喃的浓度为0.89克/毫升的假设来计算四氢呋喃的质量比。
[0109]在步骤S110，本过程通过图5中所示的旋转涂布法在基材44上形成聚氨酯材料层40。更具体地，在步骤S110，本过程将图8中所示组成中除异氰酸酯之外的其他各组分加入气密样品容器中，并且使用Vortex搅拌器(由IKA Works Inc.制造的GENIUS3)搅拌混合物30秒。本过程接着在冰浴上冷却容纳有上述混合物的样品容器。然后，本过程加入图8中所示的特定量的异氰酸酯，使用Vortex搅拌器搅拌混合物30秒，并且在冰浴上冷却容纳有上述样品的混合物的样品容器，以抑制进一步反应。在临进行旋转涂布之前，本过程用Vortex搅拌器再次搅拌上述样品I分钟，并且在置旋转涂布机中的基材44上，施加并旋涂I毫升样品。所使用的旋转涂布机是由Mikasa Col., Ltd.制造的MS-A100。所使用的基材44是聚丙烯(PP)薄膜，并且用胶带将该薄膜紧固在放置于旋转涂布机转台的玻璃板上。在室温下以5000转每分钟(rpm)的旋转速度进行旋涂60秒钟。
[0110]在步骤S120，使用由Iwasaki Industry Inc.制造的 AIR KEEPER A-032 (1.35 升容量)作为图6中所示的气密容器。在制备样品I的过程中，向上述气密容器54中加入100毫升水，并且将气密容器54置于设定至40°C (其为固化温度)的恒温浴中，以加热气密容器54，直至气密容器54中的水温达到固化温度。在临开始固化反应之前，本过程从恒温浴中取出气密容器54,并且用Kimtowel (注册商标)(由Nippon Paper Crecia C0.，Ltd.制造)擦掉气密容器54的盖件52背面上的水，以抑制水滴在固化反应期间的影响。使用双面胶带，将带有用旋转涂布机所形成聚氨酯材料层40的基材44紧固至盖件52。本过程将固定有聚氨酯材料层40的盖件52封闭，并且将气密容器54放置在恒温浴中，以加热气密容器54过夜。相应地，使样品I暴露于40°C下的饱和蒸汽压，并且使其在40°C下进行固化反应。在下文说明中，将聚氨酯固化期间在固化温度下具有饱和水蒸汽的气氛称为水蒸汽气氛。
[0111]取代步骤S120，使样品2在没有供给水蒸汽的情况下经历固化步骤。更具体地，除了在气密容器中没有加水并且恒温浴的温度被设定为60°C之外，按照与上述样品I制备过程相同的过程来制备样品2。因此，在样品2固化反应期间，气密容器中的水蒸汽压等于封闭气密容器之前空气中的水蒸汽压。在下文说明中，将聚氨酯固化期间在未主动供给水蒸汽的情况下的水蒸汽压力称为干燥气氛。
[0112]图9的图表示出对样品I和样品2的聚氨酯膜进行观察的结果。在15千伏加速电压下，使用扫描电子显微镜(SEM，S-800，由Hitachi，Ltd.制造)以200?10000倍放大倍率观察聚氨酯膜。作为示例，图9示出了 3000倍放大倍率下对聚氨酯膜的上表面(远离基材的暴露表面)和下表面(通过去除基材可观察到的表面)的观察、以及在1000倍放大倍率下对横截面的观察。通过用刀片沿膜厚度方向切割带有聚氨酯膜的基材44，由此准备用于观察横截面的样品。如下所述，关于样品2没有观察到孔的形成，因而，对于样品2也就没有去除基材44对下表面进行观察。
[0113]在图9中，在各样品中，峰处膜厚度(膜上表面上所形成凹凸体的凸起部最高位置之间的距离)示为“峰处膜厚度”。在形成有孔的样品中，谷处膜厚度(膜下表面所形成凹凸体的凹部最深位置之间的距离)示为“谷处膜厚度”。在形成有孔的样品中，位于膜的上表面22上的孔的开口直径(参见图1至图3)示为“上表面孔尺寸”，以及，位于下表面24上的孔的开口直径的最大值(参见图1至图3)示为“最大下表面孔尺寸”。图9还示出了“峰处膜厚度”、“谷处膜厚度”、以及“上表面孔尺寸”的标准偏差。
[0114]通过以下方式确定上述“峰处膜厚度”、“谷处膜厚度”以及其标准偏差:在样品横截面图像中选择三个可见区域，计算各可见区域中的平均值，并且计算各自可见区域平均值的中值。关于后述的其它样品，按照相同的方式来确定“峰处膜厚度”、“谷处膜厚度”以及其标准偏差。
[0115]利用图像分析软件Mac-View (由Mountech C0., Ltd.出品)，通过图像分析来确定上述“上表面孔尺寸”和“最大下表面孔尺寸”、以及“上表面孔尺寸的标准偏差”。更具体地，对于各样品上表面或下表面的特定可见区域(1000倍放大倍率下的视场)中的所有孔而言，图像分析的过程测得最大长度(外切于各孔的矩形的侧边长度最大值)，并且根据最大长度的测量值来计算“上表面孔尺寸”及其标准偏差和最大值的平均值。在图9中，“上表面孔尺寸”的标准偏差示于“上表面孔尺寸”平均值的下方。对于后述其它样品，“上表面孔尺寸”、“下表面孔尺寸”及其标准偏差，以及上表面和下表面的各自孔尺寸的最大值和最小值，也通过上述图像分析软件确定。
[0116]如图9中所示，通过在水蒸汽气氛下进行固化反应，样品I给出的聚氨酯多孔膜具有大量贯通至下表面的孔。另一方面，在采用干燥气氛下进行固化反应的样品2中，观察到没有孔形成。样品I和样品2具有与图8中所示相同的材料组成，因此二者在固化反应之前具有几乎相同的材料层厚度。然而，在固化之后，发泡的样品I具有更大膜厚度(图9中“峰处膜厚度”)。在样品I中，位于上表面22的开口的孔径大于位于下表面24的开口的孔径。这表明了孔从上表面22侧发展至下表面24侧的孔形成过程。
[0117]如图8中所示，相对于材料中100质量份多元醇，样品I和样品2各含有7质量份水。与在聚氨酯泡沫生产期间使用水作为发泡剂的情况下材料中所混合水的通常比例相t匕，此含量比更高。然而，在样品2中观察到没有孔形成。这归因于在旋涂过程中材料中的水分丧失，导致混合在材料中的水几乎不能起到发泡剂的作用。因此，认为是，在形成有孔的样品I中，只有供给至暴露表面的水蒸汽实质上起到了发泡剂的作用。
[0118][样品3?样品8]
[0119]图10的图表示出样品3?样品8的聚氨酯膜的材料组成以及固化条件。样品3?样品8的聚氨酯膜根据图4中所示的制备方法制备。更具体地，制备样品3?样品8的聚氨酯膜的过程是在步骤SlOO中提供具有图10所示组成的材料。如图10中所示，用来生产样品3?样品5的聚氨酯膜的多元醇是聚醚多元醇(37的羟基值，以及大约4000的分子量)，其与样品I的相同。另一方面，用来生产样品6?样品8的聚氨酯膜的多元醇是聚合物多元醇(27的羟基值，以及大约5000的分子量，是通过苯乙烯和丙烯腈在聚醚多元醇中进行接枝共聚而得到的聚合物)。材料中所包括其它组分的种类以及膜形成条件都与样品I中的相同。图10按与图8相同的方式示出了各自组分的组成。
[0120]按与样品I中相同的方式来进行步骤SllO的后继材料层形成步骤、以及步骤S120的固化步骤。与样品I的不同在于:对于样品3和样品6，固化温度设定为室温；对于样品4和样品7，固化温度设定为60°C ；以及，对于样品5和样品8，固化温度设定为80°C。
[0121]图11的图表示出按与样品I相同的方式用SEM观察样品3?样品8聚氨酯膜的结果。作为示例，图11示出了 1000倍放大倍率和5000倍放大倍率下对聚氨酯膜的上表面(远离基材的暴露表面)进行的观察。图11还示出各自样品的总膜厚度(峰处膜厚度)。
[0122]如图11中所示，在样品3?样品8中，通过在水蒸汽气氛下进行固化反应，在上表面形成凹凸体。比室温高的温度条件导致所形成凹凸体的数量增加，并因此导致所形成孔的数量增加。这归因于，利用水蒸汽在膜的上表面上形成凹凸体(孔)的反应是与固化反应类似的化学反应，并且将温度升高到一定水平，保证了活化程度更充分。
[0123]在将聚醚用于多元醇的情况下，在将固化温度设定为室温时，在上表面上形成了凹凸体，但没有观察到可识别为孔的孔洞(样品3)。在将固化温度设定为60°C以及80°C时，在上表面观察到大量的孔(样品4和样品5)。然而，采用相对较低固化温度60°C的样品4具有孔径更精细且更均匀的孔(参见1000倍放大倍率下的上表面图像)，并且具有更大的膜厚度。另一方面，在将聚合物多元醇用于多元醇的情况下，将固化温度设定为室温以及60°C下时，在上表面上形成了凹凸体，但没有观察到可识别认为孔的孔洞(样品6和样品7)。在将固化温度设定为80°C时，在上表面上观察到了大量的孔(样品8)。考虑到这些结果，可以预期的是，可以根据所使用聚氨酯材料的类型，通过适当地设定包括固化温度在内的固化条件，能够适当地控制在膜上表面所形成的凹凸体或孔。
[0124][样品9?样品11]
[0125]图12的图表示出样品9?样品11的聚氨酯膜的材料组成以及固化条件。根据图4中所示的生产方法来制备样品9和样品10的聚氨酯膜。样品11的聚氨酯膜制备方法的不同之处在于:采用干燥气氛作为与下述步骤S120相对应的步骤中的气氛。生产样品9?样品11聚氨酯膜的过程中，在步骤SlOO提供图12中所示组成的材料。如图12中所示，包括在用于制备样品9?样品11的聚氨酯膜材料中的组分类型以及膜形成条件与样品I中的相同。图12按与图8相同的方式示出各自组分的组成。
[0126]按与样品I中相同的方式来进行步骤SllO的后继材料层形成步骤、以及步骤S120的固化步骤。然而，对于样品9，固化温度设定为50°C，以及，对于样品10和样品11，固化温度设定为60°C。
[0127]图13A和图13B的图表示出按与样品I相同的方式用SEM观察样品9?样品11的聚氨酯膜的结果。作为示例，图13A示出了 3000倍放大倍率下对聚氨酯膜的上表面、下表面、以及横截面的观察。关于如下所述的样品11，没有观察到形成孔，因而，对于样品11，没有去除基材去观察下表面。图13B示出关于各样品的“峰处膜厚度”和“谷处膜厚度”及其标准偏差，连同上表面和下表面的平均孔径及其标准偏差、以及孔径的最大值和最小值。使用1000倍放大倍率下的上表面图像以及200倍放大倍率下的下表面图像进行孔径分析。
[0128]如图13A中所示，对于样品9和样品11，通过在水蒸汽气氛下进行固化反应，形成了贯通至下表面的孔。然而，在采用干燥气氛进行固化反应的样品11中，没有观察到孔或凹凸体形成。
[0129]根据样品9与样品10之间的比较，尽管样品9和样品10具有相同的材料组成，但采用相对较高固化温度的样品10具有更大的膜厚度。换而言之，步骤SllO所形成的样品9和样品10的材料层具有大致相同的厚度，但在固化之后，样品10具有更大的膜厚度。这归因于，在采用相对较高固化温度的样品10中，使用水蒸汽进行的发泡反应更充分。根据样品9与样品10之间的比较，采用相对较低固化温度的样品9中，孔在上表面的开口孔径较小，并具有较小的孔径变化。另外，根据将下表面的开口孔径进行比较，采用相对较低固化温度的样品9具有更大的平均孔径，但具有较小的孔径变化。这些结果表明，参与孔形成的化学反应在较高固化温度下能够更充分地进行，以及，通过适当调节伴随发泡反应的固化温度，能够制备出具有贯通至下表面的孔、孔径较小且孔径变化较小的聚氨酯多孔膜。
[0130]在如上所述分别采用60°C固化温度和80°C固化温度以在水蒸汽气氛下进行固化的样品4和样品5中，没有形成贯通至下表面的孔。另一方面，在采用40°C固化温度的样品1、采用50°C固化温度的样品9、以及采用60°C固化温度的样品10中，在水蒸汽气氛下进行固化，形成了贯通至下表面的孔。这归因于样品1、样品9、以及样品10在材料中具有的稀释溶剂含量比(相对于100质量份聚醚的稀释溶剂量)高于样品4和样品5，因此，使经过固化反应的材料层厚度减小，并且易于形成通孔。
[0131][样品12?样品14]
[0132]图14是示出样品12?样品14的聚氨酯膜的材料组成以及固化条件的图表。根据图7中所示的生产方法来制备样品12和样品13的聚氨酯膜。样品14聚氨酯膜的制备方法的不同之处在于，取代步骤S120和步骤S130，仅仅采用了干燥气氛下的一步固化反应。制备样品12?样品14的聚氨酯膜的过程中，在步骤SlOO提供具有如图14中所示组成的材料。如图14所示，用于制备样品12?样品14聚氨酯膜的材料中所包括的组分类型以及膜形成条件与样品I中的相同。图14按照与图8相同的方式示出了各自组分的组成。
[0133]对于样品12和样品13，按照与样品I相同的方式进行步骤SllO的后续材料层形成步骤、以及步骤S120的固化步骤。与样品I的不同之处在于，在步骤S120，样品12在40°C的固化温度下进行固化反应30分钟，以及，样品13在50°C的固化温度下进行固化反应30分钟。在样品12和样品13中，步骤S130之后，在干燥气氛下使固化加速。更具体地，本过程将气密容器中的液态水除去，以使气氛从水蒸汽气氛改变为干燥气氛，并且在60°C下继续固化反应过夜。另一方面，在样品14中，在步骤S120，本过程以60°C的固化温度在干燥气氛下使固化反应过夜，而没有在水蒸汽气氛下进行固化反应。
[0134]图15A和图15B的图表不出按与样品I相同方式在SEM下对样品12?样品14的聚氨酯膜进行观察的结果。作为示例，图15A示出500倍放大倍率下对各聚氨酯膜的上表面的观察、以及1000倍放大倍率下对横截面的观察。图15A还示出在200倍放大倍率下对样品12的下表面进行的观察、以及在500倍放大倍率下对样品13的下表面进行的观察。如下所述，关于样品14，没有观察到孔形成，因而，对于样品14，没有去除基材去观察下表面。图15B示出了各样品的“峰处膜厚度”和“谷处膜厚度”及其标准偏差、以及上表面和下表面的平均孔径及其标准偏差、以及孔径的最大值和最小值。使用500倍放大倍率下的上表面图像、以及200倍放大倍率下的下表面图像进行孔径分析。
[0135]如图15A中所示，在样品12和样品13中，在水蒸汽气氛下进行固化反应，观察到形成了贯通至下表面的孔。另一方面，在样品14中，只在干燥气氛下进行固化反应，没有观察到孔或凹凸体形成。
[0136]根据样品12与样品13之间的比较，尽管样品12和样品13具有相同的材料组成(尽管样品12和样品13的材料层具有大致相同的厚度)，但采用相对较高固化温度的样品13具有更大的膜厚度。这归因于，采用相对较高固化温度的样品13中使用水蒸汽进行的发泡反应更充分。根据样品12与样品13之间的比较，在水蒸汽气氛下采用相对较低固化温度的样品12中，位于上表面和下表面的孔具有较小的孔径(平均孔径、最大值、以及最小值)、以及较小的孔径变化(孔径的标准偏差)。
[0137]在作为固化反应第一步骤的步骤S120中采用了 40°C反应温度的样品12中，聚氨酯多孔膜的上表面上，观察到了干涉图样。这种干涉图样的存在表明，朝向膜的上表面开口的多个孔的孔径变化是非常小的。然而，即使将伴随发泡反应的固化温度设定至40°C，如果如同上述样品I那样没有在干燥气氛下进行加速固化步骤S130，那么任何样品中都没有在聚氨酯多孔膜的上表面观察到干涉图样(这种干涉图样的数据未示出)。这些结果显示，可以通过将固化反应(伴随有使用水蒸汽的发泡反应)的时间设定为较短，并且接着在干燥气氛下加速固化反应，可以得到较小的平均孔径和较小的孔径变化。这归因于，在两步式固化反应中，仅在第一步采用水蒸汽气氛，这样的固化反应使得发泡反应在过多进展之前就停止而处于孔径较小且均匀的状态。
[0138][样品15?样品23]
[0139]图16A和图16B的图表不出样品15?样品23的聚氨酯膜的材料组成和固化条件、以及对所得到聚氨酯多孔膜的表面进行测量的结果。根据图7中所示的生产方法来制备样品15?样品23的聚氨酯膜。图16A和图16B示出了材料中各自组分的组成，以各自组分相对于100质量份多元醇的质量比来表示。
[0140]如图16A和16B中所不，样品15?样品23使用了与上述样品I?样品14中不同类型的多元醇和异氰酸酯来制备聚氨酯膜的材料。在各自样品中使用了下列多元醇。样品15中所使用的多元醇是具有397羟值的聚醚多元醇(聚氧亚丙基甘油醚)。样品16中所使用的多元醇是具有27羟值的聚合物多元醇(其是通过苯乙烯与丙烯腈在聚醚多元醇中进行自由基聚合、环氧丙烷和环氧乙烷与丙三醇进行加成聚合而获得的)。样品17中所使用的多元醇是具有56羟值的聚酯多元醇(聚(己二酸乙二醇酯)二醇)。样品18中所使用的多元醇是具有55羟基值的聚碳酸酯二醇。
[0141]样品19中所使用的异氰酸酯是在分子末端含有33.6质量％异氰酸酯基(NCO)的单体MDI。样品20中所使用的异氰酸酯是在分子末端含有23.1质量％异氰酸酯基(NCO)的多元醇改性的MDI。样品21中所使用的异氰酸酯是在分子末端含有30.7质量％异氰酸酯基(NCO)的聚合MDI。样品22中所使用的异氰酸酯是在分子末端含有28.7质量％异氰酸酯基(NCO)的碳二亚胺改性的MDI。样品23中所使用的交联剂是乙二醇。样品15?样品23中所使用的其它组分与样品I?样品14中所使用的那些相同。图16A和图16B示出了聚氨酯膜的材料组成，以相对于100质量份多元醇的量的形式表示。样品15?样品23生产中所采用步骤SllO?S130的条件与上述样品12中所采用的那些相同。
[0142]图17?图25示出用处于15千伏加速电压下扫描电子显微镜(SEM，S-800，Hitachi，Ltd.制造)以2000倍放大倍率或3000倍放大倍率从一定角度对样品15?样品23各自生产的聚氨酯膜进行的观察。如图17?图25中所示，可以确认，使用不同类型的多元醇、异氰酸酯、或交联剂，可生产出具有朝向至少上表面22开口的多个孔的聚氨酯多孔膜。图16A和图16B还示出样品15?样品23的各自聚氨酯多孔膜的膜厚度、以及上表面22上的平均孔径(上表面孔尺寸)。
[0143]〈使用聚氨酯多孔膜的细胞培养〉
[0144]下文对使用如下制备的聚氨酯多孔膜(样品24和样品25)进行细胞培养的结果加以说明。
[0145][样品24和样品25]
[0146]图26的图表不出样品24和样品25的聚氨酯多孔膜的材料组成和固化条件、以及对所得到聚氨酯多孔膜的表面进行测量的结果。根据图7中所示的生产方法来制备样品24和样品25的聚氨酯多孔膜。在样品24和样品25的聚氨酯多孔膜的生产中所使用的材料组分的类型与样品I中所使用的相同。图26按与图8相同的方式示出了各组分的组成。
[0147]样品24和样品25的生产中所采用的步骤SllO?S130的条件与上述样品12中所采用的那些相同。样品24和样品25在步骤SlOO的材料混合(混合步骤)与步骤SllO的旋涂(层形成步骤)之间采用不同时间。在混合步骤与层形成步骤之间使样品24在室温下静置12分钟，以及，在混合步骤与层形成步骤之间使样品25在室温下静置30分钟。
[0148]如上制备的样品24是具有贯通至下表面24的孔的通孔膜。样品25是非通孔膜。此处的“非通孔”膜是指:以2000倍放大倍率观察膜的下表面24 (生产期间与基材相邻的表面)的指定可见区域，其中的孔的总面积小于所述可见区域的整个面积的5%。与上述“上表面孔尺寸”类似，使用图像分析软件Mac-View (由Mountech C0.,Ltd.制造)，通过图像分析来确定下表面24上的孔面积。
[0149]在样品24的聚氨酯多孔膜中，上表面22上的平均孔径(上表面孔尺寸)为14微米；下表面24上的平均孔径(下表面孔尺寸)为11微米；以及，膜厚度(峰处膜厚度)为6微米。在样品25中，上表面22上的平均孔径为3微米，以及，膜厚度为3微米。如上所述，混合步骤与层形成步骤之间的时间较短的样品24提供了通孔膜，而混合步骤与层形成步骤之间的时间较长的样品25提供了在上表面22上具有较小平均孔径的非通孔膜。
[0150][细胞培养条件]
[0151]⑴细胞系
[0152]使用以下两种细胞系用于培养:
[0153]HUVEC(人胳静脉内皮细胞):HUV-EC_C(Nat1nal Institute of B1medicalInnovat1n, JCRB Cell Bank, IF050271);以及
[0154]AoSMC (人主动脉平滑肌细胞):AoSMC(Lonza，CC-2571)。
[0155](ii)培养基(Culture Medium)
[0156]用于HUVEC的培养基是DMEM-12 (Gibco，11330-057)，加入了青霉素链霉素(Gibco, 15140-122)、肝素钠盐(SIGMA-ALDRICH，H3149-100KU)和 ECGS (血管内皮细胞生长补充)(SIGMA，E2759)。用于 AoSMC 的培养基是 SmGM-2(商标)Smooth Muscle Cell MediumBulletKit (商标)(Lonza, CC-3182)。
[0157](iii)细胞培养装置
[0158]图27是示意性图示在使用聚氨酯多孔膜的两个表面进行细胞培养中所使用细胞培养装置60的透视图。细胞培养装置60是由玻璃制成并具有13毫米外径的环状件。
[0159]在细胞培养过程中，布置聚氨酯多孔膜以覆盖上述环状细胞培养装置60的一个开口。更具体地，本过程在细胞培养装置60侧面的两个不同位置处预先贴附双面胶带，将聚氨酯多孔膜安装于乙醇中的细胞培养装置60上，并且将聚氨酯多孔膜的周边与双面胶带粘合。本过程随后除去乙醇，并且干燥聚氨酯多孔膜，以将聚氨酯多孔膜固定于细胞培养装置60。在进行下述的双侧(上侧和下侧)培养的情况下、或者在将细胞接种于上表面22上而进行单侧培养的情况下，布置聚氨酯多孔膜，使得聚氨酯多孔膜的上表面22暴露于环状细胞培养装置60内。另一方面，在将细胞接种于下表面24上以进行单侧培养的情况下，布置聚氨酯多孔膜，使得聚氨酯多孔膜的下表面24暴露于环状细胞培养装置60内。
[0160](iv)细胞培养过程
[0161](iv)-l双侧(上侧和下侧)培养
[0162]图28是图示使用细胞培养装置60在聚氨酯多孔膜的两个表面上进行细胞培养的过程的图。在紫外线(UV)灭菌之后，本细胞培养过程首先将附着至细胞培养装置60的聚氨酯多孔膜预处理，在用于AoSMC的培养基中过夜(图28 (A))。本过程随后将AoSMC接种于聚氨酯多孔膜的上表面22 (图28 (B))，并且在37°C和5% CO2的条件下培养AoSMC五天(图28(C))。然后，本过程将细胞培养装置60竖向倒置(图28(D))，并且将培养基调换为用于HUVEC的培养基(图28 (E))。本过程随后将HUVEC接种在聚氨酯多孔膜的下表面24上(图28 (F))，并且在37 °C和5 % CO2条件下培养HUVEC三天。
[0163](iv)-2单侧(上侧或下侧)培养
[0164]在进行单侧(上侧或下侧)培养的情况下，将细胞仅接种于附着于细胞培养装置60的聚氨酯多孔膜的一个表面(暴露于环状细胞培养装置60内的表面)。在进行单侧培养的情况下，在UV灭菌之后，本过程将附着于细胞培养装置60的聚氨酯多孔膜预处理，在用于待接种细胞的培养基中过夜。本过程随后在聚氨酯多孔膜的上表面22或在下表面24上接种HUVEC或AoSMC，并且在37°C和5% CO2的条件下培养HUVEC三天或AoSMC四天。
[0165][评估方法]
[0166]细胞培养之后，将附着于细胞培养装置60的聚氨酯多孔膜用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗清一次。本过程随后在37°C环境下以用于组织固定的4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲溶液(163-20145,由 Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)进行处理十分钟，以固定细胞，并且用含有1% Triton-XlOO的PBS和含有0.02% Tween20的PBS进行处理，以提供具有渗透性的细胞膜。然后，如下所述观察各细胞。
[0167]对于HUVEC，使用对在内皮细胞表面上集中表达的作为细胞表面受体的CD31的小鼠抗体(SIGMA，P8590)作为初次抗体，以及，抗小鼠IgG抗体(Invitrogen，A-11004)被用作二次抗体。用二次抗体处理过的细胞中荧光材料的激发导致HUVEC的CD31被染成红色。
[0168]对于AoSMC，使用对a SMA (其为平滑肌细胞的细胞骨架蛋白)的兔抗体(Abcam，ab32575)作为初次抗体，以及，使用抗兔IgG抗体(Invitrogen，A-11008)作为二次抗体。用二次抗体处理过的细胞中荧光材料的激发导致AoSMC的a SMA被染成绿色(从洗清到染色，图 28 01))。
[0169]上述处理之后，将聚氨酯多孔膜与细胞培养装置60分离，并密封在载玻片上。用激光共聚焦显微镜观察聚氨酯多孔膜的细胞培养表面(图28(1))。
[0170][细胞培养结果]
[0171]图29是照片，其示出了以HUVEC接种在样品25的聚氨酯多孔膜(非通孔膜)上表面22上的单侧培养结果。图30是照片，其示出了以HUVEC接种在样品25的聚氨酯多孔膜(非通孔膜)的下表面24上的单侧培养结果。在这两种情况下，HUVEC的接种密度为5.0 X 14细胞/平方厘米。图29和图30 二者都是400倍放大倍率下的观察结果。
[0172]根据图29与图30之间的比较，与聚氨酯多孔膜(非通孔膜)的下表面24相比，在上表面22上观察到更好的细胞生长。此结果证明，与不具有这种凹凸体的聚氨酯膜相比，在聚氨酯固化期间通过供给水蒸汽构成多孔(以形成凹凸体)的聚氨酯多孔膜起到更好的细胞培养膜的作用。
[0173]图31Α和图31Β是照片，其示出双侧(上侧和下侧)培养结果，AoSMC接种在样品24的聚氨酯多孔膜(通孔膜)上表面22，以及，HUVEC接种在下表面上24。图32Α和32Β是照片，其示出双侧(上侧和下侧)培养结果，AoSMC接种在样品25的聚氨酯多孔膜(非通孔膜)上表面22，以及，HUVEC接种在下表面上24。在这两种情况下，AoSMC的接种密度为1.0 X 14细胞/平方厘米，而HUVEC的接种密度为5.0X 14细胞/平方厘米。图31Α和图3IB以及图32Α和图32Β都是400倍放大倍率下的观察结果。
[0174]根据图31Α与图31Β、以及图32Α与图32Β之间的比较，与样品25的聚氨酯多孔膜(非通孔膜)相比较，样品24的聚氨酯多孔膜(通孔膜)提供了 AoSMC和HUVEC 二者的更好细胞生长。这可归因于AoSMC与HUVEC之间经由聚氨酯膜孔的相互作用。据此，可以预期的是，通过在具有通孔的聚氨酯多孔膜(如样品24)的两个表面上进行细胞培养，能够分析不同细胞之间的相互作用。
[0175]<借助于聚氨酯多孔膜的癌细胞生长抑制>
[0176]下面描述使用如下制备的聚氨酯多孔膜(样品26、样品27、以及样品28)对癌细胞生长抑制作用的研究结果。
[0177][样品26?样品28]
[0178]图33是图表，其示出样品26?样品28的聚氨酯膜的材料组成和固化条件、以及对所得到聚氨酯膜的表面进行测量的结果。根据图7中所示的生产方法来制备样品26和样品27的聚氨酯多孔膜。如下所述，在生产样品28的聚氨酯膜时，没有在步骤S120通过供给水蒸汽进行固化。如图33中所示，样品26?样品28的聚氨酯膜的生产中所使用材料的组分类型与样品I中所使用的相同。图33按与图8相同方式示出了各自组分的组成。
[0179]样品26和样品27按与样品I相同的方式进行步骤SllO的层形成步骤，接着，在步骤S120中，在40°C水蒸汽气氛下进行固化反应30分钟，并在步骤S130中，在60°C的干燥气氛下进行固化反应过夜。在步骤SllO的层形成步骤中，样品28以2000rpm的转速在室温下进行旋涂60秒钟，接着，在60°C的干燥气氛下进行固化反应过夜，而不是在水蒸汽气氛下进行固化反应。
[0180]如上所述制备的样品26和样品27是具有未贯通至下表面24的非通孔膜。样品28是大致没有孔形成的无孔膜。此处的“无孔膜”是指:2000倍放大倍率下观察，在膜的上表面22 (生产期间远离基材的表面)的指定可见区域中，其中的孔的总面积小于所述可见区域的整个面积的5%。如图33中所示，在样品26的聚氨酯多孔膜中，上表面上的平均孔径(上表面孔尺寸)为16.2微米，以及，膜厚度(峰处膜厚度)为9微米。在样品27中，上表面的平均孔径为11.1微米，以及，膜厚度为14微米。在样品28中，膜厚度为6微米。
[0181][细胞培养条件]
[0182]⑴细胞系
[0183]以下两种细胞系用于培养:
[0184]TOV2IG(人类卵巢癌细胞):CRL_1I73O(ATCC， American Type CultureCollect1n);以及
[0185]Caov3 (人卵巢癌细胞):HTB_75 (ATCC)
[0186](ii)培养基
[0187]通过以下方式制备用于T0V21G的培养基:M199培养基(Sigma，M4530)和M105培养基(Sigma，M6395)以1:1混合的培养基45毫升与5毫升FBS(Hyclone，SH30071.03)混合，并进一步加入500微升青霉素(Thermo Scientific, SV30010)。通过下述方式制备用于Caov3的培养基:向45毫升的DMEM培养基(Sigma，D5921)与5毫升FBS(Hyclone，SH30071.03)的混合培养基中，添加500微升青霉素(Thermo Scientific, SV30010)和I毫升L-谷氨酸溶液(Sigma, G7513)。
[0188](iii)细胞培养过程
[0189]在样品26 (聚氨酯多孔膜)、样品28 (聚氨酯光滑膜)、以及细胞培养板(HTB-75，Falcon)上分别接种T0V21G并进行培养。在样品27 (聚氨酯多孔膜)、样品28 (聚氨酯光滑膜)、以及细胞培养板(HTB-75，Falcon)上分别接种Caov3并进行培养。在样品26?样品28上接种细胞时，使用形成在基材上的聚氨酯膜，但不将其与基材分开。
[0190]在UV灭菌之后，本细胞培养过程首先将形成于基材上的聚氨酯膜在用于待接种细菌的培养基中预处理过夜。本过程随后接种T0V21G或Caov3。对于两种细胞，接种密度都是1.0X 14细胞/平方厘米。各自接种的细胞在37°C和5%二氧化碳的条件下培养48小时。
[0191][评估方法]
[0192]培养之后测量细胞的数量(细胞密度)，并且确定各聚氨酯膜的细胞生长率。更具体地，如下述方式相对于设定为100的培养之后细胞培养板上的细胞数量(细胞密度)来确定细胞生长率，作为培养之后聚氨酯膜上的细胞数量(细胞密度)。如下计算细胞密度:使用荧光显微镜(由OLYMPUS CORPORAT1N制造)以100倍放大倍率观察，在细胞培养板或各聚氨酯膜的中随机选择五个可见区域，测量这五个可见区域中的细胞密度的平均值，作为此细胞密度。较低的细胞生长率表示较高程度的细胞生长抑制。
[0193][评估结果]
[0194]图34是柱状图，其示出分别接种于样品26、样品28、以及培养板上的T0V21G的培养结果。图35是这样的柱状图，其示出了分别接种于样品27、样品28、以及培养板上的Caov3的培养结果。在图34和图35的柱状图中，还示出了标准偏差。
[0195]如图34和图35中所不,与培养板相比,两种癌细胞中的任意一种在聚氨酯光滑膜(样品28)上都有较高的细胞生长率。另一方面，与培养板相比，聚氨酯多孔膜(样品26和样品27)有较低的细胞生长率。这证明了癌细胞生长抑制的效果。
[0196]本发明并不局限于上述实施方案、示例或修改，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以做出多种的变化和修改。例如，为了解决上述的部分或全部问题，或者为了实现上述的部分或全部有益效果，与
【发明内容】
中所述各方面技术特征相对应的实施方案、示例或修改的技术特征可以被取代或进行适当组合。这些技术特征中的任一者都可以适当地省略，除非该技术特征在这里被描述为是必要的。
【权利要求】
1.一种用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法，所述聚氨酯多孔膜的制备方法包括: 第一步骤，在基材上形成未固化的聚氨酯材料层；以及 第二步骤，向形成于所述基材上的所述聚氨酯材料层中远离所述基材的暴露表面供给水蒸汽，以使所述聚氨酯材料固化，并且使所述聚氨酯材料层具有这样的多孔结构:其具有位于所述暴露表面上的多个凹凸体。
2.根据权利要求1所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法， 其中，在所述第二步骤中所提供的所述聚氨酯多孔膜的多孔结构包括多个朝向所述暴露表面开口的孔，以及 在所述聚氨酯多孔膜的膜厚度方向仅存在单一的孔。
3.根据权利要求2所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法， 其中，所述聚氨酯多孔膜具有0.1?100微米的厚度。
4.根据权利要求3所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法， 其中，通过对条件进行调整将所述聚氨酯多孔膜的厚度控制到0.1?100微米，所述条件选自:在所述第一步骤中形成为层的所述聚氨酯材料的组成、所述第二步骤中的反应温度、以及所述第二步骤中的反应时间。
5.根据权利要求2所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法， 其中，所述聚氨酯多孔膜在所述暴露表面上具有0.1?100微米的平均孔径。
6.根据权利要求5所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法， 其中，通过对条件进行调整将所述聚氨酯多孔膜的暴露表面上的平均孔径控制到0.1?100微米，所述条件选自:所述第二步骤中的反应温度、所述第二步骤中的反应时间、以及在所述第二步骤中供给至所述暴露表面的水蒸汽的量。
7.根据权利要求1至权利要求6中任一项所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法， 其中，在所述第二步骤中提供的所述多孔结构包括多个朝向所述暴露表面开口的孔，其中，所述多个孔中的至少一部分被制成贯通至所述聚氨酯材料层与所述基材相邻的表面的孔。
8.根据权利要求7所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法， 其中，通过对条件进行调整，将所述多个孔的至少一部分制成贯通至所述聚氨酯材料层与所述基材相邻的表面的孔，所述条件选自:在所述第一步骤中形成为层的所述聚氨酯材料的组成、所述第二步骤中的反应温度、以及所述第二步骤中的反应时间。
9.根据权利要求7所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法， 其中，所述第一步骤包括: 混合步骤，将至少包括多元醇和异氰酸酯的聚氨酯材料混合；以及 层形成步骤，将在所述混合步骤中混合的所述聚氨酯材料形成为层，以及 其中，通过对条件进行调整，将所述多个孔中的至少一部分制成贯通至所述聚氨酯材料层与所述基材相邻的表面的孔，所述条件选自:所述混合步骤与所述层形成步骤之间的时间，以及，所述混合步骤与所述层形成步骤之间的所述聚氨酯材料的环境温度。
10.根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法，所述聚氨酯多孔膜的制备方法进一步包括: 第三步骤，在所述第二步骤之后，停止水蒸汽的供给，进一步固化所述聚氨酯材料。
11.一种通过权利要求1至权利要求10中任一项所述的用于细胞培养和癌细胞生长抑制中至少一种应用的聚氨酯多孔膜的制备方法制备的聚氨酯多孔膜， 所述聚氨酯多孔膜具有第一表面、以及与所述第一表面相对的第二表面，以及，所述聚氨酯多孔膜具有包括多个孔的多孔结构，其中 所述孔各自朝向所述第一表面开口并且具有弯曲内壁面，所述弯曲内壁面朝向所述第二表面凸起。
12.根据权利要求11所述的聚氨酯多孔膜， 其中，所述多个孔的至少一部分形成为贯通至所述第二表面的孔。
【文档编号】C08G101/00GK104277236SQ201410323478
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2013年7月9日
【发明者】高城诚太郎, 水野恒, 中川博之, 萩山敏行, 吉村笃轨, 田中贤, 佐佐木彩乃, 高桥俊文, 太田刚 申请人:丰田合成株式会社, 国立大学法人山形大学