一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性lamp引物组合物及其应用

文档序号:11023363
一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性lamp引物组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域,涉及一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP 引物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 大豆拟茎点种腐病菌(PhomopsislongicollaHo化S)侵染大豆,引起大豆根腐W 及苗期病害,并且可W导致大豆种子品质降低W,。大豆拟茎点种腐病菌最早在1976年在 美国发现,此后,加拿大、阿根廷、韩国、意大利、南斯拉夫都有报道过据统计,在1994 年,全世界因为该病害导致大豆产量损失高达18. 6万吨w'5^。因其近年来在国外发生普遍、 经济影响大、传入风险高且在我国尚未有发生的报道,被有关专家列为大豆上包括大豆疫 霉在内的7种危险性真菌病害之一 ?。为了阻止大豆拟茎点种腐病菌传播范围的不断扩 大,使大豆拟茎点种腐病菌病得到控制,需要对其进行快速、准确地检测。
[0003] 环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),是有日本 的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增方法[7],其特点是针 对祀基因的6个区域设计4条特异性引物,在链置换DNA酶度St DNA polymerase)的作用 下,60~65C恒温扩增,15~60min即可观察结果,效率可达IO9~1〇1°个数量级,具有操 作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时,从脱氧核酸H磯酸基质(dNTPs)中析 出的焦磯酸根离子与反应溶液中的镇离子反应,产生大量焦磯酸镇沉淀,呈现白色。因此, 可W把浑浊度作为反应的指标,只用肉眼观察白色浑浊沉淀,就能鉴定扩增与否,而不需要 繁琐的电泳和紫外观察。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂,反应产物可通过是否 形成白色沉淀(浑浊)或SYBR GREEN I染色后的颜色变化来判断是否反应。随着技术的 不断完善和发展,会在食品检测临床疾病诊断等领域有着广泛的应用前景。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP引物组 合物。
[0005] 本发明的另一目的是提供该特异性LAMP引物组合物的应用。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0007] -种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP引物组合物,由W下引物组成: 正向内引物FIP如SEQ ID NO. 2所示,反向内引物BIP如SEQ ID NO. 3所示,正向外引物F3 如沈Q ID NO. 4所示,反向外引物B3如沈Q ID NO. 5所示,正向环引物LF如沈Q ID NO. 6 所示。
[0008] 所述的特异性LAMP引物组合物在制备检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌的试剂中 的应用。
[0009] -种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒,包含所述的特异性的 LAMP引物组合物。
[0010] 所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒,包含;2.5y L 10Xl'hermoI/)lBuffer,8mmol.LiMgS〇4,1.2mmol.LidNTPs,内引 物 FIP 和 BIP 各 1.6 Umol . 夕巧 I物 F3 和B3各0.4 Umol . 环弓 I物LF0. Symol . 0. Smol . Li 甜 菜碱,0. 1% Trion-XJOmmol .LiTris-HCUpH 8. 8) ,IOmmol .L Ikci,IOmmol .LI(NHa)SO" 8U . U L IBst DNA聚合酶及超纯水组成的检测溶液W及SYBR GREEN I染料。
[0011] 一种检测大豆拟茎点种腐病菌的方法,提取待检微生物的DNA,W提取的DNA为 模板,利用所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP反应;扩增产物加入SYBR GREEN I 染料,在常光下检测结果,如果反应产物在常光下变显黄色,则表示存在大豆拟茎点种腐病 菌,在常光下显澄色则表示不含该病菌。
[0012] 所述的检测大豆拟茎点种腐病菌的方法优选提取待检微生物的DNA,取3 U IDNA 溶液,加入20. 5 U 1所述的检测溶液和1. 5 U 1灭菌去离子水进行LAMP反应,LAMP反应程 序为;64°C 60min〇
[0013] 有益效果:
[0014] 本发明在分析大豆拟茎点种腐病菌的检测祀标序列Tefl-a和其他近似种病菌 在序列上的差异的基础上,对多个潜在位点设计并筛选了 5条特异性的LAMP引物,目前用 于设计LAMP引物的软件为Eiken化emical公司开发的PrimerExplorer,虽然利用软件可 W设计出若干条符合设计参数的引物,但是此软件还是存在W下的缺陷;(1)缺少引物特 异性检测的步骤,尽管LAMP引物是由多条引物组成,特异性相对于PCR来说会有很大的提 高,但是缺少了特异性的检测,会出现误判,导致实验结果错误;(2)即使特异性符合要求, 在实际的实验验证中也会出现某些引物产生假阳性的现象,产生送些假阳性的原因可能是 引物虽然不能形成哑铃状反应前体,但是还是可W线性的扩增。为了克服软件设计的缺陷, 针对符合特异性的引物需要进行人工筛选,送需要很丰富的实验经验和理论基础,送也是 本专利最核必的部分,引物所在祀标的位置图见图1。在此基础上建立了检测大豆拟茎点种 腐病菌的LAMP反应体系。本发明的检测体系在LAMP扩增条件下,能快速、高效、高特异、高 灵敏地检测到大豆拟茎点种腐病菌,具有优异的种间特异性、种内通用性W及灵敏度,能很 好满足目前对大豆拟茎点种腐病菌的现场检测的迫切需要,用于田间检疫、进出口检疫等 的现场检测,易于大范围推广应用。
【附图说明】
[0015] 图ILAMP特异性引物祀标位点,选择该位点的原因是后期人工筛选时引物的特异 性强,不会产生假阳性,灵敏度高。
[0016] 图2实施例2大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物特异性试验常光光照射图
[0017] 其中,1号、2号为大豆拟茎点种腐病菌不同菌株,3号为大豆南方茎溃瘍病菌,4号 为大豆北方茎溃瘍病菌,5号为平头炭痕菌,6号为稻癌菌,7号为链格抱菌,8号为球黑抱 菌,9号为大豆疫霉菌,10号为菜豆壳球抱菌,11号为米曲霉菌,12号为菊池尾抱菌,13号为 油瓶霉菌,14号为了香疫霉菌,15号为3麻疫霉,16号为阴性对照。
[0018] 图3实施例2大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物特异性试验电泳图
[0019] 其中,M为MLSOOOMarker, 1号、2号为大豆拟茎点种腐病菌不同菌株,3号为大豆 南方茎溃瘍病菌,4号为大豆北方茎溃瘍病菌,5号为平头炭痕菌,6号为稻癌菌,7号为链格 抱菌,8号为球黑抱菌,9号为大豆疫霉菌,10号为菜豆壳球抱菌,11号为米曲霉菌,12号为 菊池尾抱菌,13号为油瓶霉菌,14号为了香疫霉菌,15号为3麻疫霉,16号为阴性对照。
[0020] 图4实施例3大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物灵敏度试验常光照射图 [002。 LAMP扩增不同浓度大豆拟茎点种腐病菌基因组DNA ;从左到右分别为25U L的 反应体系中分别含有lOOng、lOng、Ing、lOOpg、lOpg、Ipg、lOOfg、IOfg大豆拟茎点种腐病菌 DM的LAMP扩增结果。LAMP扩增反应能特异性地识别大豆拟茎点种腐病菌,图片表示灵敏 度能够达到Ipg/U L。
[0022] 图5感病大豆植株LAMP检测试验常光照射图
[0023] 其中1为大豆拟茎点种腐病菌标准菌株基因组,2-7为接种大豆拟茎点种腐病菌 菌株6天后的大豆植株基因组,8为接种空白PDA培养基6天后的大豆植株基因组,9为健 康大豆植株基因组,10为阴性对照。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[0025] -种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒,包含;2. 5 U L 10Xl'hermoI/)lBuffer,8mmol.LiMgS〇4,1.2mmol.LidNTPs,内引 物 FIP 和 BIP 各 1.6 U mol .Li,夕巧 I物 F3 和B3 各0.4 U mol .Li,环弓 I物LF 0.8 U mol .L 1,0. Smol .Li 甜 菜碱,8U - ULiBst DNA聚合酶,加入超纯水制备成检测溶液。各组分的浓度表示其在检测 溶液中的终浓度。
[0026] 实施例2大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物特异性试验
[0027] 为了验证LAMP方法的特异性,选择大豆拟茎点种腐病菌标准菌株(繳策 46562?)与大豆拟茎点种腐病菌相近种的大豆南方茎溃瘍病菌、大豆北方茎溃瘍病菌,与大 豆拟茎点种腐病菌不同属的菌(平头炭痕菌;稻癌菌;链格抱菌;球黑抱菌;大豆疫霉菌; 菜豆壳球抱菌;米曲霉菌;菊池尾抱菌;油瓶霉菌;了香疫霉菌;3麻疫霉)的DNA作为模 板,取3 U IDNA溶液,加入20. 5 U 1实施例1所述的检测溶液和1. 5 U 1灭菌去离子水进行 LAMP反应,反应程序为;64°C 60min ;扩增产物加入SYBR GREEN I染料,在常光下检测,结 果如图2所示。结果显示特异性LAMP引物组合物能特异性地识别大豆拟茎点种腐病菌,含 有大豆拟茎点种腐病菌的样品(1号和2号管)在常光下变成黄绿色,而其他种(3~15号 管)在常光下为澄色,阴性对照(16号)在常光下也为澄色,反应产物经过2 %琼脂糖凝胶 电泳,观察扩增的条带,结果见图3,只有1号和2号管出现典型的梯形条带,表明进1号和 2号管存在大豆拟茎点种腐病菌,结果表明W SYBR green I为染料的显色反应可作为检测 阳性和阴性的判别标准,并可缩短检测所需的时间。
[002引实施例3大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物灵敏度试验
[0029] 为了确定LAMP检测方法的灵敏度,将提取的标准大豆拟茎点种腐病菌菌株DNA用 分光光度计测定浓度(1 U g/ U 1)后用DEPC水进行10倍比稀释,-7(TC保存作为模板。分 别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液3 U 1作为模板,加入20. 5 U 1实施例1所述的检测 溶液和1. 5 U 1灭菌去离子水进行LAMP反应,反应程序为;64°C 60min ;扩增产物加入SYBR GREEN I染料,在常光下检测,结果如图4所示,1~6管在常光下变成黄绿色,表明本发明 方法的灵敏度为ipg/y L。
[0030] 实施例4感病大豆植株LAMP检测试验
[0031] 用化OH碱裂解法提取6株接种大豆拟茎点种腐病菌6天后的大豆植株的DNA,将 其作为模板用于LAMP扩增,将大豆拟茎点种腐病菌标准菌株DNA作为阳性对照,健康植株 DNA和灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。取3ULDNA溶液,加入20. 5 U 1实施例1所述的 检测溶液和1. 5 U 1灭菌去离子水进行LAMP反应,反应程序为;64°C 60min。扩增产物加入 SYBRGREEN I染料,在常光下检测,结果如图5所示,显示本方法能够从接种大豆拟茎点种 腐病菌的大豆植株(2~7号管)在常光下变成黄绿色,能够特异性地检测出大豆拟茎点种 腐病菌,效果和直接检测大豆南方茎溃瘍病菌DNA (1号管)没有差别,而接种空白PDA培养 基6天后的大豆植株(8号管)、健康植株巧号管)和阴性对照灭菌水(10号管)则在常光 下变成澄色,可见本方法可W用于田间检测(图5)。
[00础 参考文献
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【主权项】
1. 一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP引物组合物,其特征在于有以下 引物组成:正向内引物FIP如SEQ ID NO. 2所示,反向内引物BIP如SEQ ID NO. 3所示,正 向外引物F3如SEQ ID NO. 4所示,反向外引物B3如SEQ ID NO. 5所示,正向环引物LF如 SEQ ID NO. 6 所示。2. 权利要求1所述的特异性LAMP弓|物组合物在制备检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌 的试剂中的应用。3. -种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒,其特征在于包含权利要求1 所述的特异性LAMP引物组合物。4. 根据权利要求3所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测试剂盒,其特征在 于所述的试剂盒包含:2.5yL 10XThermoPolBuffer,8mmol ?I^MgSOpUmmol .LMNTPs, 内引物FIP和BIP各L 6 μ mol · L /外引物F3和B3各0· 4 μ mol · L /环引物LF 0· 8 μ mol · L / 0· 8mol · L 1甜菜碱,8U · μ L Ast DNA聚合酶,及灭菌去离子水组成的检测 溶液以及SYBR GREEN I染料。5. -种检测大豆拟茎点种腐病菌的方法,其特征在于提取待检微生物的DNA,以提取 的DNA为模板,利用权利要求1所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应;扩增 产物加入SYBR GREEN I染料,在常光下检测结果,如果反应产物在常光下变成黄绿色,则 表示存在大豆拟茎点种腐病菌,在常光下显橙色则表示不含该病菌。6. 根据权利要求5所述的检测大豆拟茎点种腐病菌的方法,其特征在于提取待检微生 物的DNA,取3 μ 1 DNA溶液,加入20. 5 μ 1权利要求4所述的检测溶液和1. 5 μ 1灭菌去离 子水进行LAMP反应,反应程序为:64°C 60min。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域,公开了一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的特异性LAMP引物组合物及其应用。大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef-α,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,该靶标序列特异性的LAMP引物组合物,正向内引物FIP如SEQ ID NO.2所示,反向内引物BIP如SEQ ID NO.3所示,正向外引物F3如SEQ ID NO.4所示,反向外引物B3如SEQ ID NO.5所示,正向环引物LF如SEQ ID NO.6所示。本发明的检测体系在LAMP扩增条件下,能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆拟茎点种腐病菌,用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测,易于大范围推广应用。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/645, C12Q1/04
【公开号】CN105713960
【申请号】CN201410720592
【发明人】郑小波, 沈浩, 王源超, 张海峰
【申请人】南京农业大学
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