对蛋白酶裂解敏感性降低的变体α-淀粉酶及其使用方法与流程

文档序号:13108748
技术特征:
1.一种用于降低具有TIM桶状结构的α-淀粉酶对蛋白水解裂解的敏感性的方法,所述方法包括将存在于连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环中的非经典(non-canonical)、表面暴露的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基,从而产生变体α-淀粉酶,其中与亲本α-淀粉酶相比,所述变体α-淀粉酶对于由蛋白酶进行的对连接所述β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环的裂解具有降低的敏感性,并且其中SEQIDNO:3用于位置编号。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述非经典、表面暴露的氨基酸残基存在于与所述亲本α-淀粉酶中的第333位相对应的位置处,其中SEQIDNO:3用于位置编号。3.根据权利要求2所述的方法,还包括将存在于与所述亲本α-淀粉酶中的第335位相对应的位置处的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基,其中SEQIDNO:3用于位置编号。4.根据前述权利要求2或3所述的方法,其中所述亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有除甘氨酸或谷氨酰胺之外的氨基酸残基。5.根据前述权利要求2-4中任一项所述的方法,其中所述亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有苏氨酸。6.根据前述权利要求2-5中任一项所述的方法,其中在与第333位相对应的位置处的所述氨基酸残基被置换为甘氨酸。7.根据前述权利要求3-6中任一项所述的方法,其中所述亲本α-淀粉酶在与第335位相对应的位置处具有除丝氨酸之外的氨基酸残基。8.根据前述权利要求3-7中任一项所述的方法,其中在与第335位相对应的位置处的所述氨基酸残基被置换为丝氨酸。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,还包括在所述亲本α-淀粉酶中产生以下突变中的一者或多者:(i)在与第177位、第178位、第179位和第180位相对应的位置处缺失一个或多个氨基酸残基;(ii)置换存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基;或(iii)置换存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基;其中与所述亲本相比,所得的变体在洗涤剂组合物中具有增强的洗涤剂稳定性和\/或增强的清洁性能,并且其中SEQIDNO:3用于位置编号。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,还包括在所述亲本α-淀粉酶中产生以下突变中的一者或多者:(i)在与第177位和第178位相对应的位置处缺失氨基酸残基;(ii)将存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基置换为脯氨酸;或(iii)将存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基置换为精氨酸或赖氨酸;其中与所述亲本相比,所得的变体在洗涤剂组合物中具有增强的洗涤剂稳定性和\/或增强的清洁性能,并且其中SEQIDNO:3用于位置编号。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,还包括在与N125、F152、N205和G473相对应的位置处产生一个或多个突变,其中SEQIDNO:3用于位置编号。12.根据权利要求11所述的方法,其中所述变体包含选自如下的突变的组合:(i)N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K;(ii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K;(iii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R;(iv)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K;(v)N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K;(vi)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K;(vii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R;(viii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K;(ix)N125Y+E186P+T333G+G472K;(x)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K;(xi)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R;以及(xii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472K。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述亲本或所述变体α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少70%、至少80%或至少90%的氨基酸序列同一性。14.一种变体α-淀粉酶,所述变体α-淀粉酶通过根据前述权利要求中任一项所述的方法制备。15.一种亲本α-淀粉酶的变体,其中所述变体包含将存在于与所述亲本α-淀粉酶中的第333位相对应的位置处的氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基的置换,其中与所述亲本α-淀粉酶相比,所述变体α-淀粉酶对于由蛋白酶进行的对连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环的裂解具有降低的敏感性,并且其中SEQIDNO:3用于位置编号。16.根据权利要求15所述的变体,还包含将存在于所述亲本α-淀粉酶中与第335位相对应的位置处的氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基的置换,以进一步降低对裂解的敏感性,其中SEQIDNO:3用于位置编号。17.根据前述权利要求15或16所述的变体,其中所述亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有除甘氨酸或谷氨酰胺之外的氨基酸残基。18.根据前述权利要求15-17中任一项所述的变体,其中所述亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有苏氨酸。19.根据前述权利要求15-18中任一项所述的变体,其中所述变体α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有替换为甘氨酸的置换。20.根据前述权利要求15-19中任一项所述的变体,其中所述亲本α-淀粉酶在与第335位相对应的位置处具有除丝氨酸之外的氨基酸残基。21.根据前述权利要求16-20中任一项所述的变体,其中所述变体α-淀粉酶在与第335位相对应的位置处具有替换为丝氨酸的置换。22.根据前述权利要求15-21中任一项所述的变体,还包含相对于所述亲本而言以下突变中的一者或多者:(i)在与第177位、第178位、第179位和第180位相对应的位置处缺失一个或多个氨基酸残基;(ii)置换存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基;(iii)置换存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基;其中与所述亲本相比,所述变体在洗涤剂组合物中具有增强的洗涤剂稳定性和\/或增强的清洁性能,并且其中所述位置编号是指SEQIDNO:3。23.根据前述权利要求15-22中任一项所述的变体,还包含相对于所述亲本而言以下突变中的一者或多者:(i)在与第177位和第178位相对应的位置处缺失氨基酸残基;(ii)将存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基置换为脯氨酸;(iii)将存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基置换为精氨酸或赖氨酸;其中与所述亲本相比,所述变体在洗涤剂组合物中具有增强的洗涤剂稳定性和\/或增强的清洁性能,并且其中所述位置编号是指SEQIDNO:3。24.根据前述权利要求15-23中任一项所述的变体,还包含在选自N125、F152、N205和G473的位置处的突变。25.根据前述权利要求15-24中任一项所述的变体,包含在与第177位、第178位、第179位和第180位相对应的位置处的一个或多个氨基酸残基的缺失,并且还包含选自如下的突变的组合:(i)N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K;(ii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K;(iii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R;(iv)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K;(v)N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K;(vi)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K;(vii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R;(viii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K;(ix)N125Y+E186P+T333G+G472K;(x)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K;(xi)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R;以及(xii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472K。26.根据前述权利要求15-24中任一项所述的变体,其中所述亲本或所述变体的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少70%、至少80%或至少90%的氨基酸序列同一性。27.一种组合物,所述组合物包含根据权利要求14-26中任一项所述的α-淀粉酶。28.根据权利要求27所述的组合物,还包含表面活性剂。29.根据权利要求27或28所述的组合物,其中所述组合物为衣物洗涤剂、衣物洗涤剂添加剂、或者手动或自动盘碟洗涤剂。30.根据权利要求27-29中任一项所述的组合物,还包含选自如下的一种或多种附加酶:蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶(ligninase)、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、金属蛋白酶、阿马道里酶(amadoriase)以及除PcuAmy1之外的α-淀粉酶、或它们的变体。31.根据权利要求27所述的组合物,其中所述组合物用于糖化包含淀粉的组合物,用于液化后SSF,或用于直接SSF而不事先液化,或用于制备发酵饮料或经烘焙的食物产品。32.根据权利要求27或28所述的组合物,其中所述组合物用于纺织物退浆。33.一种重组多核苷酸,所述重组多核苷酸编码根据权利要求14-26中任一项所述的多肽。34.根据权利要求33所述的多核苷酸,所述多核苷酸与SEQIDNO:1的多核苷酸具有至少80%的核酸序列同一性,或者在严格条件下杂交于与SEQIDNO:1的所述多核苷酸互补的多核苷酸。35.一种表达载体,所述表达载体包含根据权利要求33或34所述的多核苷酸。36.一种宿主细胞,所述宿主细胞包含根据权利要求35所述的表达载体。37.根据权利要求16-26中任一项所述的α-淀粉酶用于制备包含葡萄糖的组合物、用于制备液化淀粉、用于制备食品或饮料、用于清洁淀粉类污渍、或用于纺织物退浆的用途。38.一种用于从表面除去淀粉类污渍或污垢的方法,所述方法包括:使所述表面与组合物接触,所述组合物包含有效量的根据权利要求16-26中任一项所述的变体α-淀粉酶和任选的表面活性剂;以及使所述α-淀粉酶水解存在于所述淀粉类污渍中的淀粉组分,以产生溶解于水溶液中的淀粉衍生的小分子;从而从所述表面除去所述淀粉类污渍;其中所述组合物还任选地包含选自如下的至少一种附加酶:蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、金属蛋白酶、阿马道里酶以及除PcuAmy1之外的α-淀粉酶、或它们的变体。39.一种用于使纺织物退浆的方法,所述方法包括:使上浆的纺织物与有效量的根据权利要求14-26中任一项所述的变体α-淀粉酶接触;以及使所述α-淀粉酶水解所述浆料中的淀粉组分,以产生溶解于水溶液中的淀粉衍生的小分子;从而从所述纺织物除去所述浆料。40.一种用于糖化包含淀粉的组合物以产生包含葡萄糖的组合物的方法,所述方法包括:使所述包含淀粉的组合物与有效量的根据权利要求14-26中任一项所述的变体α-淀粉酶接触;以及糖化所述包含淀粉的组合物以产生所述包含葡萄糖的组合物;其中所述α-淀粉酶催化所述淀粉溶液糖化为葡萄糖。41.根据权利要求40所述的方法,其中所述包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒状淀粉。42.一种用于制备食品或饮料的方法,所述方法包括:使包含淀粉的食品或饮料与根据权利要求14-26中任一项所述的α-淀粉酶接触;以及使所述α-淀粉酶水解淀粉以产生淀粉衍生的小分子;其中所述方法还任选地包括使所述食品或饮料与葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、普鲁兰酶、β-淀粉酶、非所述变体α-淀粉酶的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或它们的组合接触。43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法,其中所述α-淀粉酶由宿主细胞表达并分泌。44.根据权利要求43所述的方法,其中使所述包含淀粉的组合物与所述宿主细胞接触。45.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述宿主细胞还表达并分泌葡糖淀粉酶或其它酶。46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞能够对所述组合物进行发酵。
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