一种培育杨树转抗虫基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程、生物遗传工程技术领域，特别涉及一种培育杨树转抗虫基因的方法。
【背景技术】
[0002]目前，国内、外将杨树作为绿化环保的首要树种，用于防风固沙、保土留肥、防止土壤沙化。国外运用转基因等先进手段对杨树进行改良研究，属黑杨欧美杨杂交品种，其特征是树干闻大通直、树皮灰色较粗、分枝角度小、树冠窄、侧枝细、叶片小而密、满冠；雌株。速生，胸径年平均生长量3.5?5 Cm，树高平均生长量3.5M。干径通直、材质优良，其纤维长度和木材密度均优于1- 214杨等普通杨树，是纸浆材和板材的优良树种，有纤维长、木材密度高，树冠窄抗风能力强，不易风倒、风折。抗病虫害，对光肩星天牛具有明显抗性，抗寒等性能。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为解决增加杨树对榆毒蛾幼虫和天幕毛幼虫的杀虫活性，加快杨树生长速度，降低主要病虫害造成的损失，提高林木经济价值，提供一种培育杨树转抗虫基因的方法。
本发明培育杨树转抗虫基因的方法内容简述:
本发明培育杨树转抗虫基因的方法，其特征在于:采用优良品种杨树为试材，进行组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性试验，建立高效的外植体再生体系、进行遗传转化条件试验，确定叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；
试验选用的材料为:
1、菌种和质粒:含Bt基因的植物表达载PCUBVgb转化的根癌农杆菌LBA4404；
2、植物材料:欧美杨107；
3、供试昆虫:榆毒蛾幼虫和天幕毛虫幼虫；
4、化学试剂:卡那霉素、羧苄青霉素、潮霉素、利福霉素；扩增引物、Taq酶；
5、培养基:农杆菌培养基、蔗糖、酵母提取物、琼脂；叶片、生根培养基；
培育杨树转抗虫基因的方法按下列步骤:
1、潮霉素临界浓度的确定:
设计4个潮霉素的浓度梯度，在杨树不定芽分化培养基中加入上述浓度的潮霉素，取生长健壮的无菌苗叶片及茎段置于培养基中，定期观察分化情况确定叶片及茎段对潮霉素的抗性浓度；
2、菌种的活化
将含有植物植物表达载体的农杆菌菌液置于恒温箱中，培养形成单菌落；挑取农杆菌单菌落，接种于液体培养基中用于转化； 3、叶盘法转化杨树:
利用叶盘法对杨树进行抗虫基因转化，取生长健壮的无菌苗叶片和茎段，投入到用MS液悬浮稀释的菌液中，转入选择分化培养基中培养；
4、转化植株:
经过农杆菌侵染的叶片及茎段外植体在芽选择分化培养基上，有抗性芽产生，将抗性芽同外植体一起继续进行选择培养，转移至生根培养基上诱导生根；
5、转化植株的鉴定:
采用潮霉素抗性鉴定、转基因植株的PCR检测、植物总DNA的提取、总DNA的PCR扩增:以转化植株中提取的植物总DNA为模板，用PCR仪检测转基因植物中外源基因的整合情况，以未经转化的107杨DNA的PCR产物为阴性对照；
6、转基因植株抗虫活性测定、转基因植株苗其生长与形态观察，求平均值和标准差进行检验，观察生长正常的一年生和两年生苗木的干形、分角、叶片形态。
[0004]本发明应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目，转基因杨比较一般杨树具有抗虫害、速生、纤维含量高等优越性，在造林绿化、防止土地沙化等方面具有广阔的市场前景。
【具体实施方式】
[0005]本发明培育杨树转抗虫基因的方法是这样实现的，下面做具体说明。
[0006]本发明培育杨树转抗虫基因的方法进行了试验研究，采用优良品种杨树为试材，进行组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性试验，建立高效的外植体再生体系、进行遗传转化条件试验，确定叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗；
试验选用的材料为:
菌种和质粒:含Bt基因的植物表达载pCUBVgb转化的根癌农杆菌LBA4404 ;植物材料:欧美杨107 ;供试昆虫:榆毒蛾幼虫和天幕毛虫幼虫；化学试剂:卡那霉素、羧苄青霉素、潮霉素、利福霉素；扩增引物、Taq酶；培养基:农杆菌培养基、蔗糖、酵母提取物、琼脂；叶片、生根培养基；
培育杨树转抗虫基因的方法按下列步骤:
潮霉素临界浓度的确定:设计4个潮霉素的浓度梯度，在杨树不定芽分化培养基中加入上述浓度的潮霉素，取生长健壮的无菌苗叶片及茎段置于培养基中，定期观察分化情况确定叶片及茎段对潮霉素的抗性浓度；
菌种的活化:将含有植物植物表达载体的农杆菌菌液置于恒温箱中，培养形成单菌落；挑取农杆菌单菌落，接种于液体培养基中用于转化；
叶盘法转化杨树:利用叶盘法对杨树进行抗虫基因转化，取生长健壮的无菌苗叶片和茎段，投入到用MS液悬浮稀释的菌液中，转入选择分化培养基中培养；
转化植株:经过农杆菌侵染的叶片及茎段外植体在芽选择分化培养基上，有抗性芽产生，将抗性芽同外植体一起继续进行选择培养，转移至生根培养基上诱导生根；
转化植株的鉴定:采用潮霉素抗性鉴定、转基因植株的PCR检测、植物总DNA的提取、总DNA的PCR扩增:以转化植株中提取的植物总DNA为模板，用PCR仪检测转基因植物中外源基因的整合情况，以未经转化的107杨DNA的PCR产物为阴性对照；
转基因植株抗虫活性测定、转基因植株苗其生长与形态观察，求平均值和标准差进行检验，观察生长正常的一年生和两年生苗木的干形、分角、叶片形态。
[0007]本发明应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目，转基因杨比较一般杨树具有抗虫害、速生、纤维含量高等优越性，在造林绿化、防止土地沙化等方面具有广阔的市场前景。
【主权项】
1.一种培育杨树转抗虫基因的方法，其特征在于:采用优良品种杨树为试材，进行组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性试验，建立高效的外植体再生体系、进行遗传转化条件试验，确定叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗； 试验选用的材料为: (1)、菌种和质粒:含Bt基因的植物表达载PCUBVgb转化的根癌农杆菌LBA4404； (2)、植物材料:欧美杨107； (3)、供试昆虫:榆毒蛾幼虫和天幕毛虫幼虫； (4)、化学试剂:卡那霉素、羧苄青霉素、潮霉素、利福霉素；扩增引物、Taq酶； (5)、培养基:农杆菌培养基、蔗糖、酵母提取物、琼脂；叶片、生根培养基； 培育杨树转抗虫基因的方法按下列步骤: (1)、潮霉素临界浓度的确定: 设计4个潮霉素的浓度梯度，在杨树不定芽分化培养基中加入上述浓度的潮霉素，取生长健壮的无菌苗叶片及茎段置于培养基中，定期观察分化情况确定叶片及茎段对潮霉素的抗性浓度； (2)、菌种的活化 将含有植物植物表达载体的农杆菌菌液置于恒温箱中，培养形成单菌落；挑取农杆菌单菌落，接种于液体培养基中用于转化； (3)、叶盘法转化杨树: 利用叶盘法对杨树进行抗虫基因转化，取生长健壮的无菌苗叶片和茎段，投入到用MS液悬浮稀释的菌液中，转入选择分化培养基中培养； (4)、转化植株: 经过农杆菌侵染的叶片及茎段外植体在芽选择分化培养基上，有抗性芽产生，将抗性芽同外植体一起继续进行选择培养，转移至生根培养基上诱导生根； (5)、转化植株的鉴定: 采用潮霉素抗性鉴定、转基因植株的PCR检测、植物总DNA的提取、总DNA的PCR扩增:以转化植株中提取的植物总DNA为模板，用PCR仪检测转基因植物中外源基因的整合情况，以未经转化的107杨DNA的PCR产物为阴性对照； (6)、转基因植株抗虫活性测定、转基因植株苗其生长与形态观察，求平均值和标准差进行检验，观察生长正常的一年生和两年生苗木的干形、分角、叶片形态。
【专利摘要】本发明涉及一种培育杨树转抗虫基因的方法，其特征在于：采用优良品种杨树为试材，进行组培再生、农杆菌介导的抗虫基因转化及转基因植株的抗虫性试验，建立高效的外植体再生体系、进行遗传转化条件试验，确定叶片及茎段外植体对潮霉素抗性的临界浓度、获得转基因再生植株，组培快繁了大量转基因杨树苗。本发明应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目，转基因杨比较一般杨树具有抗虫害、速生、纤维含量高等优越性，在造林绿化、防止土地沙化等方面具有广阔的市场前景。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82, C12Q1/68
【公开号】CN105713918
【申请号】CN201410730433
【发明人】满书岐
【申请人】满书岐