一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性lamp引物组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP 引物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 大豆拟茎点种腐病菌（PhomopsislongicollaHo化S)侵染大豆，引起大豆根腐W 及苗期病害，并且可W导致大豆种子品质降低W，。大豆拟茎点种腐病菌最早在1976年在 美国发现，此后，加拿大、阿根廷、韩国、意大利、南斯拉夫都有报道过据统计，在1994 年，全世界因为该病害导致大豆产量损失高达18. 6万吨w'5^。因其近年来在国外发生普遍、 经济影响大、传入风险高且在我国尚未有发生的报道，被有关专家列为大豆上包括大豆疫 霉在内的7种危险性真菌病害之一 ?。为了阻止大豆拟茎点种腐病菌传播范围的不断扩 大，使大豆拟茎点种腐病菌病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。
[0003] 环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，是有日本 的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增方法[7]，其特点是针 对祀基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA酶度St DNA polymerase)的作用 下，60~65C恒温扩增，15~60min即可观察结果，效率可达IO9~1〇1°个数量级，具有操 作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核酸H磯酸基质（dNTPs)中析 出的焦磯酸根离子与反应溶液中的镇离子反应，产生大量焦磯酸镇沉淀，呈现白色。因此， 可W把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要 繁琐的电泳和紫外观察。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，反应产物可通过是否 形成白色沉淀（浑浊）或SYBR GREEN I染色后的颜色变化来判断是否反应。随着技术的 不断完善和发展，会在食品检测临床疾病诊断等领域有着广泛的应用前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP引物组 合物。
[0005] 本发明的另一目的是提供该特异性LAMP引物组合物的应用。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0007] -种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP引物组合物，由W下引物组成： 正向内引物FIP如SEQ ID NO. 2所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO. 3所示，正向外引物F3 如沈Q ID NO. 4所示，反向外引物B3如沈Q ID NO. 5所示，正向环引物LF如沈Q ID NO. 6 所示。
[0008] 所述的特异性LAMP引物组合物在制备检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌的试剂中 的应用。
[0009] -种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒，包含所述的特异性的 LAMP引物组合物。
[0010] 所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒，包含；2.5y L 10Xl'hermoI/)lBuffer，8mmol.LiMgS〇4，1.2mmol.LidNTPs，内引 物 FIP 和 BIP 各 1.6 Umol . 夕巧 I物 F3 和B3各0.4 Umol . 环弓 I物LF0. Symol . 0. Smol . Li 甜 菜碱，0. 1% Trion-XJOmmol .LiTris-HCUpH 8. 8) ,IOmmol .L Ikci,IOmmol .LI(NHa)SO" 8U . U L IBst DNA聚合酶及超纯水组成的检测溶液W及SYBR GREEN I染料。
[0011] 一种检测大豆拟茎点种腐病菌的方法，提取待检微生物的DNA，W提取的DNA为 模板，利用所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP反应；扩增产物加入SYBR GREEN I 染料，在常光下检测结果，如果反应产物在常光下变显黄色，则表示存在大豆拟茎点种腐病 菌，在常光下显澄色则表示不含该病菌。
[0012] 所述的检测大豆拟茎点种腐病菌的方法优选提取待检微生物的DNA，取3 U IDNA 溶液，加入20. 5 U 1所述的检测溶液和1. 5 U 1灭菌去离子水进行LAMP反应，LAMP反应程 序为；64°C 60min〇
[0013] 有益效果：
[0014] 本发明在分析大豆拟茎点种腐病菌的检测祀标序列Tefl-a和其他近似种病菌 在序列上的差异的基础上，对多个潜在位点设计并筛选了 5条特异性的LAMP引物，目前用 于设计LAMP引物的软件为Eiken化emical公司开发的PrimerExplorer,虽然利用软件可 W设计出若干条符合设计参数的引物，但是此软件还是存在W下的缺陷；（1)缺少引物特 异性检测的步骤，尽管LAMP引物是由多条引物组成，特异性相对于PCR来说会有很大的提 高，但是缺少了特异性的检测，会出现误判，导致实验结果错误；（2)即使特异性符合要求， 在实际的实验验证中也会出现某些引物产生假阳性的现象，产生送些假阳性的原因可能是 引物虽然不能形成哑铃状反应前体，但是还是可W线性的扩增。为了克服软件设计的缺陷， 针对符合特异性的引物需要进行人工筛选，送需要很丰富的实验经验和理论基础，送也是 本专利最核必的部分，引物所在祀标的位置图见图1。在此基础上建立了检测大豆拟茎点种 腐病菌的LAMP反应体系。本发明的检测体系在LAMP扩增条件下，能快速、高效、高特异、高 灵敏地检测到大豆拟茎点种腐病菌，具有优异的种间特异性、种内通用性W及灵敏度，能很 好满足目前对大豆拟茎点种腐病菌的现场检测的迫切需要，用于田间检疫、进出口检疫等 的现场检测，易于大范围推广应用。
【附图说明】
[0015] 图ILAMP特异性引物祀标位点，选择该位点的原因是后期人工筛选时引物的特异 性强，不会产生假阳性，灵敏度高。
[0016] 图2实施例2大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物特异性试验常光光照射图
[0017] 其中，1号、2号为大豆拟茎点种腐病菌不同菌株，3号为大豆南方茎溃瘍病菌，4号 为大豆北方茎溃瘍病菌，5号为平头炭痕菌，6号为稻癌菌，7号为链格抱菌，8号为球黑抱 菌，9号为大豆疫霉菌，10号为菜豆壳球抱菌，11号为米曲霉菌，12号为菊池尾抱菌，13号为 油瓶霉菌，14号为了香疫霉菌，15号为3麻疫霉，16号为阴性对照。
[0018] 图3实施例2大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物特异性试验电泳图
[0019] 其中，M为MLSOOOMarker, 1号、2号为大豆拟茎点种腐病菌不同菌株，3号为大豆 南方茎溃瘍病菌，4号为大豆北方茎溃瘍病菌，5号为平头炭痕菌，6号为稻癌菌，7号为链格 抱菌，8号为球黑抱菌，9号为大豆疫霉菌，10号为菜豆壳球抱菌，11号为米曲霉菌，12号为 菊池尾抱菌，13号为油瓶霉菌，14号为了香疫霉菌，15号为3麻疫霉，16号为阴性对照。
[0020] 图4实施例3大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物灵敏度试验常光照射图 [002。 LAMP扩增不同浓度大豆拟茎点种腐病菌基因组DNA ;从左到右分别为25U L的 反应体系中分别含有lOOng、lOng、Ing、lOOpg、lOpg、Ipg、lOOfg、IOfg大豆拟茎点种腐病菌 DM的LAMP扩增结果。LAMP扩增反应能特异性地识别大豆拟茎点种腐病菌，图片表示灵敏 度能够达到Ipg/U L。
[0022] 图5感病大豆植株LAMP检测试验常光照射图
[0023] 其中1为大豆拟茎点种腐病菌标准菌株基因组，2-7为接种大豆拟茎点种腐病菌 菌株6天后的大豆植株基因组，8为接种空白PDA培养基6天后的大豆植株基因组，9为健 康大豆植株基因组，10为阴性对照。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[0025] -种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒，包含；2. 5 U L 10Xl'hermoI/)lBuffer，8mmol.LiMgS〇4，1.2mmol.LidNTPs，内引 物 FIP 和 BIP 各 1.6 U mol .Li,夕巧 I物 F3 和B3 各0.4 U mol .Li,环弓 I物LF 0.8 U mol .L 1,0. Smol .Li 甜 菜碱，8U - ULiBst DNA聚合酶，加入超纯水制备成检测溶液。各组分的浓度表示其在检测 溶液中的终浓度。
[0026] 实施例2大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物特异性试验
[0027] 为了验证LAMP方法的特异性，选择大豆拟茎点种腐病菌标准菌株（繳策 46562?)与大豆拟茎点种腐病菌相近种的大豆南方茎溃瘍病菌、大豆北方茎溃瘍病菌，与大 豆拟茎点种腐病菌不同属的菌（平头炭痕菌；稻癌菌；链格抱菌；球黑抱菌；大豆疫霉菌； 菜豆壳球抱菌；米曲霉菌；菊池尾抱菌；油瓶霉菌；了香疫霉菌；3麻疫霉）的DNA作为模 板，取3 U IDNA溶液，加入20. 5 U 1实施例1所述的检测溶液和1. 5 U 1灭菌去离子水进行 LAMP反应，反应程序为；64°C 60min ;扩增产物加入SYBR GREEN I染料，在常光下检测，结 果如图2所示。结果显示特异性LAMP引物组合物能特异性地识别大豆拟茎点种腐病菌，含 有大豆拟茎点种腐病菌的样品（1号和2号管）在常光下变成黄绿色，而其他种（3~15号 管）在常光下为澄色，阴性对照（16号）在常光下也为澄色，反应产物经过2 %琼脂糖凝胶 电泳，观察扩增的条带，结果见图3,只有1号和2号管出现典型的梯形条带，表明进1号和 2号管存在大豆拟茎点种腐病菌，结果表明W SYBR green I为染料的显色反应可作为检测 阳性和阴性的判别标准，并可缩短检测所需的时间。
[002引实施例3大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物灵敏度试验
[0029] 为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的标准大豆拟茎点种腐病菌菌株DNA用 分光光度计测定浓度（1 U g/ U 1)后用DEPC水进行10倍比稀释，-7(TC保存作为模板。分 别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液3 U 1作为模板，加入20. 5 U 1实施例1所述的检测 溶液和1. 5 U 1灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为；64°C 60min ;扩增产物加入SYBR GREEN I染料，在常光下检测，结果如图4所示，1~6管在常光下变成黄绿色，表明本发明 方法的灵敏度为ipg/y L。
[0030] 实施例4感病大豆植株LAMP检测试验
[0031] 用化OH碱裂解法提取6株接种大豆拟茎点种腐病菌6天后的大豆植株的DNA，将 其作为模板用于LAMP扩增，将大豆拟茎点种腐病菌标准菌株DNA作为阳性对照，健康植株 DNA和灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。取3ULDNA溶液，加入20. 5 U 1实施例1所述的 检测溶液和1. 5 U 1灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为；64°C 60min。扩增产物加入 SYBRGREEN I染料，在常光下检测，结果如图5所示，显示本方法能够从接种大豆拟茎点种 腐病菌的大豆植株（2~7号管）在常光下变成黄绿色，能够特异性地检测出大豆拟茎点种 腐病菌，效果和直接检测大豆南方茎溃瘍病菌DNA (1号管）没有差别，而接种空白PDA培养 基6天后的大豆植株（8号管）、健康植株巧号管）和阴性对照灭菌水（10号管）则在常光 下变成澄色，可见本方法可W用于田间检测（图5)。
[00础 参考文献
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【主权项】
1. 一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP引物组合物，其特征在于有以下 引物组成：正向内引物FIP如SEQ ID NO. 2所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO. 3所示，正 向外引物F3如SEQ ID NO. 4所示，反向外引物B3如SEQ ID NO. 5所示，正向环引物LF如 SEQ ID NO. 6 所示。2. 权利要求1所述的特异性LAMP弓|物组合物在制备检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌 的试剂中的应用。3. -种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1 所述的特异性LAMP引物组合物。4. 根据权利要求3所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在 于所述的试剂盒包含：2.5yL 10XThermoPolBuffer，8mmol ?I^MgSOpUmmol .LMNTPs， 内引物FIP和BIP各L 6 μ mol · L /外引物F3和B3各0· 4 μ mol · L /环引物LF 0· 8 μ mol · L / 0· 8mol · L 1甜菜碱，8U · μ L Ast DNA聚合酶，及灭菌去离子水组成的检测 溶液以及SYBR GREEN I染料。5. -种检测大豆拟茎点种腐病菌的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，以提取 的DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应；扩增 产物加入SYBR GREEN I染料，在常光下检测结果，如果反应产物在常光下变成黄绿色，则 表示存在大豆拟茎点种腐病菌，在常光下显橙色则表示不含该病菌。6. 根据权利要求5所述的检测大豆拟茎点种腐病菌的方法，其特征在于提取待检微生 物的DNA，取3 μ 1 DNA溶液，加入20. 5 μ 1权利要求4所述的检测溶液和1. 5 μ 1灭菌去离 子水进行LAMP反应，反应程序为：64°C 60min。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP引物组合物及其应用。大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef-α，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该靶标序列特异性的LAMP引物组合物，正向内引物FIP如SEQ ID NO.2所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.3所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.4所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.5所示，正向环引物LF如SEQ ID NO.6所示。本发明的检测体系在LAMP扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆拟茎点种腐病菌，用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/645, C12Q1/04
【公开号】CN105713960
【申请号】CN201410720592
【发明人】郑小波, 沈浩, 王源超, 张海峰
【申请人】南京农业大学