食品发酵用的根霉及应用的制作方法与工艺

本发明属于食品发酵和食品加工技术领域，具体涉及一种食品发酵用的根霉的及应用，本发明包括微生物发酵剂的菌种筛选，以及利用多菌株的制备复合发酵剂及其在大米制品发酵生产中的应用。

背景技术：
根霉(Rhizopus)在分类学上属于真核生物界的毛霉目(Mucorales)、毛霉科(Mucoraceae)中的根霉属(RhizopusEhrenberg)。根霉产酶种类繁多，其中以淀粉酶最为突出，是一种很重要的酿酒微生物。根霉在其生长代谢过程中能产生大量的淀粉酶，且具有很强的活性，能将淀粉胶彻底的分解成可发酵性糖。此外，根霉还能产一定的蛋白酶、酒化酶和脂肪酶等一系列霉系，并且在发酵过程产生柠檬酸、乳酸和琥珀酸等有机酸，在酿酒工业中具有重要的作用。随着现代生物技术的发展，人们对根霉的研究和利用进一步深入。根霉的研究不仅仅局限在酿酒行业，并且逐渐运用于各种保健品、乳酸、酶制剂。此外，人们还利用某些根霉对重金属的吸附能力而应用于环境治理。甜米酒是以糯米为主要原料经蒸煮、接种拌曲、微生物糖化发酵酿造而成的发酵米制品。糯米经蒸煮糊化，在酒曲中的霉菌等微生物及其酶等代谢产物的共同作用下，淀粉、蛋白质、脂肪等大分子物质被降解成葡萄糖等单糖、低聚糖、肽类、氨基酸、有机酸等小分子物质赋予甜米酒独特的营养和风味特征，有助于提高免疫力、促进新陈代谢，并有舒筋活血、延年益寿之功效，被人们当作一种滋补食品。传统甜米酒发酵剂一般是以粮食(以糯性大米为主)和中草药粉为原料，接入种子微生物生长繁殖后烘干成型，主要含有酵母菌、细菌、霉菌等三大类微生物。酒曲中各类微生物的种类繁多，最常见微生物有酿酒酵母、根霉、米曲霉、毛霉等，具有糖化、发酵、酯化和分解蛋白质等多种功能。在甜米酒的酿造过程，微生物将原料中的营养物质分解和代谢，形成糖、酸、醇类以及氨基酸、肽类等各种代谢产物，这些物质构成甜米酒的香味物质或其香味前体物质以及营养物质，决定了成品品质。民间手工作坊式甜米酒发酵剂主要由根霉、毛霉、酵母等多种微生物及米粉、辣蓼草等中草药共同组成，酿造的甜米酒风味醇厚、口感柔和。而现代直投式发酵剂是由已知的根霉和酵母菌或单一的纯根霉添加保护剂和填充料制成。民间酒曲由于其辅料、填充料以及地域的加工工艺不同而导致甜米酒风味存在差异，同时在发酵过程中由于菌种的活性和比例容易发生变化，其产品的质量稳定性较差。而直投式微生物发酵剂中菌种活性及比例较稳定，微生物浓度高，接种量小，可缩短发酵时间，并有效防止杂菌生长，从而保证产品质量的稳定。同时，直投式微生物发酵剂可针对产品的特性而开发成专用发酵剂。工业化生产的发酵剂质量较稳定，但发酵得到的甜米酒存在风味和口感单一，酒味感不足等缺陷。采用混合菌种发酵用于生产甜米酒可以在一定程度上可以改善工业化发酵剂制作甜米酒风味单薄的缺点。干燥是制备固体发酵剂中重要工序。常用的流化床干燥速度快，但易造成菌种的污染。真空冷冻干燥制备的菌粉活力高，但设备耗能大。而喷雾干燥、热风干燥虽效率高，但菌体的存活率较低。近年来兴起的微波干燥具有脱水迅速、受热较均匀、环保等特点。目前，甜米酒专用发酵剂生产技术已经逐渐成熟。例如公开号为CN102604840A的专利申请，公开了利用筛选出的根霉菌制备的米酒曲以及制备方法，用其酿造的甜米酒能保证较高水平的酒精度和糖度。公开号为CN102994396A的专利申请，公开了用纯曲和混合曲按一定比例混合制作米酒曲改善米酒的风味。孝感甜米酒具有清香袭人、甜润爽口、浓而不沾、稀而不流等独特的风味特征，是“中华老字号”绿色食品。其传统酒曲中微生物对孝感甜米酒独特的风味特征形成具有重要的作用。由于酒曲中不同来源的微生物的活性以及代谢产物不同，导致其酿制的甜米酒产品的风味和营养各具特点。某些菌株能产生特征代谢产物，其产品在一定程度上具有更高的营养价值。传统特色米酒发酵微生物不明确，制作的产品品质特征不清楚，且难以产业化；而纯菌种发酵剂导致产品风味单一等都是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种食品发酵用的根霉的的筛选以及应用，本发明包括微生物发酵剂的菌种筛选，利用根霉菌和筛选的酵母菌等多菌株、采用微波干燥技术的制备成适合甜米酒发酵生产用的复合发酵剂。实现本发明的方法是，从湖北省孝感地区传统民间甜酒曲中筛选分离得到三株发酵性能良好，这些菌株属于根霉菌和酵母菌，将上述三株菌株制成复合微生物发酵剂，能显著提高大米制品特别是甜米酒营养价值，适应工业化发酵工艺。本发明通过下列技术方案实现：申请人通过分离自湖北省孝感市传统民间甜酒曲，从中筛选得到三株适用于食品发酵特别是适用于大米制品，例如特别是甜米酒发酵生产的根霉菌株，这些菌株分别是：一株食品发酵用的米根霉，被命名为Rhizopusoryzaezsm-003，于2014年8月8日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：M2014374；一株食品发酵用的米根霉，被命名为Rhizopusoryzaezsm-004，于2014年8月8日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：M2014375；一株食品发酵用的根霉，被命名为Rhizopussp.zsm-005，于2014年8月8日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCCNO：M2014376。申请人以上述三株菌株为基础，开发了一种食品发酵用的微生物复合菌剂，该微生物复合发酵剂包含有保藏号为CCTCCNO:M2014374的米根霉Rhizopusoryzaezsm-003；保藏号为CCTCCNO：M2014375的米根霉Rhizopusoryzaezsm-004；保藏号为CCTCCNO：M2014376的根霉Rhizopussp.zsm-005以及保藏号为CCTCCNO：M207150的卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001，专利号是ZL2007100536112。经过应用试验，上述微生物复合发酵剂具有下列特点：1)该复合发酵剂中菌种的存活率较高，达到35％以上；2)该复合发酵剂生产的甜米酒汁中糖类组成较丰富，产品滋味浓郁、口感丰富，含有果糖以及麦芽糖、麦芽三糖等功能低聚糖，营养价值较高；3)该复合发酵剂生产的甜米酒产品中具有较高的呈味氨基酸，必须氨基酸比例较高。本发明菌株的分离、筛选和鉴定：本发明的技术流程见图1。本发明的米根霉Rhizopusoryzaezsm-003(CCTCCNO：M2014374)，Rhizopusoryzaezsm-004(CCTCCNO：M2014375)，Rhizopussp.zsm-005(CCTCCNO：M2014376)的分离、筛选和鉴定，参照周德庆主编，《微生物学实验手册》，上海科学技术出版社，1986年；胡瑞卿译，《常见与常用真菌》，科学出版社，1973年。分离菌株的菌学特征：本发明的米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-003(CCTCCNO:M2014374)，米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-004(CCTCCM2014375)和根霉(Rhizopussp.)zsm-005(CCTCCM2014376)菌株的菌落形态特征如下：米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-003，马铃薯培养基培养12h后，菌落直径约为1.5～2cm，菌落较疏松，气生菌丝较长，边缘菌丝较整齐。20h后铺满平板，菌落边缘呈发散状，出现白色和黑色孢子。米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-004，马铃薯培养基培养12h后，菌落直径约为0.8～1.2cm，平板底部有相对致密一层菌丝，边沿菌丝较整齐。20h后铺满平板，出现白色和黑色孢子。根霉(Rhizopussp.)zsm-005，马铃薯培养基培养12h后，菌落直径约为1～1.5cm，菌丝较致密，气生菌丝生长较慢。24h后铺满平板，出现白色和黑色孢子。本发明的米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-003(CCTCCNO:M2014374)，米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-004(CCTCCM2014375)和根霉(Rhizopussp.)zsm-005(CCTCCM2014376)菌株的微观形态特征如下(见图2)：米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-003以及米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-004，假根较发达，孢囊梗直立生长，孢子囊球形或近似球形，褐色(直径90～120um)。囊轴球形或近似球形，包囊孢子球形，有厚垣孢子。根霉(Rhizopussp.)zsm-005，有假根，孢囊梗直立生长，孢子囊近球形，灰褐色，直径50～200um，孢囊孢子球形或椭圆形，有厚垣孢子。对上述分离筛选的两株米根霉菌株和一株根霉菌株的18SrDNA序列进行了鉴定，具体步骤如下：以真菌通用引物(P1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)、P2(5’-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’))为测序引物获得的分离菌株Rhizopusoryzaezsm-003，Rhizopusoryzaezsm-004和Rhizopussp.zsm-005有效DNA序列，测得的18SrDNA有效序列在NCBI数据库中进行Blast检索。检索结果为菌株Rhizopusoryzaezsm-003，Rhizopusoryzaezsm-004和Rhizopussp.zsm-005的序列分别与米根霉(Rhizopusoryzac)、根霉(Rhizopussp.)序列相似，同源性高达99％，将与该序列相似度较大的序列载入MEGA4软件包中，进行多重序列比较分析，构建系统发育树，得到如图3所示的结果。本发明与现有甜米酒发酵菌株相比，具有以下优点：(1)该菌株生长速度较快，在发酵过程产生黑色孢子较少。(2)该菌株可以作为优质专用发酵剂：本发明的发酵剂酿制的甜米酒汁中游离氨基酸含量较高，含有麦芽糖等功能性低聚糖等，糖类组成丰富(实施例3)，营养价值更高，且产品质量稳定，风味良好。(3)本发明的复合发酵剂实现了混合菌种卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001和米根霉的复合发酵，相比单一的根霉发酵甜米酒，其香气更加浓郁，滋味更具有醇厚感。使用微波干燥工艺制备发酵剂，具有干燥速度快、易控制，耗能小，且菌株的存活率较高。附图说明序列表SEQIDNO：1是本发明分离的米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-003菌株的18SrDNA核苷酸序列。序列表SEQIDNO：2是本发明的米根霉(Rhizopusoryzae)zsm-004菌株的18SrDNA核苷酸序列。序列表SEQIDNO：3是本发明的根霉(Rhizopussp.)zsm-005的18SrDNA核苷酸序列。图1：是本发明的三个菌株zsm-003，zsm-004和zsm-005的分离、筛选以及鉴定的技术流程图。图2：是本发明的三个菌株zsm-003，zsm-004和zsm-005的微观形态图。图中标记说明：图2a是米根霉zsm-003菌株微观形态图(图2a中的a图是假根；图2a中的b图是孢子囊；图2a中的c图是孢囊孢子；图2a中的d图是厚垣孢子)。图2b是米根霉zsm-004菌株微观形态图(图2b中的a图是假根；图2b中的b图是厚垣孢子；图2b中的c图是分裂的孢子囊；图2b中的d图是完整孢子囊)。图2c是根霉zsm-005菌株微观形态图(图2c中的a图是假根；图2c中的b图是孢子囊；图2c中的c图是孢囊孢子；图2c中的d图是厚垣孢子)。图3：是本发明的三个菌株zsm-003，zsm-004和zsm-005的进化树图。其中：图3a是zsm-003系统发育树分析；图3b是zsm-004的系统发育树分析；图3c是zsm-005的系统发育树分析。图4：是本发明的固态复合发酵剂与单一发酵剂的技术流程图。具体实施方式实施例1：目标菌株的分离筛选与鉴定1、分离方法(稀释平板法)在无菌操作田间下，取10.0g来自湖北省孝感市的民间传统甜米酒曲，加入到90ml无菌水的三角瓶中(瓶中预先放一定数量的小玻璃珠)，振动摇晃30min，然后进行梯度稀释，选择稀释度为10-3、10-4、10-5的稀释液。无菌条件下取1ml稀释样液，转移至培养皿中，然后倒入PDA培养基，混匀后于30℃下培养。12h后开始挑取平面优势霉菌菌丝体，分别点种于查氏培养基中(李健容,蔡爱群.民间传统酒曲卡要微牛物的分离及鉴定[J].酿酒科技,2007,l：111-121.)，30℃培养48h。平板纯化四代后，转PDA斜面(为常用培养基)贮藏。2、鉴定方法2.1菌株的形态学特征参考周德庆主编《微生物学实验手册》，《常见与常用真菌》，科学出版社，1973年介绍的方法。2.2利用插片法观察霉菌微观形态：将无菌盖玻片以45。左右的角度并排插入PDA平板培养基中，插入深度为盖玻片的1/3左右。用无菌接种环挑取霉菌菌丝点种于盖玻片与培养基的交界线处，在30℃培养24h。用镊子将盖玻片小心取出，擦净盖玻片背面的培养基和菌丝，放在载片上(有菌丝的一面朝下)，置于显微镜下直接观察。2.3生物分子学鉴定：(1)根霉基因组的提取：将供试菌株活化后转接于50mL的PDA液体培养基中，30℃摇床(200r/min)培养过夜。离心收集菌丝体，采用CTAB法(许璐.分子标记技术在红曲菌菌种鉴别中的应用.2007.)提取基因组DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA提取质量。若质量合格，-20℃保存备用。(2)PCR扩增：采用真菌l8SrDNA通用引物：P1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')、P2(5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3')以根霉的DNA基因组为模板，PCR扩增根霉18SrDNA的部分基因序列(其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示)。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，30次循环；72℃延伸7min。取2uL的PCR物于0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。(9)将经0.8％琼脂糖凝胶电泳检验后的PCR扩增产物进行18SrDNA序列分析，序列测定由南京金斯瑞生物技术有限公司完成。将测序结果在NCBI数据库中采用Blast软件进行在线比对分析，并通过MEGA4软件构建进化树。确定本发明的菌株ZSM-003，ZSM-004为米根霉(Rhizopusoryzae)，ZSM-005为根霉(Rhizopussp.)。实施例2利用本发明的菌株生产微生物复合发酵剂1、实验材料试验用的菌株利用了申请人以前分离鉴定的卡斯特酒香酵母(Brettanomycescustersii)ZSM-001保藏号为CCTCCNO：M207150，专利号是ZL2007100536112)和米根霉Rhizopusoryzaezsm-003(CCTCCNO：M2014374)，Rhizopusoryzaezsm-004(CCTCCNO：M2014375)，Rhizopussp.zsm-005(CCTCCNO：M2014376)。2、固态单一菌种发酵剂与固态微生物复合菌剂的制作1)试管菌种的培养：将卡斯特酒香酵母ZSM-001和米根霉Rhizopusoryzaezsm-003(CCTCCNO：M2014374)，Rhizopusoryzaezsm-004(CCTCCNO：M2014375)，Rhizopussp.zsm-005(CCTCCNO：M2014376)接种于斜面PDA培养基，在30℃条件下培养2～3d，使其活化即为试管斜面菌种；2)三角瓶扩大培养：将步骤1)中的菌株接种于灭菌后的三角瓶马铃薯液体培养基中(1L蒸馏水中加入200g去皮的新鲜土豆，沸水浴30min，纱布过滤，补水至1L)，于30℃条件下培养24h，使其菌体活菌数达到106～107cfu/ml，备用。3)菌液混合：将步骤2)中的卡斯特酒香酵母ZSM-001菌液与Rhizopusoryzaezsm-003(CCTCCNO：,1)中,1)中M2014374)，Rhizopusoryzaezsm-004(CCTCCNO：M2014375)，Rhizopussp.zsm-005(CCTCCNO：M2014376))按体积比为2：3：3：2比例(ml)混合(或1)中单一的经活化的根霉菌悬液)加入7.5～10％的海藻糖和3～5％甘油作为保护剂，得到混合菌液；4)干燥：将步骤3)中的混合菌液按质量比为8.5％～10％的比例添加填充料(例如干米粉)，混匀，WL2S-1型微波炉(南京三乐高新技术工程公司)，微波剂量为1w/g，干燥1.5min，间歇0.5min，反复处理2～5次，直至含水量约为6％，即得到固态单一或复合发酵剂。5)用聚乙烯包装袋密封包装所述的固态单一菌剂(约为107～108cfu/g)或复合发酵剂(含菌量约为107～108cfu/g)，置于4℃冰箱贮藏备用。对制作的固体发酵剂进行不同干燥方法的菌种存活率影响的检测，结果表明采用微波干燥方法干制固态单一菌剂或微生物复合发酵剂中菌种的存活率(38.11±0.88％)显著高于传统的热风干燥(25.67±1.01％)，且微波干燥的时间较短能够较大幅度地提高生产效率。注：细胞活菌数采用平板计数的方法获得，计算董事为：损失率(％)＝上清液活菌数/初始活菌数×100％；存活率(％)＝沉降细胞活菌数/(初始活菌数-上清液活菌数)×100％；a,b字母表示列数据间存在显著性差异(p<0.05)。实施例3本发明的固体发酵剂在甜米酒发酵生产中的应用单一固体发酵菌剂和复合固体发酵剂制作甜米酒的感官评分表1不同单一菌株制作的甜米酒感官评分注：zsm-003表示用zsm-003制作的单一固体发酵剂；zsm-004表示用zsm-004制作的单一固体发酵剂；zsm-005表示用zsm-005制作的单一固体发酵剂；FP表示用三株菌复配制作的复合固体发酵剂。定量描述性感官评价法，选取10点制，0-9(0＝没味道，9＝味道最强)。由表1可知，单一固体发酵菌剂制作的甜米酒中，应用zsm-003菌株的产品酸味较突出，zsm-005菌株的产品酸甜感较柔和，zsm-004菌株的产品综合感官评分较好，而利用zsm-003菌株、zsm-005和zsm-004三菌株制备的复合发酵剂的感官评分最高。见表1.1、不同发酵菌剂制作的甜米酒汁的感官评价感官评价方法参考:朱海泉.混合甜酒曲开发与甜酒生产技术的研究[D].长沙:中南林业科技大学,2012报道的方法。结果如表2.表2不同发酵剂制作的甜米酒感官评分(n＝2,)注：AQ为市售纯根霉酒曲，SM为市售传统酒曲，FP为本发明配制的固态复合微生物发酵剂。同一列数据小写英文字母不同表示数据存在显著差异(p<0.05)。由表2可知，本发明的固体复合发酵剂制作的甜米酒在色泽和感官总评分上，明显优于用纯根霉和传统酒曲制作的甜米酒。2、甜米酒汁中游离氨基酸的测定方法采用中华人民共和国国家标准，标准号GB/T5009.124-2003的标准方法测定不同发酵菌剂制作的甜米酒汁中游离氨基酸组成测定结果见表3。表3甜米酒汁中游离氨基酸组成(n＝2,)注：表中AQ为市售纯根霉酒曲，SM为市售传统酒曲，FP为本发明配制的固态复和微生物发酵剂(即本发明的甜酒曲)；1、2、3分别表示鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸；*表示必需氨基酸；同一行英文字母不同表示数据存在显著差异(p<0.05)。由表3可知，在相同条件下不同酒曲(或发酵剂)制作的甜米酒，其氨基酸含量有一定的差别。本发明生产的固态复和微生物发酵剂制作的甜米酒中呈味氨基酸总含量最多(98.56mg/100ml)，其滋味浓郁。用本发明的固态复合微生物发酵剂生产的甜米酒中游离氨基酸的含量和必需氨基酸的含量均大于其他两种，表明营养价值较好。3、固体复合发酵剂与市购纯根霉发酵剂以及市购传统酒曲制作的甜米酒酒汁中糖类组成比较。甜米酒汁中单糖、低聚糖的测定方法参照中华人民共和国国家标准，标准号GB/T22221-2008方法检测。甜米酒汁中葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽三糖含量检测结果见表4。表4甜米酒汁中单糖、低聚糖组成(n＝2,)注：AQ为市售纯根霉酒曲，SM为市售传统酒曲，FP为本发明制备的固态复合微生物发酵剂(或称为复配甜米酒曲)。小写字母不同表示同列之间数据存在显著差异。(p<0.05)。由表4可知，与市售纯根霉以及市售传统酒曲制作的甜米酒相比，本发明的固态复合发酵剂发酵产生的单糖和低聚糖的种类最多，含有葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽三糖，其滋味更丰满，口感醇厚。仅在本发明的固态复合发酵剂制作的甜米酒汁中检测出麦芽三糖等具有一定的保健功能的低聚糖，说明本发明的固态复合发酵剂制作的甜米酒具有更好的营养价值。实施例4本发明的固体复合发酵剂在米发糕中的应用1)原料米：早籼米1Kg(市售)，按常规方法清洗；2)浸泡：加水2000mL，于30℃浸泡20～24h；3)米浆的制备：用自来水清洗数遍后加1200ml水磨浆；4)接种：按质量比为3％，加入本发明制备的复合微生物发酵剂，使其与米浆混合均匀；5)发酵：将接种后的米浆放入35℃培养箱发酵5h；6)调味：将发酵后步骤5)的米浆加入200g蔗糖调味，混匀；7)蒸煮：将步骤6)的米浆放入蒸锅中，上蒸汽后15min取出，即得到本发明所述的米发糕。表5本发明的复合发酵剂与单一的酵母菌种发酵剂制作的米发糕的感官比较(各项满分为10分，具体方法参考文献刘小翠.米发糕发酵剂及复配粉的研发[D].湖北：华中农业大学，2008)注：Y代表市售酵母菌发酵剂，FP表本发明的复合发酵剂。小写字母不同表示同列之间数据存在显著差异(p<0.05)。由表5可知，与单一酵母菌发酵剂制作的米发糕相比，本发明的固体复合发酵剂在实验条件范围内，制作的米发糕在气味，滋味和综合评分上都明显优于单一菌种发酵剂制作的米发糕表6本发明的复合发酵剂与单一的酵母菌种发酵剂制作的米发糕的质构特征注：Y代表市售酵母菌发酵剂，FP代表本发明的复合发酵剂。小写字母不同表示同列之间数据存在显著差异(p<0.05)。参考文献，刘小翠,胡坚,赵思明等.米发糕的质构特征及数学模型[J].中国粮油学报,2009,24(3):7-10.由表6可知，市售酵母发酵剂制作的米发糕比本发明的复合发酵剂制作的米发糕硬度大，利用本发明制备的复合发酵剂制作的米发糕具有较好的咀嚼性和回弹性。