一种油田化学剂的生物毒性评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环保技术领域，涉及一种对油田化学剂的生物毒性评价方法。
【背景技术】
[0002] 随着世界范围内环境保护法律法规的日益严格及公众环境意识的日益强烈，油田 化学剂(主要包括钻井液添加剂及体系、完井液添加剂及体系、油田污水处理剂等）的环境 保护评价问题受到了普遍关注和重视。在国外，如美国、英国、加拿大、挪威、荷兰等都制定 了有关油田化学剂(主要是钻井液及其废弃物）的环境保护指标。在我国，油田化学剂的 生物毒性问题日益受到重视，已经开展了废弃钻井液对海洋生物的毒性测试，并初步建立 了油基钻井液毒性评价的实验程序，但关于油田化学剂生物毒性测试方法的研究却起步较 晚。油田化学剂生物毒性测试方法的研究始于九十年代初期，迄今为止，尚无统一的油田化 学剂生物毒性测试方法标准与分级标准。
[0003] 1995年国家环保局颁布了《水质急性生物毒性发光细菌法》即国标GB/T 15441-1955,并于1995年3月1日开始在全国实行。它是测定水质急性生物毒性的标准 方法。中国石油环境监测总站W《水质急性生物毒性发光细菌法》为基础，参照EPA織奸生 物试验法，建立了利用发光细菌法测定钻井液及添加剂生物毒性的测试方法和生物毒性分 级方法，并W此为基准起草并建立了中国石油天然气集团公司企业标准Q/SY111-2007,即 《油田化学剂、钻井液生物毒性分级及检测方法发光细菌法》。
[0004] 发光细菌法是基于毒性物质对发光细菌的发光度的抑制效果而设计的一种 评价方法，具有操作简便，检测周期短，易于现场操作等特点，被多个行业广泛采用。 CN201110090246.9公开了一种发光菌毒性的测定方法，该方法包括W下步骤；1)菌种活 化：将明亮发光杆菌的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后可用；2)菌种的培养；将传代 好的菌种用接种环接种到液体培养基，2(TC，ISOrpm培养12h ;3)菌液的平衡；移取适量菌 液到20血3%化Cl溶液中，控制光值测定范围在50-500万之间，20°C条件下揽拌40min ;4) 加样及发光强度检测：将揽拌了 40min的菌液用连续进样器加入200 U L到800 U L的3% 化Cl空白及800 U L浓度梯度的3%化Cl污染液，加样后立即在旋润混匀器上混匀2min， 2(TC条件下，静置15min后将样品管置入英光检测器中测定发光强度；5)双交错对照法计 算样品对发光强度的抑制率。CN201010537039. 9公开了一种发光细菌菌种的长期保存、快 速复苏的方法。通过开发专口的细菌冻存培养基和复苏溶液，实现发光细菌菌种的长期保 存和快速复苏，既节省了测试成本，也大大缩短了毒性测试的时间，为化学污染物的快速毒 性测试提供了可能。
[0005] 目前油田化学剂的生物毒性等级判断主要是基于化学剂对发光细菌的发光量抑 制程度。由于发光细菌具有自主的代谢及条件反射机制，发光量作为生物毒性唯一的检测 指标，其受菌体生长代谢及环境影响很大，准确量化的难度很大，因此发光细菌检测方法的 稳定性、重现性不高。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种油田化学剂生物毒性评价方法。该方法 通过菌种复苏、同步化培养、稳态筛选等方式获得具有较高发光稳定性的供试发光菌菌悬 液；在毒性检测过程中，加入发光促进剂，从而削弱了个体发光差异，保证了毒性评价结果 的稳定性和重现性。
[0007] 本发明油田化学剂生物毒性评价方法，包括如下内容： (1) 发光菌复苏；将发光菌用氯化钢溶液配制成菌悬液，于冰水浴中复苏； (2) 同步化培养；将复苏菌悬液接种于活化培养基中，进行活化培养；活化培养后期， 在菌体培养液中加入生长抑制剂，进行同步培养；经同步培养后，收集菌体细胞； (3) 毒性评价：用氯化钢溶液将菌体细胞配制成具有一定发光量的菌悬液，并添加发光 促进剂，用于毒性评价分析。
[0008] 本发明方法中，所采用的发光菌是具有特殊发光代谢途径的一类菌种，包括弧菌 属、发光杆菌属、异短杆菌属，其中优选明亮发光杆菌。
[0009] 本发明方法中，所采用的发光菌可W是来自于市售的发光菌冻干粉，也可W是斜 面或液体保藏的菌种。
[0010] 本发明方法中，菌体复苏过程使用质量浓度为1. 5%~3. 0%氯化钢溶液，复苏时间 2min~lOmin。复苏后菌悬液发光量达到600mV W上即满足试验要求。
[0011] 本发明方法中，所述的活化培养基配方为膜蛋白腺0.1 wt%~0.5wt%，酵母膏 0. 2wt% ~0. 5wt%，甘油 0.1 wt% ~0. 3wt%，磯酸二氨钟 0. 05wt% ~0. 2wt%，磯酸氨二钢 0. 05wt%~0. 2wt%，氯化钢0. 2wt%~0. 5wt%，P册.5。活化培养时间为1化~1她。
[0012] 本发明方法中，通过在活化培养基中加入生长限制性成分即生长抑制剂的方式， 进行生长同步化调节。所选择的生长抑制剂为核酸合成抑制或细胞分裂抑制剂，如可W是 5-氣脱氧尿嚼巧、居基脈、阿糖胞巧、氨甲蝶岭、腺嘿岭、鸟嘿岭、胸腺嚼巧、秋水仙素、秋水 仙胺等中的一种或几种。具体根据选择的生长抑制剂不同，确定其加入量，可W实现同步化 培养即可。
[0013] 本发明方法中，发光菌在加入生长抑制剂菌体培养液中培养化~1化后，进行离 必处理，获得菌体沉淀。离必转速为50化pm~1500巧m，离必时间IOmin~20min。
[0014] 本发明方法中，W质量浓度为2%~3%的氯化钢溶液将收集的菌体沉淀进行2~ 4次清洗，并配制成发光菌菌悬液，用于钻井液生物毒性评价。
[0015] 本发明方法中，发光菌菌悬液中加入质量浓度为0. 1%~0. 3%发光促进剂。发光 促进剂为六碳糖或八碳W上的醒类，优选葡萄糖、辛醒。
[0016] 与现有技术相比，本发明油田化学剂生物毒性评价方法通过有效菌体同步生长处 理步骤，获得了生长一致性的菌体细胞，排除了菌体生长差异对菌体发光量的影响，同时根 据菌体发光原理，在检测用菌悬液中添加了发光促进剂，提高了发光强度及发光稳定性，更 有利于提高毒性评价结果的稳定性和重现性： (1)现有毒性评价方案是W发光菌的发光量变化作为毒性检测的指标，由于发光菌是 具有自主生理代谢调控的生物体，因此处于不同生长期的菌体，其发光量处于不断的变化 中，其表现的发光总量波动性很大，作为检测指标，其结果的稳定性、准确性会受到严重质 疑。本发明W菌体同步培养的方式，获得了同步生长的供试菌体，从而提高了检测结果的稳 定性。
[0017] (2 )现有钻井液体系中富养有机成分较少，加入发光菌后，其发光量呈逐步下降的 趋势，从而影响对其毒性的判定。因此，本方案在检测用菌悬液中添加了发光促进剂，使其 发光量维持在一个恒定的水平，有利于其毒性判断的准确性。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明方法的具体过程及效果进行说明，但不局限于W下实施 例。本发明中，wt%为质量分数。
[0019] 本实施例中所用的发光菌为市售的明亮发光杆菌冻干粉。钻井液毒性评价试验过 程依据中国石油天然气集团公司企业标准Q/SY111- 2007,即《油田化学剂、钻井液生物毒 性分级及检测方法发光细菌法》进行。
[0020] 实施例1 (1) 取市售的明亮发光杆菌T3小种（Photobacterium photoreum T3 spp.)冻干粉 0. 5g，溶解于ImL质量浓度2. 5wt%的氯化钢溶液。于冰水浴中复苏5min ; (2) 将复苏菌悬液接种于50mL活化培养基中，于2(TC，活化培养1她； (3) 活化1化后，向培养基中加入5嗦秋水仙胺，同步培养化； (4) 同步培养化后，100化pm离必lOmin，弃上清液，取菌体沉淀，用3%氯化钢溶液清洗 两次，并再次离必获得菌体沉淀； (5) 将菌体溶于IOmL含有3wt%氯化钢，0.1 wt%葡萄糖的缓冲溶液，配制成菌悬液； (6) 取10化菌悬液加入2mL3wt%氯化钢溶液中进行发光量测定。
[0021] 实验结果如下表所示。
[002引 实施例2 (1) 取市售的明亮发光杆菌T3小种（Photobacterium photoreum T3 spp.)冻干粉 0. 5g，溶解于ImL质量浓度2. 5wt%的氯化钢溶液。于冰水浴中复苏5min ; (2) 将复苏菌悬液接种于50mL活化培养基中，于2(TC，活化培养1她； (3) 活化1化后，向培养基中加入25mg胸腺嚼巧，同步培养16h ; (4) 同步培养1化后，500巧m离必20min，弃上清液，取菌体沉淀，用3wt%氯化钢溶液清 洗H次，并再次离必获得菌体沉淀； (5) 将菌体溶于IOmL含有3wt%氯化钢、0. 2wt%辛醒的缓冲溶液，配制成菌悬液； (6) 取10化菌悬液加入2血3wt%氯化钢中进行发光量测定。
[0023] 实验结果如下表所示。
[0024] 实施例3 (1) 取市售的明亮发光杆菌T3小种（Photobacterium photoreum T3 spp.)冻干粉 0. 5g，溶解于ImL质量浓度2. 5wt%的氯化钢溶液。于冰水浴中复苏5min ; (2) 将复苏菌悬液接种于50mL活化培养基中，于2(TC，活化培养1她； (3) 活化1化后，向培养基中加入25mg腺嘿岭，同步培养16h ; (4) 同步培养1化后，120化pm离必lOmin，弃上清液，取菌体沉淀，用3wt%氯化钢溶液 清洗H次，并再次离必获得菌体沉淀； (5) 将菌体溶于IOmL含有3wt%氯化钢、0. 2wt%葡萄糖的缓冲溶液，配制成菌悬液； (6) 取10化菌悬液加入2mL3wt%氯化钢中进行发光量测定。
[0025] 实验结果如下表所示。
[002引 实施例4 W实施例1所获得发光菌菌悬液，用于5%氯化巧钻井液体系的生物毒性评价。毒性评 价试验步骤按照中国石油天然气集团公司企业标准Q/SY111- 2007,即《油田化学剂、钻井 液生物毒性分级及检测方法发光细菌法》进行。实验结果如下表所示。
[0027] 相对发光度，其中％。。。指实验样品的发光量，Epk指对照样品的发光量。
[002引 比较例1 同实施例1中（1)~（4)实验操作，获得菌体沉淀，并将菌体溶于IOmL含有3wt%氯化 钢溶液中，不使用发光促进剂，用于发光量检测，实验结果如下表所示：
与实施例1相比，菌体发光量较低，证明发光促进剂有利于促进菌体二次复苏，从而 提高发光量。
[002引 比较例2 同实施例1中（1)、（2)、（4)、（5)实验操作，获得菌体沉淀，不使用生长抑制剂秋水仙 胺，获得的菌体溶于IOmL含有3wt%氯化钢、0.1 wt%葡萄糖的缓冲溶液中，用于发光量检测， 实验结果如下表所示：
与实施例1相比，菌体发光量的存在无序的波动性，证明同步化处理有利于提高菌体 发光稳定性。
[0030] 比较例3 (1)取市售的明亮发光杆菌T3小种（Photobacterium photoreum T3 spp.)冻干粉 0. 5g，按照CN201110090246. 9公开方式进行复苏、活化； (2)取10化菌悬液加入2血3%氯化钢中进行发光量测定。
[0031] 实验结果如下表所示：
与实施例1相比，该专利报道的菌体复苏、活化的方法，其菌体发光量存在较大的波动 性。
[00础 比较例4 按照中国石油天然气集团公司企业标准Q/SY111- 2007,即《油田化学剂、钻井液生物 毒性分级及检测方法发光细菌法》中全部试验过程，对5%氯化巧钻井液体系进行生物毒性 评价。结果如下：
与实施例4相比，相对发光度的变化没有规律性，因此不能明确判定其毒性范围。
【主权项】
1. 一种油田化学剂的生物毒性评价方法，其特征在于包括如下内容： (1) 发光菌复苏：将发光菌用氯化钠溶液配制成菌悬液，于冰水浴中复苏； (2) 同步化培养：将复苏菌悬液接种于活化培养基中，进行活化培养；活化培养后期， 在菌体培养液中加入生长抑制剂，进行同步培养；经同步培养后，收集菌体细胞； (3) 毒性评价：用氯化钠溶液将菌体细胞配制成具有一定发光量的菌悬液，并添加发光 促进剂，用于毒性评价分析。2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)所述的发光菌为弧菌属、发光杆 菌属或异短杆菌属。3. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所采用的发光菌为明亮发光杆菌。4. 按照权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所采用的发光菌来自于市售的发 光菌冻干粉或者是斜面或液体保藏的菌种。5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中菌体复苏过程使用质量浓度为 1. 5%~3. 0%氯化钠溶液，复苏时间2min~lOmin。6. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)所述的活化培养基配方为胰 蛋白腺〇· lwt%~0· 5wt%，酵母膏0· 2wt%~0· 5wt%，甘油0· lwt%~0· 3wt%，憐酸二氢钾 0· 05wt% ~0· 2wt%，磷酸氢二钠 0· 05wt% ~0· 2wt%，氯化钠 0· 2wt% ~0· 5wt%，ρΗ6· 5 ;活化 培养时间为12h~18h。7. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)所述的生长抑制剂为核酸合成抑 制剂或者细胞分裂抑制剂。8. 按照权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（2)所述的生长抑制剂为5-氟脱氧 尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、秋水仙素、秋水仙胺等中 的一种或几种。9. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中发光菌在加入生长抑制剂 菌体培养液中培养5h~16h后，进行离心处理，离心转速为500rpm~1500rpm，离心时间 lOmin ~20min〇10. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中以质量浓度为2%~3%的氯 化钠溶液将收集的菌体细胞进行2~4次清洗。11. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)菌悬液中加入质量浓度为 0. 1%~0. 3%发光促进剂，发光促进剂为六碳糖或八碳以上的醛类。12. 按照权利要求11所述的方法，其特征在于：所述的发光促进剂为葡萄糖或辛醛。
【专利摘要】本发明公开了一种油田化学剂生物毒性评价方法，包括如下内容：（1）发光菌复苏：将发光菌用氯化钠溶液配制成菌悬液，于冰水浴中复苏；（2）同步化培养：将复苏菌悬液接种于活化培养基中，进行活化培养；活化培养后期，在菌体培养液中加入生长抑制剂，进行同步培养；经同步培养后，收集菌体细胞；（3）毒性评价：用氯化钠溶液将菌体细胞配制成具有一定发光量的菌悬液，并添加发光促进剂，用于毒性评价分析。本发明方法通过菌种复苏、同步化培养、稳态筛选等方式获得具有较高发光稳定性的供试发光菌；在毒性检测过程中，加入发光促进剂，从而削弱了个体发光差异，保证了毒性评价结果的稳定性和重现性。
【IPC分类】C12Q1/02, C12R1/63, C12R1/01
【公开号】CN105713952
【申请号】CN201410736313
【发明人】张霖, 姚新武, 廖莎, 樊亚超, 师文静
【申请人】中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院