用于抗葡萄球菌剂的吞噬细胞递送的组合物和方法与流程

发明领域本发明大体上涉及靶向至少两种不同的细菌毒力因子的多特异性结合分子。具体说来，该结合分子包含至少两个特异性结合于不同葡萄球菌蛋白的结合结构域(即，该分子至少为双特异性的)。第一结合结构域优选地为抗体或其片段，能够结合于糖基化葡萄球菌表面蛋白，优选地糖基化含丝氨酸-天冬氨酸二肽重复序列(SDR)蛋白。第二结合结构域优选地为替代骨架，能够结合于葡萄球菌白细胞毒素，优选地LukAB、LukD或LukE。这些多特异性结合化合物具有针对葡萄球菌的杀灭活性，并且因此可用于预防、治疗和/或改善金黄色葡萄球菌感染，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染。背景由葡萄球菌细菌引起的细菌感染(即，“葡萄球菌感染”)在一般人群中非常普通。约25％的个体通常在其皮肤上或在其鼻子中携带葡萄球菌细菌。这些细菌多半时间不会在相对轻微的皮肤感染中造成问题或后果。然而，如果细菌更深地侵入个体的身体中，例如进入血流、关节、骨、肺或心脏中，那么葡萄球菌感染可变得致命。过去，致命葡萄球菌感染可能已经在住院或具有慢性疾病或虚弱免疫系统的人体内出现。现在，日益常见在其它方面健康的个体发展危急生命的葡萄球菌感染。重要的是，许多葡萄球菌感染不再对常见抗生素起反应。金黄色葡萄球菌(通常称作“葡萄球菌(staph)”、金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)”或“金黄色葡萄球菌(S.aureus)”)为主要的人类病原体，产生多种毒力因子，从而使其能够引起数种类型的感染，从浅表病变至中毒病和危急生命的全身性病状，如心内膜炎、骨髓炎、肺炎、脑膜炎和败血症(在Miller和Cho,“ImmunityAgainstStaphylococcusaureusCutaneousInfections,”Nat.Rev.Immunol.11:505-518(2011)中回顾)。尽管大多数个体在出生后不久遭遇金黄色葡萄球菌(Holtfreter等人,“TowardstheImmuneProteomeofStaphylococcusaureus-TheAnti-S.aureusAntibodyResponse,”Int.J.Med.Microbiol.300:176-192(2010))并且具有针对金黄色葡萄球菌的抗体和增加感染后的抗金黄色葡萄球菌效价的能力，但这些抗体通常并未具保护性以免于复发性金黄色葡萄球菌感染(FosterTJ,“ImmuneEvasionbyStaphylococci,”Nat.Rev.Microbiol.3:948-958(2005))。仅在美国，每年有超过20,000的死亡人数归因于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，超过由流感、病毒性肝炎和HIV/AIDS引起的死亡(Foster,TJ.,“ImmuneEvasionbyStaphylococci,”Nat.Rev.Microbiol.3:948-958(2005)；Klevens等人,“TheImpactofAntimicrobial-Resistant,HealthCare-AssociatedInfectionsonMortalityintheUnitedStates,”Clin.Infect.Dis.47:927-930(2008))。病原体产生多种可能促进人类宿主中或人类宿主上的存活的分子。双组分、成孔白细胞毒素在由金黄色葡萄球菌产生的分泌毒力因子当中。这些毒素可分泌为寡聚的水溶性单体，并且接着将孔插入质膜中，该质膜随后破坏细胞渗透平衡和膜电位，从而导致靶向细胞的死亡，最为显著的是多形核白细胞(PMN)和单核吞噬细胞(Bischogberger等人,“PathogenicPore-FormingProteins:FunctionandHostResponse,”CellHostMicrobe12(3):266-275(2012)，其以引用的方式整体并入本文)。在白细胞毒素ED(LukED)的情况下，宿主吞噬细胞的靶向、结合和杀灭经由位于吞噬细胞表面上的细胞靶标CCR5、CXCR1和CXCR2发生(AlonzoIII等人,“StaphylococcusaureusLeucocidinEDContributestoSystemicInfectionbyTargetingNeutrophilsandPromotingBacterialGrowthInVivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；AlonzoIII等人“CCR5isaReceptorforStaphylococcusaureusLeukotoxinED,”Nature493(7430)51-55(2012)；和Reyes-Robles等人,“StaphylococcusaureusLeukotoxinEDTargetstheChemokineReceptorsCXCR1andCXCR2toKillLeukocytesandPromoteInfection,”CellHost&Microbe14:453-459(2013))。实际上，当LukED的细胞靶标CCR5不存在于宿主免疫细胞上时，宿主动物对其它情况下致命的金黄色葡萄球菌感染具抗性(AlonzoIII等人“CCR5isaReceptorforStaphylococcusaureusLeukotoxinED,”Nature493(7430):51-55(2012))。白细胞毒素AB(LukAB)也可杀灭宿主吞噬细胞，并且其溶细胞活性可在微生物被吞噬至宿主细胞中之后从细胞的外部和从细胞的内部发挥(Dumont等人,“StaphylococcusaureusLukABCytotoxinKillsHumanNeutrophilsbyTargetingtheCD11bSubunitoftheIntegrinMac-1,”PNAS110(26):10794-10799(2013))。由于这些白细胞毒素均致病的作用，其已经被视为关键金黄色葡萄球菌毒力因子(AlonzoIII和Torres,“BacterialSurvivalAmidstanImmuneOnslaught:TheContributionoftheStaphylococcusaureusLeukotoxins,”PLOSPath9(2):e1003143(2013))。针对金黄色葡萄球菌的致病成功的另一关键因子取决于其表面蛋白的特性(Clarke等人,“SurfaceAdhesinsofStaphylococcusaureus,”Adv.Microb.Physiol.51:187-224(2006)；Patti等人,“MSCRAMM-MediatedAdherenceofMicroorganismstoHostTissues,”Annu.Rev.Microbiol.48:585-617(1994)；和Patti等人,“MicrobialAdhesinsRecognizingExtracellularMatrixMacromolecules,”Curr.Opin.CellBiol.6:752-758(1994))。金黄色葡萄球菌使用识别粘附基质分子的微生物表面组分(MSCRAMM)以便粘附于并且定殖宿主组织。MSCRAMM可识别胶原蛋白、肝素相关多糖、纤维蛋白原和/或纤连蛋白。金黄色葡萄球菌表达MSCRAMM的子集，该子集均含有丝氨酸-天冬氨酸二肽重复序列(SDR)结构域，包括凝集因子A(ClfA)、凝集因子B(ClfB)、SdrC、SdrD和SdrE(Becherelli等人“ProtectiveActivityoftheCnaBE3DomainConservedAmongStaphylococcusaureusSdrProteins,”PLoSOne8(9):e74718(2013))。表皮葡萄球菌也表达这一家族的三个成员SdrF、SdrG和SdrH(McCrea等人,“TheSerine-AspartateRepeat(Sdr)ProteinFamilyinStaphylococcusEpidermidis,”Microbiology146:1535-1546(2000))。所有这些蛋白共享相继包含N端配体结合A结构域、SDR结构域的类似结构，该SDR结构域可含有25-275个之间的丝氨酸-天冬氨酸二肽重复序列。这些蛋白的C端部分含有LPXTG-基序，其促进细胞壁由转肽酶分选酶A锚定。含SDR蛋白中的丝氨酸-天冬氨酸二肽区通过依序添加聚糖由两种糖基转移酶修饰。首先，SdgB附接所述丝氨酸-天冬氨酸二肽区内的丝氨酸残基上的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)，随后对糖蛋白进行SdgA修饰，产生二糖部分。这种糖基化可保护含SDR葡萄球菌蛋白免于组织蛋白酶G介导的降解(Hazenbos等人,“NovelStaphylococcalGlycosyltransferasesSdgAandSdgBMediateImmunogenicityandProtectionofVirulence-AssociatedCellWallProteins,”PLoSPathog9(10):e1003653(2013))。另外，也位于金黄色葡萄球菌表面上的蛋白A通过捕捉宿主IgG的Fc结构域以及IgG和IgM的VH3家族的Fab结构域而有助于葡萄球菌逃避保护性免疫反应(Sjodahl等人,“RepetitiveSequencesinProteinAfromStaphylococcusaureus.ArrangementofFiveRegionsWithintheProtein,FourBeingHighlyHomologousandFc-Binding,”Eur.J.Biochem.73:343-351(1997)；和Cary等人,“TheMurineClanV(H)IIIRelated7183,J606andS107andDNA4FamiliesCommonlyEncodeforBindingtoaBacterialBcellSuperantigen,”Mol.Immunol.36:769-776(1999))。另外，金黄色葡萄球菌表达称作免疫球蛋白的第二结合蛋白(Sbi)的第二免疫球蛋白结合蛋白(Zhang等人,“ASecondIgG-BindingProteininStaphylococcusaureus,”Microbiology144:985-991(1998)和Atkins等人,“S.aureusIgG-bindingProteinsSpAandSbi:HostSpecificityandmechanismsofImmuneComplexFormation,”Mol.Immunol.45:1600-1611(2008))，该蛋白由细胞外被膜分泌或与细胞外被膜缔合(Smith等人,“TheSbiProteinisaMultifunctionalImmuneEvasionFactorofStaphylococcusaureus”Infection&Immunity79:3801-3809(2011)和Smith等人,“TheImmuneEvasionProteinSbiofStaphylococcusaureusOccursbothExtracellularlyandAnchoredtotheCellEnvelopebyBindingtoLipotechoicAcid”Mol.Microbiol.83:789-804(2012))并且与参与结合于IgG蛋白的Fc区的蛋白A共享一对保守螺旋(Atkins等人,“S.aureusIgG-bindingProteinsSpAandSbi:HostSpecificityandmechanismsofImmuneComplexFormation,”Mol.Immunol.45:1600-1611(2008))。此外，金黄色葡萄球菌分泌多种已经牵涉于免疫逃避中的蛋白酶。Rooijakkers等人证明了葡萄球菌激酶(血纤维蛋白溶酶原激活蛋白)的金黄色葡萄球菌分泌导致血纤维蛋白溶酶的激活，血纤维蛋白溶酶裂解表面结合的IgG和补体C3b，最终减少免疫介导的金黄色葡萄球菌破坏(Rooijakkers等人,“Anti-OpsonicPropertiesofStaphylokinase,”MicrobesandInfection7:476-484(2005))。金黄色葡萄球菌还分泌丝氨酸蛋白酶谷氨酰内肽酶V8(GluV8)，其可直接裂解E233与L234之间的下部铰链区中的人类IgG1(EU编号(Edelman等人,“TheCovalentStructureofanEntireGammaGImmunoglobulinMolecule,”PNAS63:78-85(1969)，Brezski等人,“HumanAnti-IgG1HingeAutoantibodiesReconstitutetheEffectorFunctionsofProteolyticallyInactivatedIgGs,”J.Immunol.181:3183-3192(2008))。最近还证明了人类抗金黄色葡萄球菌IgG在结合于金黄色葡萄球菌的表面时快速地裂解(FernandezFalcon等人,“ProteaseInhibitorsDecreaseIgGSheddingFromStaphylococcusaureus,IncreasingComplementActivationandPhagocytosisEfficiency,”J.Med.Microbiol.60:1415-1422(2011))。总之，这些研究指示金黄色葡萄球菌利用了多种机制，这些机制可能通过直接地裂解mAb、通过蛋白A结合螯合mAb，或通过杀死治疗功效所需的特别效应细胞而不利地影响标准的基于IgG1的单克隆抗体(mAb)治疗剂。因此，不意外目前不存在已经获得用于人类的最终批准的靶向金黄色葡萄球菌的基于mAb的治疗剂。因此，仍需要可治疗葡萄球菌感染的方法和组合物，其(i)逃避蛋白A和Sbi结合，(ii)逃避葡萄球菌诱导的蛋白水解，(iii)可中和白细胞毒素和(iv)能够调理和递送金黄色葡萄球菌至吞噬细胞。本申请满足这些和其它需要。概述本公开提供包含至少第一结合结构域和第二结合结构域的多特异性结合分子，这些结合结构域中的每个特异性结合于不同的细菌毒力因子，尤其是不同的葡萄球菌毒力因子。第一和第二结合结构域任选地经由连接肽连接。第一结合结构域能够结合于糖基化葡萄球菌表面蛋白，如葡萄球菌含SDR蛋白。一方面，葡萄球菌含SDR蛋白为ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE、SdrF、SdrG和SdrH。优选地，葡萄球菌含SDR蛋白为ClfA、ClfB、SdrC、SdrD或SdrE。一方面，第一结合结构域为全长抗体或抗体片段。优选地，全长抗体或抗体片段抵抗由裂解野生型IgG1的葡萄球菌蛋白酶(如在SEQIDNO:60内的残基222-237(EU编号)之间或残基处裂解野生型IgG1的葡萄球菌蛋白酶，例如金黄色葡萄球菌V8蛋白酶)引起的蛋白水解降解。另一方面，全长抗体或抗体片段为人类、人类化或嵌合抗体或抗体片段。一方面，结合分子不能特异性结合于人类FcγRI，不能特异性结合于蛋白A，并且不能特异性结合于Sbi。一方面，结合分子能够特异性结合于FcRn。一方面，第一结合结构域包含具有选自VH区氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的组的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变(VH)区。另一方面，第一结合结构域包含具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的免疫球蛋白轻链可变(VL)区。或者，第一结合结构域包含(a)具有氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的VH区；和(b)具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的VL区。在一个实施方案中，第一结合结构域包含(1)具有氨基酸序列SEQIDNO:60的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:61的VL区；(2)具有氨基酸序列SEQIDNO:62的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:63的VL区；(3)具有氨基酸序列SEQIDNO:64的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:65的VL区；(4)具有氨基酸序列SEQIDNO:66的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:67的VL区；(5)具有氨基酸序列SEQIDNO:68的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:69的VL区；(6)具有氨基酸序列SEQIDNO:70的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:71的VL区；(7)具有氨基酸序列SEQIDNO:72的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:73的VL区；(8)具有氨基酸序列SEQIDNO:74的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:75的VL区；(9)具有氨基酸序列SEQIDNO:76的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:77的VL区；或(10)具有氨基酸序列SEQIDNO:78的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:79的VL区。另一方面，结合分子包含(a)第一结合结构域，其包含(i)具有氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的VH区；和(ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的VL区；和(b)第二结合结构域，其包含氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者。一方面，第二结合结构域包含氨基酸序列SEQIDNO:14或SEQIDNO:22。第二结合结构域能够结合于葡萄球菌白细胞毒素。一方面，葡萄球菌白细胞毒素选自由白细胞毒素A(LukA)、白细胞毒素B(LukB)、白细胞毒素AB(LukAB)、白细胞毒素D(LukD)、白细胞毒素E(LukE)、白细胞毒素ED(LukED)、Panton-Valentine杀白细胞素S(LukS-PV)、Panton-Valentine杀白细胞素F(LukF-PV)、Panton-Valentine杀白细胞素(LukSF/PVL)、γ溶血素A(HlgA)、γ溶血素C(HlgC)、γ溶血素B(HlgB)、γ溶血素AB(HlgAB)和γ溶血素BC(HlgBC)组成的组。一方面，葡萄球菌白细胞毒素为LukAB、LukD或LukE。一方面，第二结合结构域为替代骨架。一方面，替代骨架包含纤连蛋白III型(FN3)结构域。一方面，FN3结构域结合于具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA、具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB、具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD或具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE。或者，FN3结构域结合于包含具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA和具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB的LukAB复合物，和/或包含具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE和具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD的LukED复合物。一方面，结合分子的第二结合结构域与具有氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者的FN3结构域竞争结合于(i)具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA；(ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB；(iii)具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD；和/或(iv)具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE。一方面，第二结合结构域为包含选自由SEQIDNO:14-59和SEQIDNO:113-666组成的组的氨基酸序列的FN3结构域。一方面，第二结合结构域为包含氨基酸序列SEQIDNO:14或SEQIDNO:22的FN3结构域。一方面，结合分子进一步包含一个或多个额外结合结构域，其中一个或多个额外结合结构域能够(i)结合于与第一结合结构域所结合不同的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或(ii)结合于与第二结合结构域所结合不同的葡萄球菌白细胞毒素。本公开还提供编码上述结合分子的核酸序列以及包含一个或多个核酸序列的载体。另外，本发明涵盖包含这些载体的宿主细胞。此外，本公开提供一种用于制造上述结合分子的方法，该方法包括(a)培养含有包含编码本发明结合分子的一个或多个核酸序列的载体的宿主细胞，和(b)从培养物回收所述结合分子。此外，本公开提供一种包含如本文所述的结合分子的药物组合物。本文所提供的结合分子可用于治疗、预防或改善葡萄球菌感染。一方面，葡萄球菌感染有金黄色葡萄球菌引起，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)。相应地，本公开提供一种用于治疗、预防或改善葡萄球菌感染的方法，该方法包括(a)向有需要的受试者施用如本文所述的结合分子。这种治疗、预防或改善葡萄球菌感染的方法可涉及如本文所述的结合分子的重复施用，或结合分子与一种或多种其它试剂组合施用，所述其它试剂如抗感染剂、抗生素剂和/或抗微生物剂。本文所提供的结合分子也可用于诊断受试者中的葡萄球菌感染的方法中。一方面，用于诊断葡萄球菌感染的方法涉及使如本文所述的结合分子与来自受试者的样品接触和基于接触检测所述样品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的存在或不存在。这种方法进一步涉及基于所述样品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或所述葡萄球菌白细胞毒素的检测诊断受试者中的葡萄球菌感染。类似方法可用于检测样品中的葡萄球菌。具体说来，用于检测样品中的葡萄球菌的方法涉及使如本文所述的结合分子与样品接触，和基于接触检测样品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的存在或不存在，由此糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的存在指示样品中葡萄球菌的存在。此外，本发明的结合分子可用于预防葡萄球菌感染。一方面，所述用于预防葡萄球菌感染的方法涉及使本文所述的结合分子与来自受试者的样品接触，和由于接触检测样品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素。方法进一步涉及基于所述样品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的检测向受试者中施用适用于预防葡萄球菌感染的试剂。本公开还涵盖一种包含如本文所提供的结合分子的试剂盒，和一种包含编码所提供的结合分子的核酸分子、包含编码所提供的结合分子的核酸分子的载体和/或含有载体的宿主细胞的试剂盒。附图简述图1A和1B显示抗LukDFN3结构域的表征。LukED(75nM)在与hPMN混合之前与递增浓度的所指示的FN3结构域混合持续30分钟。使细胞中毒持续1h。由至少三个独立的供血者产生数据，并且误差棒表示平均值±SEM。图1A显示由CellTiter测量(细胞代谢)获得的数据。图1B显示由LDH测量值(膜损伤)获得。图2A和2B显示抗LukABFN3结构域的表征。LukAB(18.8nM)在与hPMN混合之前与递增浓度的所指示的FN3结构域混合持续30分钟。使细胞中毒持续1h。由至少三个独立的供血者产生数据，并且误差棒表示平均值±SEM。图2A显示由溴化乙锭渗透性分析(EtBr)(成孔/膜渗透性)获得的数据。图2B显示由LDH测量值(膜损伤)获得的数据。图3显示抗LukEFN3结构域的表征。LukED(75nM)在与hPMN混合之前与递增浓度的所指示的FN3结构域混合持续30分钟。使细胞中毒持续1h。由LDH测量值(膜损伤)获得数据。由至少三个独立的供血者产生数据，并且误差棒表示平均值±SEM。图4A至图4F描绘含有靶向结合于白细胞毒素中和结构域的Staph抗原的抗体可变区的示例性多特异性结合蛋白。图4A显示含有单特异性、二价抗StaphmAb可变结构域和重链C端结合LukAB、LukD或LukE中和结构域的示例性多特异性结合蛋白。图4B说明含有单特异性、二价抗StaphmAb可变结构域和轻链C端结合LukAB、LukD或LukE中和结构域的示例性多特异性结合蛋白。图4C显示含有单特异性、二价抗StaphmAb可变结构域以及轻链C端结合LukAB、LukD或LukE中和结构域和重链C端结合LukAB、LukD或LukE中和结构域的示例性多特异性结合蛋白。图4D显示含有单特异性、二价抗StaphmAb可变结构域和具有串联C端结合LukAB、LukD或LukE中和结构域的重链C端结合LukAB、LukD或LukE中和结构域的示例性多特异性结合蛋白。图4E显示含有双特异性抗StaphmAb可变结构域和重链C端结合LukAB中和结构域和重链C端结合LukAB中和结构域和重链C端结合LukD或LukE中和结构域的示例性多特异性结合蛋白。图4F说明含有单特异性、二价抗StaphmAb和重链C端结合LukAB中和结构域和重链C端结合LukD或LukE中和结构域的示例性多特异性结合蛋白。图5显示mAb5133识别金黄色葡萄球菌的SdgB-糖基化SDR蛋白。mAb5133不检测金黄色葡萄球菌的sdgB突变株中的高分子量色带，如通过来自不同金黄色葡萄球菌株的溶解产物的蛋白质印迹所分析。图6显示IgG1的下部铰链区的突变赋予增加的对GluV8消化的抗性。与含有野生型(wt)人类IgG1下部铰链区的构建体(IgG1同型对照和构建体3)相比，具有突变型下部铰链区并且在重链的C端上不具有或具有FN3结构域的PRASA构建体(分别为构建体4和构建体6)抵抗由金黄色葡萄球菌蛋白酶GluV8引起的蛋白水解。图7A至图7D显示FN3结构域的添加不会影响结合于人类FcγR的PRASA变体。使用竞争分析以便分析抗Staph靶向构建体结合于FcγR的能力。如图7A的图形所示，PRASA构建体(构建体4-7)不显示与FcγRI的可检测结合。所有构建体(IgG1同型对照和构建体3-7)均显示类似的与人类FcγRIIa(R131)的结合，如图7B所示。图7C的图形显示与IgG1和A6构建体(分别为IgG1同型对照和构建体3)相比，PRASA构建体(构建体4-7)具有减少的与人类FcγRIIb的结合。如图7D的图形所示，所有构建体(IgG1同型对照和构建体3-7)均显示类似的与人类FcγRIIIa(V158)的结合。图8显示CH3突变H435R/Y436F减少和/或消除蛋白A结合，如使用直接蛋白AELISA分析所确定。PRASAA6变体(构建体4-7)不在基于板的ELISA分析中显示与蛋白A的可检测结合，而人类IgG1(IgG1同型对照)结合于蛋白A。图9显示mAb-FN3结构域结合的结合物能够在基于流式细胞术的结合分析中结合于金黄色葡萄球菌(Newman菌株)。图10A至图10B显示mAb-FN3结构域结合物的表征。由至少三个独立的供血者取得LDH测量值(膜损伤)，并且误差棒表示平均值±SEM。图10A的图形显示在细胞暴露之前在hPMN暴露于与递增浓度的所指示的mAb或FN3结构域-mAb结合物混合持续30分钟的LukED(75nM)之后，LDH从hPMN释放。使细胞中毒持续1h。图10B的图形显示在hPMN暴露于在与hPMN混合之前与递增浓度的所指示的mAb或mAb-FN3结构域结合物混合持续30分钟的LukAB(18.8nM)之后，LDH从hPMN释放。使细胞中毒持续1h。图11显示StaphLukAB介导的吞噬后细胞毒性可由mAb-FN3结构域结合物中和。原代人类PMN感染先前用不同的mAb5133抗体或不用抗体调理的Staph。调理过的细菌用于在溴化乙锭存在下以MOI10感染hPMN。Staph诱导膜损伤的能力通过历经2h测量溴化乙锭渗透性来评估。由至少三个独立的供血者产生数据，并且误差棒表示平均值±SEM。图12显示具有抗LukABFN3结构域的mAb-FN3结构域融合蛋白中和白细胞毒素LukAB并且促进人类多形核中性粒细胞(PMN)介导的对金黄色葡萄球菌的生长的限制。这些实验使用具有表达绿色荧光蛋白(gfp)的质粒的金黄色葡萄球菌株Newman的变体。新鲜生长的GFP标记的细菌标准化至1×107CFU/mL并且1mL等分试样通过离心集结成粒并且再悬浮于300μl在1.5mg/mL下的不同mAb或mAb-FN3融合蛋白或PBS(未调理)中。用RPMI-HH使样品达到1mL并且接着在37℃下孵育20分钟以进行调理。调理过的细菌随后与2×105个新鲜分离的原代hPMN以约10:1(细菌:hPMN)的感染复数(MOI)混合。细菌和细胞通过在1500RPM下离心7分钟来同步并且放置于37℃5％CO2孵育器中。感染后5小时测量GFP荧光，其为细菌生长的指标。如图12所示，这些实验证明了与IgG1同型对照相比，A6构建体3和PRASAA6构建体4促进hPMN介导的金黄色葡萄球菌生长-限制。这与5133mAb的调理能力一致。重要的是，与PRASAA6亲本mAb(构建体4)相比，所述LukABFN3结构域-mAb5133结合物(PRASAA6HC-AB构建体6和PRASAA6LC-DHC-AB构建体7)增强PMN介导的生长限制。缺乏CR5133/抗LukDFN3结构域-mAb(PRASAA6LC-D构建体5)对生长限制的增强与以下先前发现一致：LukED产生在离体感染模型期间为最少的。图13显示具有丝氨酸天冬氨酸重复序列(SDR)元件的重组蛋白(SdrC4)的SdgB介导的糖基化导致产生由mAb5133识别的特异性表位。用由金黄色葡萄球菌株JE2(图13，面板B，泳道2和6)制备的细胞溶解产物和其它情况下等基因的sdgA突变体衍生物(图13，面板B，泳道3和7)孵育树脂结合的SdrC4蛋白导致通过使用mAb5133的蛋白质印迹法检测特异性约95kDa物质。相比之下，在用由不表达SdgB糖基转移酶的金黄色葡萄球菌株JE2的sdgB突变体衍生物(图13，面板B，泳道4和8)制备的溶解产物孵育树脂结合的SdrC4蛋白之后或在对照PBS样品(图13，面板B，泳道1和5)中未由mAb5133检测到蛋白色带。图13面板A显示对应于图13B的印迹的凝胶的胶体蓝染色，指示基本上等量的重组SdrC4蛋白装载于泳道1-4和5-8中。图14A至图14C为一系列蛋白质印迹，其显示用纯化的重组SdgB糖基转移酶蛋白使具有丝氨酸天冬氨酸重复序列(SDR)元件的重组蛋白体外糖基化导致产生由mAb5133识别的表位。具有聚组氨酸(His)6亲和标签的重组SDR蛋白(SdrC4和SdrC5)用单独缓冲液、缓冲液加上尿苷二磷酸N-乙酰基葡糖胺(UDP-GlcNac)或缓冲液加上UDP-GlcNac加上金黄色葡萄球菌SdgB糖基转移酶的重组形式孵育。反应产物通过SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜并且所得蛋白质印迹(i)用呈原发抗体的mAb5133探测并且使用二次HRP结合的山羊抗人类IgG(H+L)检测抗体检测(图14A、14B和14C的面板A)，或(ii)用对聚组氨酸(His)6亲和标签具特异性的HRP结合的mAb探测(图14A、14B和14C的面板B)。图15显示mAb5133结合SdgB糖基化SdrC4蛋白(图15，面板A)，但不结合纯化的金黄色葡萄球菌LTA(图15，面板B)。相比之下，帕吉昔单抗(充分表征的抗LTAmAb)结合纯化的金黄色葡萄球菌LTA(面板B)，但不结合SdgB糖基化SdrC4蛋白(面板A)。ELISA格式分析使用板固定、重组SdgB糖基化SdrC4蛋白或纯化的金黄色葡萄球菌LTA和用于结合任一抗原的原发抗体mAb5133、帕吉昔单抗或作为阴性对照的对呼吸道合胞病毒F(RSV-F)具特异性的mAb。图16显示mAb5133和具有消除铰链区中GluV8介导的蛋白酶裂解(PRASA)和/或蛋白A结合(A6)的突变的变体保持结合于人类(图16，面板A)和小鼠(图16，面板B)FcRn受体。ELISA格式竞争分析使用结合于铜涂布的板上的人类或小鼠FcRn受体的聚组氨酸标记的重组形式，和作为竞争者mAb的靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白(CNTO3929)的人类IgG1抗体。图17显示具有消除铰链区中GluV8介导的蛋白酶裂解(PRASA)和/或蛋白A结合(A6)的突变的mAb-FN3结构域融合蛋白保持结合于人类FcRn受体。ELISA格式竞争分析使用结合于铜涂布的板上的人类FcRn受体的聚组氨酸标记的重组形式，和作为竞争者mAb的靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白(CNTO3929)的人类IgG1抗体。图18A至图18B显示具有消除蛋白A结合(A6)的突变的mAb1533变体不能与金黄色葡萄球菌IgG结合蛋白、蛋白A或Sbi接合。由金黄色葡萄球菌株JE2(用于表达蛋白A和Sbi的野生型)和衍生物NE286(JE2的蛋白A缺乏spa突变体)、NE453(缺乏Sbi蛋白的表达的JE2的sbi突变体)和Wood46(已知缺乏蛋白A的表达的菌株)制备细胞溶解产物，通过SDS-PAGE分离，并且转移至PVDF膜。所得蛋白质印迹用(i)mAb5133(图18，面板A)，(ii)具有消除蛋白A结合的A6突变的mAb1533变体(图18A，面板B)，或(iii)具有A6突变加上消除铰链区中GluV8介导的蛋白酶裂解(PRASA)的突变的mAb1533变体(图18B，面板C)探测，其中经由二次抗体(山羊抗人类IgG(H+L)进行二次检测。图19显示由代表性FN3结构域蛋白Luk151和Luk129对γ溶血素HlgAB的差异结合和中和。FN3结构域与纯化的重组HlgA的结合通过ELISA确定。关于白细胞毒素中和研究，FN3结构域测试物品用纯化的重组HlgAB孵育，接着添加新鲜分离的原代人类中性粒细胞并且在37℃下孵育一小时。剩余中性粒细胞的存活力通过测量从具有损伤膜的细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)来确定。如图19所示，FN3结构域变体Luk151展现结合于HlgA亚单位，但不中和HlgAB白细胞毒素的溶细胞活性。相比之下，Luk129展现结合于HlgA亚单位并且中和HlgAB白细胞毒素的溶细胞活性，如通过LDH释放的完全抑制所例示。图20显示由代表性FN3结构域蛋白Luk357和Luk188对γ溶血素HlgCB的差异结合和中和。FN3结构域与纯化的重组HlgC的结合通过ELISA确定。关于白细胞毒素中和研究，FN3结构域测试物品用纯化的重组HlgCB孵育，接着添加新鲜分离的原代人类中性粒细胞并且在37℃下孵育一小时。剩余中性粒细胞的存活力通过测量从具有损伤膜的细胞释放的LDH来确定。如图20所示，FN3结构域变体Luk357展现结合于HlgC亚单位，但不中和HlgCB白细胞毒素的溶细胞活性。相比之下，Luk188展现结合于HlgC亚单位并且中和HlgCB白细胞毒素的溶细胞活性，如通过LDH释放的完全抑制所例示。图21显示由代表性FN3结构域蛋白Luk540和Luk647对Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的差异结合和中和。FN3结构域与纯化的重组LukS-PV的结合通过ELISA确定。关于杀白细胞素中和研究，FN3结构域测试物品用纯化的重组PVL杀白细胞素孵育，接着添加新鲜分离的原代人类中性粒细胞并且在37℃下孵育一小时。剩余中性粒细胞的存活力通过测量从具有损伤膜的细胞释放的LDH来确定。如图21所示，FN3结构域变体Luk540展现结合于PVL白细胞毒素的LukS-PV亚单位，但不中和PVL的溶细胞活性。相比之下，Luk647展现结合于PVL白细胞毒素的LukS-PV亚单位并且中和PVL白细胞毒素的溶细胞活性，如通过LDH释放的完全抑制所例示。详述本发明提供包含能够结合于糖基化葡萄球菌表面蛋白的第一结合结构域和能够结合于葡萄球菌白细胞毒素的第二结合结构域的结合分子。相应地，结合分子至少为双特异性的，因为其能够特异性地结合于至少两种不同的葡萄球菌毒力因子。优选地，结合分子为人类结合分子。在一个实施方案中，结合分子的第一结合结构域和第二结合结构域包含抗体(或其片段)、替代骨架或其组合(例如结合分子包含抗体(或其片段)和替代骨架，这些结合分子中的每个结合于不同的细菌毒力因子)。还提供制造这些结合分子的方法。优选地，这些多特异性结合分子展现针对葡萄球菌的杀菌活性，并且因此可用于预防、治疗、检测、诊断和/或改善葡萄球菌感染，包括MRSA感染和MSSA感染。在详细地公开本发明之前，提供以下定义。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。在本公开的情况下术语“结合分子”指示能够特异性地结合于两种或更多种不同抗原或靶标、与该抗原或靶标相互作用或识别该抗原或靶标的任何分子。在这种意义上，本发明的结合分子至少为“双特异性的”，如本文所用的该术语是指至少包含能够结合于一种抗原或靶标的第一结合结构域和能够结合于另一抗原或靶标的第二结合结构域的分子。具体说来，本发明的结合分子能够结合于葡萄球菌白细胞毒素和糖基化葡萄球菌表面蛋白，与葡萄球菌白细胞毒素和糖基化葡萄球菌表面蛋白相互作用和/或识别葡萄球菌白细胞毒素和糖基化葡萄球菌表面蛋白。本发明的结合分子还包括能够同时结合两种或更多种抗原的多特异性结合分子，包括但不限于具有三个结合结构域的三特异性结合分子、具有四个结合结构域的四特异性分子等。多特异性结合分子的各结合结构域能够结合不同抗原或细菌蛋白，例如不同葡萄球菌抗原或蛋白。根据本发明，示例性结合分子为多肽。多肽可包括蛋白部分和非蛋白部分(例如，化学连接子或化学交联剂)。术语“结合结构域”关于本公开表征结合分子的结构域，该结构域能够特异性地结合于靶标分子上的给定靶标表位或给定靶标位点/与靶标分子上的给定靶标表位或给定靶标位点相互作用，靶标分子例如葡萄球菌白细胞毒素(例如LukAB、LukD和/或LukE)和/或糖基化葡萄球菌表面蛋白(例如SdgB糖基化葡萄球菌含SDR蛋白)。结合结构域可源于结合结构域供体，例如抗体、蛋白A、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI(Kunitz结构域)、Ras结合蛋白AF-6(PDZ-结构域)、北非蝎毒素(蝎子毒素)、CTLA-4、Min-23(打结素)、脂质运载蛋白(脂笼蛋白)、新制癌菌素、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复序列结构域或硫氧还蛋白(Skerra,A.,“AlternativeNon-AntibodyScaffoldsforMolecularRecognition,”Curr.Opin.Biotechnol.18:295-304(2005)；Hosse等人,“ANewGenerationofProteinDisplayScaffoldsforMolecularRecognition,”ProteinSci.15:14-27(2006)；Nicaise等人,“AffinitytransferbyCDRgraftingonaNonimmunoglobulinScaffold,”ProteinSci.13:1882-1891(2004)；Nygren和Uhlen,“ScaffoldsforEngineeringNovelBindingSitesinProteins,”Curr.Opin.Struc.Biol.7:463-469(1997)，其均以引用的方式整体并入本文)。预想本发明的结合结构域至少包含任何上述结合结构域中结合于靶标分子上的给定靶标表位或给定靶标位点/与靶标分子上的给定靶标表位或给定靶标位点相互作用所需的所述部分。设想上述结合结构域供体的结合结构域的特征在于这些供体中负责结合对应靶标的那部分，即当该部分从结合结构域供体去除时，供体丧失其结合能力。“丧失”意指当与结合供体相比时，结合能力的至少50％减少。定位这些结合位点的方法为所属领域中众所周知的，因此其在熟练人员定位(locate/map)结合结构域供体的结合位点并且由此从对应的结合结构域供体“衍生”该结合结构域的标准知识内。结合分子的第一和/或第二结合结构域可包含免疫球蛋白，例如抗体、其片段或其衍生物。结合分子的第一和/或第二结合结构域可替代地包含替代骨架。在一个实施方案中，结合分子可包含一个或多个免疫球蛋白结合结构域和一个或多个替代骨架结合结构域。如本文所用，术语“替代骨架”是指典型地具有减少的尺寸(例如，少于约200个氨基酸)的单链多肽骨架，其含有与允许插入、缺失或其它取代的具有高构象容限的可变结构域缔合的高度结构化核心。这些骨架是基于常规Ig骨架，或源于完全无关蛋白。这些可变结构域可经过修饰以产生针对任何靶向蛋白的新颖结合界面。例如，骨架可源于蛋白A(具体说来其Z-结构域(亲和体))、ImmE7(免疫蛋白)、BPTI/APPI(Kunitz结构域)、Ras结合蛋白AF-6(PDZ-结构域)、北非蝎毒素(蝎子毒素)、CTLA-4、Min-23(打结素)、脂质运载蛋白(脂笼蛋白)、新制癌菌素、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复序列结构域或硫氧还蛋白(Skerra,A.,“AlternativeNon-AntibodyScaffoldsforMolecularRecognition,”Curr.Opin.Biotechnol.18:295-304(2005)；Hosse等人,“ANewGenerationofProteinDisplayScaffoldsforMolecularRecognition,”ProteinSci.15:14-27(2006)；Nicaise等人,“AffinityTransferbyCDRGraftingonaNonimmunoglobulinScaffold,”ProteinSci.13:1882-1891(2004)；Nygren和Uhlen,“ScaffoldsforEngineeringNovelBindingSitesinProteins,”Curr.Opin.Struc.Biol.7:463-469(1997)，其均以引用的方式整体并入本文))。替代骨架的结构会变化，但优选地具有人类起源以用于作为治疗剂开发的那些。基于非Ig的骨架包括但不限于脂质运载蛋白(以“脂笼蛋白”使用)、锚蛋白重复序列(AR)蛋白(以“设计的AR蛋白”或“DARPin”使用)、纤连蛋白结构域衍生物(以“脂联素”使用)和亲合力多聚体(还称作“亲合多聚体”)。脂笼蛋白(包含脂质运载蛋白骨架的工程改造的蛋白骨架)为用于本发明的结合分子的合适的基于非Ig的替代骨架。脂质运载蛋白(转运如类固醇、后胆色素、类视色素和脂质的小疏水性分子的蛋白家族)为脂笼蛋白的亲本蛋白结构。脂质运载蛋白具有有限的序列同源性，但共享基于八个反向平行b-筒的通用三级结构架构。这些蛋白含有在刚性β-筒结构上建立的四个暴露环。示例性脂质运载蛋白具有约160个氨基酸至约180个氨基酸的结构域尺寸并且已经开发为在所述四个暴露环内含有16个可接近氨基酸的随机化。包含锚蛋白重复序列(AR)蛋白的蛋白为用于本发明的结合分子的另一种合适的基于非Ig的替代骨架。AR蛋白包含由通过环分离的两个α螺旋组成的33个氨基酸的蛋白基序，该重复序列介导蛋白-蛋白相互作用。设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)包含由基于人类AR蛋白的合理设计策略(例如，多序列比对和统计学分析)产生的工程改造的蛋白骨架。DARPin可使用基于具有七个随机化位置的33个氨基酸的AR基序建构的组合AR文库产生。DARPin文库优先使用核糖体展示来筛选，并且文库成员典型地在大肠杆菌中良好产生，不聚集，并且展示高热力学稳定性。优选地，DARPin含有两个至四个侧接N端和C端加帽基序的这些基序以遮蔽疏水区并且允许增加的溶解性。源于纤连蛋白III(FN3)结构域的蛋白也可用于产生合适的基于非Ig的替代骨架。例如，人类纤连蛋白的第十个纤连蛋白III型结构域(FN10)对应于具有七个β-链和三个连接环的β-夹层，该连接环显示在无二硫桥的情况下与Ig结构域的结构同源性。一方面，FN10的连接环(各自为约15个至21个氨基酸长)可随机化并且所述结构域在噬菌体和酵母上均展示以选择具有所需特性的骨架。脂联素(Adnexus，现为Bristol-Myers-Squibb)为使用以这种方式随机化并且展示的第10个FN3结构域产生的示例性骨架。包含FN3结构域的替代示例性骨架为CentyrinTM。CentryrinsTM含有人类肌腱蛋白C(TNC)的FN3结构域的共有序列。CentyrinTM骨架具有具有与抗体可变结构域(即，CDR1、CDR2和CDR3)的结构同源性的环(即，DE、BC和FG)，并且为小(约10kDa)、简单且高度稳定的单一结构域蛋白，所述蛋白不含半胱氨酸、二硫化物或糖基化残基。这些分子具有卓越的生物物理特性(例如，大于100mg/mL表达、大于170mg/mL溶解度、大于82℃熔化温度、低的预测免疫原性和在血清中稳定超过一个月)，并且可针对改进的稳定性进行工程改造。因此，CentyrinsTM为用于本发明结合分子的源于FN结构域的合适替代骨架。在一个实施方案中，如本文所述的结合分子包含CentyrinTM或FN3结构域，该结构域包含氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者。本文所述的结合分子的示例性FN3结构域序列包括Luk17和Luk12(分别为SEQIDNO:14和SEQIDNO:22)。亲合多聚体结构也可用作蛋白骨架以产生合适的基于非Ig的替代骨架。亲合多聚体骨架是基于来自低密度脂蛋白(LRL)细胞表面受体的A-结构域的寡聚。优选地，亲合多聚体骨架包含A-结构域的普遍保守残基，A-结构域为约35个氨基酸长并且包含具有三个二硫桥的四个环。另外，本发明还涵盖包含选自例如纳米抗体、结构域抗体(dAb)、双特异性T细胞衔接器(BiTE)、双重亲和重靶向蛋白(DART)和四价tANDem抗体(TandAb)的Ig样骨架的结合分子(参看例如Wurch等人,“NovelProteinScaffoldsasEmergingTherapeuticProteins:FromDiscoverytoClinicalProof-of-Concept,”TrendsinBiotechnology30(11):575-582(2012)，其以引用的方式整体并入本文)。结合分子还可为包含连接至替代骨架的抗体、其片段或衍生物的融合蛋白。在一个实施方案中，结合分子包含抗体、纤连蛋白结构域或抗体-纤连蛋白结构域融合蛋白。例如，一方面，本发明的结合分子包含能够结合于如SdgB-糖基化含SDR蛋白的糖基化葡萄球菌表面蛋白的全长抗体或抗体片段，并且进一步包含能够结合于如LukAB、LukD或LukE的葡萄球菌白细胞毒素的替代骨架。应了解，葡萄球菌的临床分离菌株可在不同菌株当中具有变化序列。因此，一方面，替代骨架包含能够结合于具有与SEQIDNO:10具有80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的LukA、具有与SEQIDNO:11具有80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的LukB、具有与SEQIDNO:12具有80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的LukD或具有与SEQIDNO:13具有80％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的LukE的FN3结构域。一方面，结合分子的替代骨架包含能够结合于具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA、具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB、具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD或具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE的FN3结构域。另一方面，结合分子的替代骨架包含能够结合包含具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA和具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB的LukAB复合物的FN3结构域。另一方面，结合分子的替代骨架包含能够结合包含具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD和具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE的LukED复合物的FN3结构域。设想结合分子通过噬菌体展示或文库筛选方法制造(或可通过所述方法获得)。或者，结合分子通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的CDR序列接枝至骨架(例如，如本文所公开的骨架)中来制造。术语“能够结合于”、“结合于”、“特异性地识别”、“针对”和“与……反应”意指根据本发明，结合分子能够与表位的一个或多个氨基酸特异性地相互作用。术语“不能特异性结合”意指本发明的结合结构域不在所测试的条件下结合另一蛋白或抗原，例如非靶标蛋白。例如，在本公开中，蛋白A结合使用基于板的直接ELISA分析在实施例中所规定的条件下测量，该分析对于含有CH3突变H435R/Y436F的结合分子(例如构建体3-7)未检测到与蛋白A的明显结合。然而，如果用100-1000倍过量的蛋白执行相同实验，那么可检测到一些蛋白A结合(非特异性)。这一普遍原理在本文所提供的条件下还适用于人类FcγRI结合(或其缺乏)和Sbi结合(或其缺乏)。“蛋白”(包括其片段，优选地生物活性片段，和肽，通常具有少于30个氨基酸)包含经由共价肽键彼此偶联的一个或多个氨基酸(产生氨基酸的链)。如本文所用的术语“多肽”为超过30个偶联在一起的氨基酸的链。多肽可形成多聚体，如二聚体、三聚体和高碳寡聚物，即由超过一个多肽分子组成。形成所述二聚体、三聚体等的多肽分子可为同一或非同一的。多聚体的相应高级结构因此称为同型二聚体或异质二聚体、同型三聚体或异质三聚体等。异质多聚体的实例为抗体分子，其天然存在形式由两个同一的轻多肽链和两个同一的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白”还称为天然修饰的多肽/蛋白，其中修饰例如通过如糖基化、乙酰化、磷酸化等翻译后修饰来实现。当本文中提及“多肽”时，其也可经过化学修饰，如聚乙二醇化。修饰是本领域中众所周知的。术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地指具有其公认定义的氨基酸，如选自由以下组成的组的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(Ile或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)，不过必要时可使用修饰的、合成或罕见氨基酸。一般说来，氨基酸可分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电侧链(例如Asp、Glu)；带正电侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。如本文所用的术语“毒力因子”是指由细菌表达的分子，其使得所述细菌能够实现小生境在宿主中的定殖(包括粘附于细胞)、免疫逃避(即，宿主的免疫反应的逃避)、免疫抑制(即，宿主的免疫反应的抑制)、进入细胞中和离开细胞(如果病原体为细胞内病原体)和/或从宿主获得营养。毒力因子可在如噬菌体的可动遗传因子上编码，并且可容易地通过水平基因转移传播。金黄色葡萄球菌毒力因子的非限制性实例包括透明质酸酶、蛋白酶、凝结酶、脂肪酶、脱氧核糖核酸酶、肠毒素和其它毒素，例如作用于细胞膜的毒素，如LukAB、LukD或LukE。出于本发明的目的，葡萄球菌表面蛋白(如含SDR蛋白，例如ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE、SdrF、SdrG和SdrH)也被视为毒力因子。术语“抗体”的定义包括如单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人类化抗体和人类抗体的实施方案。除了全长抗体以外，该定义还包括抗体衍生物和抗体片段，尤其如Fab片段。抗体片段或衍生物进一步包含F(ab′)2、Fv、scFv片段或单一结构域抗体(如结构域抗体)或纳米抗体、单一可变结构域抗体或仅包含一个可变结构域的免疫球蛋白单一可变结构域，该一个可变结构域可能为VHH、VH或VL，其独立于其它V区或结构域特异性地结合抗原或表位；参看例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringharborPress(1988)；Harlow和Lane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1999)；Kontermann和Dübel,ANTIBODYENGINEERING,Springer,第2版2010；和Little,RECOMBINANTANTIBODIESFORIMMUNOTHERAPY,CambridgeUniversityPress2009，其各自以引用的方式整体并入本文。该术语还包括双功能抗体或双重亲和重靶向(DART)抗体。进一步设想(双特异性)单链双功能抗体、串联双功能抗体(Tandab)、“微抗体”(其由如下结构例示：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2)、“FcDART”和“IgGDART”、多功能抗体(如三功能抗体)。免疫球蛋白单一可变结构域不仅涵盖分离的抗体单一可变结构域多肽，而且涵盖包含抗体单一可变结构域多肽序列的一种或多种单体的较大多肽。多种程序为所属领域中已知的并且可用于制造所述抗体和/或片段。因此，(抗体)衍生物可通过肽模拟物制造。此外，关于单链抗体的制造所述的技术(尤其参看Ladner等人的美国专利号4,946,778，Kontermann和Dübel,ANTIBODYENGINEERING,Springer,第2版2010，和Little,RECOMBINANTANTIBODIESFORIMMUNOTHERAPY,CambridgeUniversityPress,2009，其各自以引用的方式整体并入本文)可经调适以制造对所选的多肽具特异性的单链抗体。另外，转基因动物可用于表达对本发明的多肽和融合蛋白具特异性的人类化抗体。关于单克隆抗体的制备，可使用提供由持续细胞系培养物制造的抗体的任何技术。关于该技术的实例包括杂交瘤技术(和Milstein,“ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity,”Nature256:495-497(1975)，其以引用的方式整体并入本文)、三源杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,“TheProductionofMonoclonalAntibodiesFromHumanLymphocytes,”ImmunologyToday4:72-79(1983)，其以引用的方式整体并入本文)和制造人类单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等人,MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss,Inc.,第77-96页(1985)，其以引用的方式整体并入本文)。如BIAcore系统中所用的表面等离子体共振可用于增加结合于靶标多肽的表位的噬菌体抗体(如CD3ε)的效率(Schier等人,“EfficientInVitroAffinityMaturationofPhageAntibodiesUsingBIAcoreGuidedSelections,”HumanAntibodiesHybridomas7:97-105(1996)；Malmborg等人,“BIAcoreasaToolinAntibodyEngineering,”J.Immunol.Methods183:7-13(1995)，其各自以引用的方式整体并入本文)。在本发明的背景中还设想术语“抗体”包含抗体构建体，其可如下文所述在宿主中表达，例如可尤其经由病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。此外，如本文所用的术语“抗体”还涉及本文所述的抗体的衍生物或变体，其展示与该抗体相同的特异性。“抗体变体”的实例包括非人类抗体的人类化变化、“亲和成熟”抗体(参看例如Hawkins等人,“SelectionofPhageAntibodiesbyBindingAffinity.MimickingAffinityMaturation,”J.Mol.Biol.254:889-896(1992)和Lowman等人,“SelectingHigh-AffinityBindingProteinsbyMonovalentPhageDisplay,”Biochemistry30:10832-10837(1991)，其各自以引用的方式整体并入本文)和具有改变的效应子功能的抗体突变体(参看例如Winter等人的美国专利号5,648,260，Kontermann和Dübel,ANTIBODYENGINEERING,Springer,第2版2010，和Little,RECOMBINANTANTIBODIESFORIMMUNOTHERAPY,CambridgeUniversityPress,2009，其各自以引用的方式整体并入本文)。一种制造抗体的示例性方法包括筛选蛋白表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如Ladner等人的美国专利号5,223,409；Smith,“FilamentousFusionPhage:NovelExpressionVectorsThatDisplayClonedAntigensontheVirionSurface,”Science228:1315-1317(1985)；Clackson等人,“MakingAntibodyFragmentsUsingPhageDisplayLibraries,”Nature352:624-628(1991)中，其各自以引用的方式整体并入本文。除了使用展示文库以外，规定抗原也可用于免疫非人类动物，例如啮齿动物、小鼠、仓鼠或大鼠。例如，有可能用人类Ig基因座的大片段工程改造缺乏小鼠抗体产生的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可制造并且选择源于具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参看例如XENOMOUSETM,Green等人,“Antigen-SpecificHumanMonoclonalAntibodiesFromMiceEngineeredWithHumanIgHeavyandLightChainYACs,”NatureGenetics7:13-21(2004)，Jakobovits等人的US2003-0070185，Kucherlapati等人的WO96/34096，和Kucherlapati等人的WO96/33735，其各自以引用的方式整体并入本文。抗体或其片段也可通过人类T细胞表位的特异性缺失或由Carr等人的WO98/52976和Carr等人的WO00/34317中公开的方法“去免疫化”来修饰，该专利以引用的方式整体并入本文。简单地说，抗体的重链和轻链可变结构域可针对结合于MHCII类的肽进行分析；这些肽表示潜在T细胞表位(如Carr等人的WO98/52976和Carr等人的WO00/34317中所定义，这两个专利均以引用的方式整体并入本文)。关于潜在T细胞表位的检测，可应用称作“肽穿线”的计算机建模方法，并且另外，可针对存在于VH和VL序列中的基序搜索人类MHCII类结合肽的数据库，如Carr等人的WO98/52976和Carr等人的WO00/34317中所述，这两个专利均以引用的方式整体并入本文。这些基序结合于18种主要的MHCII类DR同种异型中的任一者，并且因此构成潜在T细胞表位。所检测的潜在T细胞表位可通过取代可变结构域中的少量氨基酸残基或优选地通过单一氨基酸取代来消除。典型地，进行保守取代。通常，但并非排外地，可使用人类生殖系抗体序列中的位置的常见氨基酸。人类生殖系序列例如公开于Tomlinson等人,“TheRepertoireofHumanGermlineVHSequencesRevealsAboutFiftyGroupsofVHSegmentsWithDifferentHypervariableLoops,”J.Mol.Biol.227:776-798(1992)；Cook等人,“TheHumanImmunoglobulinVHRepertoire,”Immunol.Today16(5):237-242(1995)；和Tomlinson等人,“TheStructuralRepertoireoftheHumanVKappaDomain,”EMBOJ.14:14:4628-4638(1995)中，其各自以引用的方式整体并入本文。VBASE目录提供了人类免疫球蛋白可变区序列的全面目录(由Tomlinson,LA.等人MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UK汇编)。这些序列可用作人类序列的来源，例如关于构架区和CDR。也可使用共有人类构架区，举例来说，如描述于Knappik等人的美国专利号6,300,064中，此专利以引用的方式整体并入本文。VH和VL的配对一起形成单一抗原结合位点。最接近VH的恒定重链(CH)结构域是指定为CH1。每个L链通过一个共价二硫键连接于H链，而两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接，视H链同型而定。VH和VL结构域由四个称为构架区的相对保守序列区域(FR1、FR2、FR3和FR4)组成，这些区域形成三个高变序列区域(互补决定区，CDR)的骨架。CDR含有负责抗体与抗原的特异性相互作用的残基的大部分。CDR是称为CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR组分是称为H1、H2和H3，而轻链上的CDR组分是称为L1、L2和L3。术语“可变”是指免疫球蛋白结构域中展现其序列的可变性并且参与决定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分(即，“可变结构域”或“V区”)。可变性未均匀地分布于抗体的可变结构域中；其集中于重链和轻链可变区中的每一个的子结构域中。这些子结构域称作“高变”区或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的较保守(即，非高变)部分称作“构架”区(FRM)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区，FRM区大部分采用β-折叠配置，通过三个高变区连接，高变区形成连接所述β-折叠结构并且在一些情况下形成所述β-折叠结构的一部分的环。每个链中的高变区通过所述FRM紧密接近地结合在一起并且与来自另一链的高变区一起促进形成抗原结合位点(参看Wu和Kabat,“AnAnalysisoftheSequencesoftheVariableRegionsofBenceJonesProteinsandMyelomaLightChainsandtheirImplicationsforAntibodyComplementarity,”J.Exp.Med.132:211-250(1970)，其以引用的方式整体并入本文)。恒定结构域并未直接参与抗原结合，但展现多种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性和补体激活。术语“高变区”(还称作“互补决定区”或CDR)当用于本文中时是指抗体的氨基酸残基，其在免疫球蛋白的V区结构域内(通常为三个或四个极具序列可变性的短区)，其形成抗原结合位点并且为抗原特异性的主要决定子。存在至少两种用于鉴定CDR残基的方法：(1)基于交叉物种序列可变性的方法(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版NIH公布号91-3242(1991)，其以引用的方式整体并入本文)；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Chothia等人,“CanonicalStructuresFortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，其以引用的方式整体并入本文)。然而，就两种残基鉴定技术定义重叠区而非同一区来说，其可组合以定义杂合CDR。然而，一般说来，CDR残基优选地根据Kabat(编号)系统来鉴定。术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“抗体结合区”当用于本文中时是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。如上文所提及，抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL)和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，具有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“BindingActivitiesofaRepertoireofSingleImmunoglobulinVariableDomainsSecretedFromEscherichiacoli,”Nature341:544-546(1989)，其以引用的方式整体并入本文)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)，例如源于scFV-文库。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但其可通过合成连接子使用重组方法接合，合成连接子使得其被制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))(参看例如Huston等人,“ProteinEngineeringofAntibodyBindingSites:RecoveryofSpecificActivityinanAnti-DigoxinSingle-ChainFvAnalogueProducedinEscherichiacoli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)，其以引用的方式整体并入本文)。这些抗体片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式评估所述片段的功能。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自大致均匀抗体的群体的抗体，即构成该群体的个别抗体为同一的，除了可少量存在的可能的天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。单克隆抗体为高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与典型地包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂形成对比，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。除了其特异性，该单克隆抗体也为有利的，因为其通过杂交瘤培养合成，未受其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体获自抗体的大致均匀群体的特性，并且不应解释为需要通过任何特定方法制造所述抗体。例如，欲根据本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等人,“ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity,”Nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法制造，或可通过重组DNA方法制造(参看例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)，其各自以引用的方式整体并入本文。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等人,“MakingAntibodyFragmentsUsingPhageDisplayLibraries,”Nature352:624-628(1991)和Marks等人,“By-PassingImmunization.HumanAntibodiesFromV-geneLibrariesDisplayedonPhage,”J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库分离，这些文献中的每个以引用的方式整体并入本文。本发明的单克隆抗体特异性地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的对应序列同一或同源，而该链的剩余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的对应序列同一或同源，以及抗体的片段，只要其展现所需生物活性(Cabilly等人的美国专利号4,816,567；Morrison等人,“ChimericHumanAntibodyMolecules:MouseAntigen-BindingDomainsWithHumanConstantRegionDomains,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984)，其均以引用的方式整体并入本文)。本文所关注的嵌合抗体包括包含源于非人类灵长类动物(例如旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人类恒定区序列的“灵长类化”抗体。单克隆抗体可获自非人类动物，并且接着进行修饰，例如人类化、去免疫化、嵌合，可使用所属领域中已知的重组DNA技术制造。已经描述多种用于制造嵌合抗体的方法。参看例如Morrison等人,“ChimericHumanAntibodyMolecules:MouseAntigen-BindingDomainsWithHumanConstantRegionDomains,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851(1985)；Takeda等人,“ConstructionofChimericProcessedImmunoglobulinGenesContainingMouseVariableandHumanConstantRegionSequences,”Nature314:452(1985)；Cabilly等人的美国专利号4,816,567；Boss等人的美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人的EP0171496；Morrison等人的EP0173494，Neuberger等人的GB2177096，其各自以引用的方式整体并入本文。非人类(例如鼠科动物)抗体的“人类化”形式为主要为人类序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它抗原结合子序列)，其含有源于非人类免疫球蛋白的最小序列。在极大程度上，人类化抗体为人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区(也为CDR)的残基由来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)的高变区的残基置换，非人类物种如小鼠、大鼠或兔。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由对应非人类残基置换。此外，如本文所用的“人类化抗体”也可包含在接受者抗体和供体抗体中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。人类化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于进一步细节，参看Jones等人,“ReplacingtheComplementarity-DeterminingRegionsinaHumanAntibodyWithThoseFromaMouse,”Nature321:522-525(1986)和Reichmann等人,“ReshapingHumanAntibodiesforTherapy,”Nature332:323-329(1988)，其各自以引用的方式整体并入本文。人类化抗体还可例如使用表达人类重链和轻链基因但不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的转基因小鼠来制造。Winter描述了一种示例性CDR移植方法，该方法可用于制造本文所述的人类化抗体(Winter等人的美国专利号5,225,539，其以引用的方式整体并入本文)。特定人类抗体的所有CDR均可用非人类CDR的至少一部分置换，或CDR中仅一些可用非人类CDR置换。仅有必要置换使人类化抗体结合于预定抗原所需的数目的CDR。人类化抗体或其片段可例如通过置换Fv可变结构域中未直接参与抗原与来自人类Fv可变结构域的相等序列的结合的序列而产生。用于产生人类化抗体或其片段的示例性方法由Morrison,SL.,“TransfectomasProvideNovelChimericAntibodies,”Science229:1202-1207(1985)；Queen等人的美国专利号5,585,089；Queen等人的美国专利号5,693,761；Queen等人的美国专利号5,693,762；Adair等人的美国专利号5,859,205；和Carter等人的美国专利号6,407,213提供，这些文献中的每个以引用的方式整体并入本文。那些方法包括分离、操纵和表达编码来自重链或轻链中的至少一种的免疫球蛋白Fv可变结构域的全部或一部分的核酸序列。核酸可获自如上文所述产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤，以及获自其它来源。编码人类化抗体分子的重组DNA可接着克隆至适当表达载体中。人类化抗体可通过引入保守取代、保守序列取代、生殖系取代和/或回复突变来优化。改变的免疫球蛋白分子可通过所属领域中已知的数种技术中的任一种来制备(例如Teng等人,“ConstructionandTestingofMouse--HumanHeteromyelomasforHumanMonoclonalAntibodyProduction,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:7308-7312(1983)；Kozbor等人,“TheProductionofMonoclonalAntibodiesfromHumanLymphocytes,”ImmunologyToday4:72-79(1983)；Olsson等人,“Human--HumanMonoclonalAntibody-ProducingHybridomas:TechnicalAspects,”Meth.Enzymol.92:3-16(1982)，其各自以引用的方式整体并入本文)，并且可根据Winter的EP239400的教导来制备，其以引用的方式整体并入本文。术语“人类抗体”包括具有大致对应于所属领域中已知的人类生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体，人类生殖系免疫球蛋白序列包括例如由Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版NIH公布号91-3242(1991)所述的那些，这些文献以引用的方式整体并入本文。本发明的人类抗体可包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR并且具体说来CDR3中。人类抗体可具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个用不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基置换的位置。“双特异性”或“双功能”抗体或免疫球蛋白为具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人造杂合抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体可通过多种方法制造，该方法包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接(参看例如Songsivilai和Lachmann,“BispecificAntibody:AToolforDiagnosisandTreatmentofDisease,”Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)，其以引用的方式整体并入本文)。所属领域的技术人员已知的多种方法可用于获得抗体或其抗原结合片段。例如，抗体可使用重组DNA方法制造(Cabilly的美国专利号4,816,567，其以引用的方式整体并入本文)。单克隆抗体也可根据已知方法通过产生杂交瘤来制造(参看例如Kohler等人,“ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity,”Nature256:495(1975)，其以引用的方式整体并入本文)。以这种方式形成的杂交瘤接着使用标准方法，如酶联免疫吸附分析(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORETM)分析来筛选，以鉴定一种或多种产生与规定抗原特异性地结合的抗体的杂交瘤。任何形式的规定抗原均可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段以及其抗原肽。术语“CDR”和其复数形式“CDRs”是指互补决定区(CDR)，其中三者构成轻链可变区的结合特性(CDRL1、CDRL2和CDRL3)并且三者构成重链可变区的结合特性(CDRH1、CDRH2和CDRH3)。CDR有助于抗体分子的功能活性并且通过包含骨架或构架区的氨基酸序列分离。精确定义的CDR边界和长度经受不同分类和编号系统。CDR可因此通过Kabat、Chothia、接触或任何其它边界定义来提及。尽管有不同边界，但这些系统各自在构成可变序列内的所谓的“高变区”的部分中具有一些程度的重叠。根据这些系统的CDR定义可因此在长度和边界区域方面相对于相邻构架区不同。参看例如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版NIH公布号91-3242(1991)；Chothia等人,“CanonicalStructuresFortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901(1987)；和MacCallum等人,“Antibody-AntigenInteractions:ContactAnalysisandBindingSiteTopography,”J.Mol.Biol.262:732(1996))，其各自以引用的方式整体并入本文。典型地，CDR形成可归类为典型结构的环结构。术语“典型结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主要链构象。由比较结构研究，已经发现六种抗原结合环中的五种仅具有有限的可用构象谱系。每个典型结构的特征可在于多肽骨架的扭转角。抗体之间的代理环可因此具有极其类似的三维结构，尽管在环的大多数部分中存在高氨基酸序列可变性(Chothia等人,“CanonicalStructuresFortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901(1987)；Chothia等人,“ConformationsofImmunoglobulinHypervariableRegions,”Nature342:877(1989)；Martin和Thornton,“StructuralFamiliesinLoopsofHomologousProteins:AutomaticClassification,ModellingandApplicationtoAntibodies,”J.Mol.Biol.263:800(1996)，其各自以引用的方式整体并入本文)。此外，在所采用的环结构与围绕该结构的氨基酸序列之间存在关系。特定典型类别的构象通过环的长度和停留于所述环内以及保守构架内(即，环的外部)的关键位置处的氨基酸残基决定。对特定典型类别的指派可因此基于这些关键氨基酸残基的存在来进行。术语“典型结构”也可包括关于抗体的线性序列的考虑，举例来说，如由Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版NIH公布号91-3242(1991)编入目录，其以引用的方式整体并入本文。Kabat编号方案(系统)为用于以一致方式对抗体可变结构域的氨基酸残基编号的广泛采用标准并且为应用于本发明的优选方案，如本文中别处也有提及。额外结构考虑也可用于确定抗体的典型结构。例如，不完全由Kabat编号反映的那些差异可通过Chothia等人的编号系统描述和/或通过例如结晶学和两维或三维计算机建模的其它技术披露。因此，给定抗体序列可放入典型类别中，该典型类别尤其允许鉴定适当底盘序列(例如，基于在文库中包括多种典型结构的期望)。如由Chothia等人,“CanonicalStructuresFortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901(1987)(其以引用的方式整体并入本文)所述的抗体氨基酸序列的Kabat编号和结构考虑以及其牵连用于建构抗体结构的典型方面描述于文献中。CDR3典型地为抗体结合位点内分子多样性的最大来源。举例来说，H3可短到两个氨基酸残基或超过26个氨基酸。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维配置在所属领域中为众所周知的。关于抗体结构的回顾，参看Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,Harlow等人编,1988，其以引用的方式整体并入本文。所属领域的技术人员将认识到每个亚单位结构(例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构)包含活性片段，例如VH、VL或CDR亚单位中结合抗原的部分(即，抗原结合片段)，或例如CH亚单位中结合于和/或激活例如Fc受体和/或补体的部分。CDR典型地是指KabatCDR，如SequencesofProteinsofimmunologicalInterest,USDepartmentofHealthandHumanServices(1991),Kabat等人编(其以引用的方式整体并入本文)中所述。用于表征抗原结合位点的另一标准是指如Chothia(参看例如Chothia等人,“StructuralRepertoireoftheHumanVHSegments,”J.Mol.Biol.227:799-817(1987)；和Tomlinson等人,“TheStructuralRepertoireoftheHumanVKappaDomain,”EMBOJ.14:4628-4638(1995)，其各自以引用的方式整体并入本文)所述的高变环。另一标准为由OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。一般来说，参看例如ProteinSequenceandStructureAnalysisofAntibodyVariableDomains.AntibodyEngineeringLabManual,Duebel和Kontermann(编),Springer-Verlag，其以引用的方式整体并入本文)。关于KabatCDR所述的实施方案或者可使用关于Chothia高变环或AbM定义的环类似描述的关系来执行。在组装和体细胞突变后抗体基因的序列高度变化，并且估计这些变化的基因编码1010种不同的抗体分子(ImmunoglobulinGenes,第2版,Jonio等人编,AcademicPress,1995，其以引用的方式整体并入本文)。因此，免疫系统提供免疫球蛋白的谱系。术语“谱系”是指完全地或部分地源于编码至少一种免疫球蛋白的至少一个序列的至少一个核苷酸序列。该序列可通过重链的V、D和J区段和轻链的V和J区段的体内重排而产生。或者，该序列可由细胞回应于该重排发生(例如体外刺激)而产生。或者，所述序列的部分或全部可通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其它方法获得，参看例如Hoogenboom等人的美国专利号5,565,332，其以引用的方式整体并入本文。谱系可仅包括一个序列或可包括多个序列，包括在遗传多样性集合中的序列。术语“构架区”是指抗体可变区中存在于更具趋异性(即，高变)CDR之间的公认部分。该构架区典型地称作构架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)并且提供用于在三维空间中呈递六个CDR(三个来自重链并且三个来自轻链)的骨架，以形成抗原结合表面。如本文所用的术语“纤连蛋白III型(FN3)结构域”(FN3结构域)是指经常存在于包括纤连蛋白、肌腱蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶的蛋白中的结构域(Bork和Doolittle,“ProposedAcquisitionofanAnimalProteinDomainbyBacteria,”Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:8990-8994(1992)；Meinke等人,“Cellulose-BindingPolypeptidesFromCellulomonasfimi:EndoglucanaseD(CenD),aFamilyAbeta-1,4-Glucanase,”J.Bacteriol.175:1910-1918(1993)；Watanabe等人,“GeneCloningofChitinaseA1FromBacilluscirculansWL-12RevealeditsEvolutionaryRelationshiptoSerratiachitinaseandtotheTypeIIIHomologyUnitsofFibronectin,”J.Biol.Chem.265:15659-15665(1990)，其各自以引用的方式整体并入本文)。示例性FN3结构域为存在于人类肌腱蛋白C中的15种不同FN3结构域、存在于人类纤连蛋白(FN)中的15种不同FN3结构域和如例如Jacobs等人的美国专利公布号2010/0216708(其以引用的方式整体并入本文)中所述的非天然合成FN3结构域。个别FN3结构域由结构域数目和蛋白名称提及，例如肌腱蛋白的第3个FN3结构域(TN3)或纤连蛋白的第10个FN3结构域(FN10)。如本文所用的术语“取代(substituting)”或“取代(substituted)”或“突变(mutating)”或“突变(mutated)”是指多肽或聚核苷酸序列中改变、缺失或插入一个或多个氨基酸或核苷酸以产生该序列的变体。如本文所用的术语“随机化(randomizing)”或“随机化(randomized)”或“多样化(diversified)”或“多样化(diversifying)”是指在聚核苷酸或多肽序列中进行至少一种取代、插入或缺失。如本文所用的“Tencon”是指具有以SEQIDNO:1显示的序列并且描述于Jacobs等人的美国专利公布号US2010/0216708(其以引用的方式整体并入本文)中的合成纤连蛋白III型(FN3)结构域。术语“文库”是指变体的集合。文库可由多肽或聚核苷酸变体构成。术语“载体”意指能够在生物系统内复制或可在所述系统中移动的聚核苷酸。载体聚核苷酸典型地含有用于促进生物系统中这些聚核苷酸的复制或维持的元件，如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记物。生物系统的实例可包括细胞、病毒、动物、植物和利用能够复制载体的生物组分的重构生物系统。包含载体的聚核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合物。载体可用于生物系统中或重构生物系统中以指导由存在于所述载体中的聚核苷酸序列编码的多肽的翻译。因此，如本文所用的“载体”广泛地是指用于在包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞的任何细胞中组成性地或诱导性地体外或体内表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括保持游离体或整合至宿主细胞基因组中的表达系统。该表达系统可具有自主复制或无法自主复制(即仅驱动细胞中的短暂表达)的能力。该术语包括仅含有重组核酸的转录所需的最小元件的重组表达盒。本申请大体上涉及结合于至少两种不同细菌毒力因子的多特异性分子，用于制造这些结合分子的方法，和这些结合分子用于检测或诊断、预防和/或治疗细菌感染的用途。具体说来，该结合分子包含至少两个结合结构域，例如抗体或抗体片段和替代骨架。第一结合结构域能够结合于糖基化葡萄球菌表面蛋白，优选地SdgB糖基化含SDR蛋白。第二结合结构域能够结合于葡萄球菌白细胞毒素，优选地LukAB、LukD或LukE。这些多特异性结合分子具有针对其结合的蛋白抗原的中和活性，即一旦结合分子结合于其靶标葡萄球菌蛋白，那么那些蛋白的活性大致或完全消除。因此，多特异性结合分子还具有针对葡萄球菌本身的中和或杀菌活性，并且因此可用于治疗和/或改善葡萄球菌感染，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌。本文中结合分子也可能够特异性地结合于葡萄球菌(和其它革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌)的一个或多个片段，尤其如源于葡萄球菌的一种或多种蛋白和/或(多)肽或一种或多种重组产生的葡萄球菌蛋白和/或多肽的制剂。关于治疗和/或预防葡萄球菌感染的方法，结合分子优选地能够特异性地结合于葡萄球菌的表面可接近蛋白。葡萄球菌的表面蛋白包括但不限于凝集因子(Clf)A和ClfB、SDR-蛋白(例如SdrC、SdrD、SdrE、SrdF、SdrG和SdrH)、蛋白A、Sbi、纤连蛋白结合蛋白(FnbA)和用于血小板的富丝氨酸粘附素(SraP)。在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中，所有含SDR蛋白的SDR结构域均通过至少两种糖基转移酶SdgA和SdgB显著糖基化，其防止这些蛋白由宿主蛋白酶降解，由此保留细菌宿主组织相互作用。这些糖修饰还表示显性抗体表位。优选地，结合分子结合于糖基化表面葡萄球菌蛋白，具体说来SdgB糖基化SDR蛋白(Hazenbos等人,“NovelStaphylococcalGlycosyltransferasesSdgAandSdgBMediateImmunogenicityandProtectionofVirulence-AssociatedCellWallProteins,”PLoSPathog.9(10):e1003653(2013)，其以引用的方式整体并入本文)。如本文所述，本文中结合分子可包含完整免疫球蛋白分子(如多克隆或单克隆抗体)或抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和至少含有免疫球蛋白中足以赋予与葡萄球菌或其片段的特异性抗原结合的片段的(多)肽。在某些实施方案中，本文中结合分子为人类单克隆抗体。一方面，第一结合结构域为全长抗体或抗体片段。优选地，全长抗体或抗体片段抵抗由裂解野生型IgG1的葡萄球菌蛋白酶(如在SEQIDNO:60内的残基222-237(EU编号)之间或残基处裂解野生型IgG1的葡萄球菌蛋白酶金黄色葡萄球菌V8蛋白酶)引起的蛋白水解降解。另一方面，全长抗体或抗体片段为人类、人类化或嵌合抗体或抗体片段。一方面，第一结合结构域包含具有选自VH区氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的组的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变(VH)区。另一方面，第一结合结构域包含具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的免疫球蛋白轻链可变(VL)区。或者，第一结合结构域包含(a)具有氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的VH区；和(b)具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的VL区。在一个实施方案中，第一结合结构域包含(1)具有氨基酸序列SEQIDNO:60的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:61的VL区；(2)具有氨基酸序列SEQIDNO:62的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:63的VL区；(3)具有氨基酸序列SEQIDNO:64的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:65的VL区；(4)具有氨基酸序列SEQIDNO:66的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:67的VL区；(5)具有氨基酸序列SEQIDNO:68的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:69的VL区；(6)具有氨基酸序列SEQIDNO:70的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:71的VL区；(7)具有氨基酸序列SEQIDNO:72的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:73的VL区；(8)具有氨基酸序列SEQIDNO:74的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:75的VL区；(9)具有氨基酸序列SEQIDNO:76的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:77的VL区；或(10)具有氨基酸序列SEQIDNO:78的VH区，和具有氨基酸序列SEQIDNO:79的VL区。本文所述的结合分子包含能够特异性地结合于包括例如双组份毒素的其它葡萄球菌分子的第二结合结构域。除了PVL(还称作杀白细胞素S/F-PV或LukSF-PV)和γ溶血素(HlgAB和HlgCB)以外，还已知由金黄色葡萄球菌产生的双组份白细胞毒素的谱系包括杀白细胞素E/D(“LukED”)、杀白细胞素A/B(“LukAB”)和杀白细胞素M/F(“LukMF”)。因此，这些双组份杀白细胞素的S类别子单位包括HlgA、HlgC、LukE、LukS-PV、LukA和LukM，并且F类别亚单位包括HlgB、LukD、LukF-PV、LukB和LukF’-PV。金黄色葡萄球菌S-和F-亚单位不具杀白细胞素特异性。也就是说，其可互换使得其它双组份组合可能在白血球中产生功能孔，极大地增加白细胞毒素的谱系(Meyer等人,“AnalysisoftheSpecificityofPanton-ValentineLeucocidinandGamma-HemolysinFComponentBinding,”Infect.Immun.77(1):266-273(2009)，其公开内容以引用的方式整体并入本文)。在一个实施方案中，本发明的结合分子结合于选自白细胞毒素A(LukA)、白细胞毒素B(LukB)、白细胞毒素AB(LukAB)、白细胞毒素D(LukD)、白细胞毒素E(LukE)、白细胞毒素ED(LukED)、Panton-Valentine杀白细胞素S(LukS-PV)、Panton-Valentine杀白细胞素F(LukF-PV)、Panton-Valentine杀白细胞素(LukSF/PVL)、γ溶血素A(HlgA)、γ溶血素C(HlgC)、γ溶血素B(HlgB)、γ溶血素AB(HlgAB)和γ溶血素BC(HlgBC)的一种或多种葡萄球菌白细胞毒素。在一个实施方案中，该结合分子结合于选自LukAB、LukD或LukE的一种或多种葡萄球菌白细胞毒素。在另一实施方案中，本文中结合分子能够特异性地结合于上述蛋白的片段，其中该片段至少包含由本文中结合分子识别的抗原决定子。如本文所用的“抗原决定子”为能够以足够高的亲和力结合于本文中结合分子以形成可检测的抗原-结合分子复合物的部分。在另一实施方案中，本文中结合分子能够特异性地结合于上述葡萄球菌白细胞毒素蛋白中含有中和表位的片段。结合于白细胞毒素蛋白的中和表位会消除或大致消除所述蛋白的活性。一方面，能够结合葡萄球菌白细胞毒素的第二结合结构域为替代骨架。优选地，第二结合结构域包含纤连蛋白III型(FN3)结构域，例如基于纤连蛋白III型(FN3)重复蛋白的共有序列的分离、重组和/或合成蛋白骨架。本发明的FN3骨架提供优于常规治疗剂的优势，如局部、口服或跨血脑屏障施用的能力、在大肠杆菌中表达从而允许随资源而变的蛋白表达相对哺乳动物细胞表达增加的能力、工程改造成结合于多个靶标或相同靶标的多个表位的双特异性分子的能力、结合于药物、聚合物和探针的能力、配制成高浓度的能力和该分子有效地穿透患病组织的能力。此外，FN3骨架相对于模拟抗体的可变区的其折叠具有多种抗体特性。例如，FN3结构域的定向使得FN3环能够类似于抗体互补决定区(CDR)暴露。该环区能够结合于细胞靶标并且可改变，例如亲和力成熟，以改进某些结合或相关特性。在一个实施方案中，本文所述的结合分子包含一个或多个FN3结构域。一方面，结合分子的FN3结构域源于Tencon的非天然存在FN结构域(SEQIDNO:1)。如同其它FN3结构域，Tencon具有β-夹层结构，该β-夹层结构具有由六个环(称作AB、BC、CD、DE、EF和FG环)连接的七个β-链(称作A、B、C、D、E、F和G)(Bork和Doolittle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8990-8992(1992)和Koide等人的美国专利号6,673,901，其以引用的方式整体并入本文)。此六个环中的三个(即，BC、DE和FG环)处于FN3结构域的顶部，并且这些环中的三个(即，AB、CD和EF环)处于该FN3结构域的底部。这些环跨SEQIDNO:1的氨基酸残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81或所述氨基酸残基周围。优选地，在SEQIDNO:1的残基22-28、51-54和75-81处或周围的环区针对在本文所述的结合分子中的结合特异性和亲和力发生改变。一方面，本文所述的结合分子包括一个或多个包含替代骨架的结合结构域，该替代骨架包含在SEQIDNO:1的残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和/或75-81处或周围的至少一个、至少两个或所有三个环。一方面，结合分子包括一个或多个包含替代骨架的结合结构域，所述替代骨架包含在SEQIDNO:1的残基22-28、51-54和75-81处或周围的至少一个、至少两个或所有三个环区。这些环区中的一个或多个用维持其作为骨架部分的序列的其它环区和/或其它链随机化以填充文库，并且可从对特定蛋白靶标具高亲和力的文库选择有效粘合剂。该环区中的一个或多个可类似于抗体CDR与靶标蛋白的相互作用与该蛋白相互作用。如上文所讨论，FN3结构域在分子的相对面上含有CDR样环的两个集合(即，BC、DE和FG环和AB、CD和EF环)。环的两个集合由形成FN3结构的中心的β-链分离。如同所述环，这些β-链可改变以增强结合特异性和亲和力。优选地，β链中的一些或全部表面暴露残基随机化而不影响(会最小程度地影响)骨架的固有稳定性。β-链中的一个或多个可与靶标蛋白相互作用。骨架中的β-链提供扁平结合表面(与含有相邻环的蛋白骨架中发现的弯曲结合表面相比)，该表面影响靶标蛋白或那些靶标蛋白上可由所述骨架有效地结合的特异性表位。一方面，本发明的结合分子包括包含替代骨架的结合结构域，该替代骨架包含一个或多个结合于细菌毒力因子(例如葡萄球菌白细胞毒素)的β-链。一方面，结合分子的第二结合结构域包含结合于具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA、具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB、具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD或具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE的FN3结构域。或者，结合分子的第二结合结构域包含结合于包含具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA和具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB的LukAB复合物和/或包含具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE和具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD的LukED复合物的FN3结构域。一方面，结合分子的第二结合结构域与具有氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者的FN3结构域竞争结合于(i)具有氨基酸序列SEQIDNO:10的LukA；(ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:11的LukB；(iii)具有氨基酸序列SEQIDNO:12的LukD；和/或(iv)具有氨基酸序列SEQIDNO:13的LukE。另一方面，结合分子包含(a)第一结合结构域，其包含(i)具有氨基酸序列SEQIDNO:60、62、64或66的VH区；和(ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:61、63、65或67的VL区；和(b)第二结合结构域，其包含氨基酸序列SEQIDNO:14-59或SEQIDNO:113-666中任一者。在一个实施方案中，第二结合结构域包含氨基酸序列SEQIDNO:14或SEQIDNO:22。另一方面，结合分子包含一个或多个额外结合结构域，例如第三、第四、第五等结合结构域。额外结合结构域能够结合于与该结合分子的第一结合结构域所结合不同的糖基化葡萄球菌表面蛋白，并且能够结合于与该结合分子的第二结合结构域所结合不同的葡萄球菌白细胞毒素。换句话说，结合分子的每个接合结构域结合于独特抗原。结合分子的额外结合结构域可为免疫球蛋白结构域、替代骨架结构域或其组合。一方面，结合分子不展现与其它葡萄球菌或宿主(例如人类)蛋白抗原的非特异性结合。例如，一方面，结合分子不能特异性结合于葡萄球菌蛋白A或免疫球蛋白的第二结合蛋白(Sbi)。另一方面，结合分子不能特异性结合于FcγRI，具体说来人类FcγRI。另一方面，结合分子确实保留特异性结合于FcRn的能力。本公开的结合分子可并入其它亚单位，例如经由共价相互作用。抗体恒定区的全部或一部分可连接于该结合分子以赋予抗体样特性，例如补体活性(CDC)、半衰期等。例如，效应子功能可例如通过修饰Clq结合和/或FcγR结合并且由此改变补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性来提供和/或控制。“效应子功能”负责激活或削弱生物活性(例如，受试者中)。效应子功能的实例包括但不限于：Clq结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。效应子功能可需要Fc区与结合结构域(例如蛋白骨架环)组合并且可使用多种分析(例如Fc结合分析、ADCC分析、CDC分析等)来评估。另外，毒素结合物、白蛋白或白蛋白粘合剂、聚乙二醇(PEG)分子可连接于结合分子用于所需特性。这些融合物中的任一种均可通过标准技术，例如通过由使用公开可得基因序列建构的重组融合基因表达结合分子来产生。本公开的结合分子可以单体形式呈单特异性使用或以多聚体形式呈双特异性或多特异性(关于不同蛋白靶标或相同蛋白靶标上的表位)使用。连接可为共价或非共价。例如，二聚体双特异性结合分子具有一个对第一靶标蛋白或表位具特异性的亚单位和对第二靶标蛋白或表位具特异性的第二亚单位。结合分子亚单位可以多种构象接合，构象可增加价态并且因此增加抗原结合的亲合力。本公开的结合分子也可包含连接肽，该连接肽在所属领域中已知连接蛋白或多肽结构域与生物活性肽，从而产生融合蛋白。该连接肽可用于由两种不相关蛋白制造功能性融合蛋白，其保留两种蛋白的活性。例如，特异性地结合于白细胞毒素的FN3结构域可借助于连接子融合至能够结合于葡萄球菌表面蛋白的抗体、抗体片段、scFv或肽配体以形成融合蛋白，该融合蛋白结合于该葡萄球菌表面蛋白并且中和有害的白细胞毒素效应。融合蛋白可通过公认的克隆技术来制造。例如，编码该连接肽的寡核苷酸接合于编码所关注的结构域的基因之间以形成一种编码完整单链蛋白的融合基因。连接子寡核苷酸的5'末端融合至第一基因的3'末端，并且连接子的3'末端融合至第二基因的5'末端。完整融合基因可借助于适当表达载体转染至宿主细胞中。本发明的连接肽可在长度和氨基酸组成方面改变。例如，本发明的连接肽可为约2至约50个氨基酸长、约20至约45个氨基酸长、约25至约40个氨基酸长、约30至约35个氨基酸长、约24至约27个氨基酸长或约20个氨基酸长。大多数连接肽由氨基酸甘氨酸和丝氨酸中的一种或多种的重复模块构成。示例性连接肽包括例如(Gly-Gly)n、(Gly-Ser)n和(Gly3-Ser)n，其中n为整数1-25。连接子的长度可适当地加以调节，只要其不影响多肽的功能。标准15个氨基酸的(Gly4-Ser)3连接肽已经得到充分表征(例如，在抗体单链Fv(scFv)结构域的情形内)并且已经显示采用非结构化、柔性构象。此外，这种连接肽不会干扰其连接的结构域的组装和结合活性(Freund等人,“CharacterizationoftheLinkerPeptideoftheSingle-ChainFvFragmentofanAntibodybyNMRSpectroscopy,”FEBS320:97(1993)，其公开内容以引用的方式整体并入本文)。因此，用于形成双功能融合蛋白的尤其有效连接子包含Gly-Ser连接子。一方面，连接肽含有以下氨基酸序列(SEQIDNO:2)：-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-。然而，本发明的连接肽还涵盖这种连接肽的变体形式，该变体形式可通过将一种或多种核苷酸取代、添加或缺失引入至编码该连接肽的核苷酸序列中，使得一种或多种氨基酸取代、添加或缺失被引入至连接肽中而产生。例如，可通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变引入突变。优选地，在一种或多种非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代，使得连接肽的能力不改变。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已经在所属领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在包含gly-ser基序(例如(Gly-Gly)n、(Gly-Ser)n和(Gly3-Ser)n)的肽连接子的情形内的保守氨基酸取代将包括Gly和/或Ser残基用另一不带电极性侧链(即，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)取代。本发明的结合分子优选地为“分离的”结合分子。“分离的”当用于描述本文中公开的结合分子时意指已经鉴定、从其产生环境的组分分离和/或回收的结合分子。优选地，分离的结合分子不与来自其产生环境的所有其它组分缔合。其产生环境的污染物组分(如由重组转染细胞产生)为将典型地干扰关于多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。在优选实施方案中，结合分子将纯化，(1)通过使用转杯式测序仪至足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)通过在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染色进行SDS-PAGE至均质性。然而，通常地，分离的结合分子将通过至少一个纯化步骤来制备。预期本文所述的结合分子的氨基酸序列修饰。例如，可需要改进抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。结合分子的氨基酸序列变体通过将适当核苷酸改变引入至结合分子核酸中，或通过肽合成来制备。修饰包括例如所述结合分子的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，限制条件是最终构建体具有所需特征，如蛋白A结合和FcγRI结合的取消或蛋白酶抗性。证明对取代的功能敏感性的那些氨基酸位置接着通过在取代位点处或针对取代位点引入进一步或其它变体来改进。因此，虽然预定用于引入氨基酸序列变异的位点，但无需预定突变本身的性质。例如，为了分析在给定位点处突变的性能，在靶标密码子或区域处进行Ala扫描或随机诱变并且针对所需活性筛选表达的结合分子变体。优选地，氨基酸序列插入包括长度介于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基至含有一百个或更多残基的多肽范围内的氨基和/或羧基端融合物，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。本文中预期所述结合分子的其它修饰。例如，结合分子可连接于多种非蛋白聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。结合分子也可被截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或巨乳液中。此技术公开于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第16版,Oslo,A.编,(1980)中，此文献以引用的方式整体并入本文。关于治疗用途，本文所述的结合分子可制备为在药学上可接受的载体中含有有效量的作为活性成分的结合分子的药物组合物。术语“载体”是指用于施用活性化合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。媒介物可为液体，如水和油，油包括石油、动物、植物或合成起源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％生理盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液为无菌的并且一般不含微粒物质。其可通过常规、众所周知的灭菌技术(例如过滤)来灭菌。该组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质至近似生理条件，如pH调节和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。该药物制剂中本发明试剂的浓度可广泛变化，即从少于约0.5％、通常或至少约1％至多达15或20重量％并且将主要根据所选的特定施用模式基于所需剂量、流体体积、粘度等加以选择。合适的媒介物和制剂(包括其它人类蛋白，例如人类血清白蛋白)例如描述于例如REMINGTON:THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY,第21版,Troy,D.B.编,LipincottWilliamsandWilkins,2006,第5部分,PharmaceuticalManufacturing第691-1092页,尤其参看第958-989页中，其献以引用的方式整体并入本文。本文所述的结合分子可以非分离或分离形式使用。此外，本文中结合分子可单独或以包含至少一种本文中结合分子的混合物形式使用。换句话说，结合分子可组合使用，例如呈包含两种或更多种本文中结合分子、其变体或片段的药物组合物形式。例如，具有不同但互补活性的结合分子可组合于单一疗法中以实现所需治疗效应，但或者，具有同一活性的结合分子也可组合于单一疗法中以实现所需预防、治疗或诊断效应。任选地，混合物进一步包含至少一种其它治疗剂。一方面，其它治疗剂可为适用于葡萄球菌感染的预防和/或治疗的抗感染剂、抗生素剂和/或抗微生物剂。另一方面，其它治疗剂可为适用于与葡萄球菌感染有关的病状的预防和/或治疗的试剂。一种制造本文中结合分子的方法为本公开的额外部分。该方法包括步骤(a)在适用于制造结合分子的条件下培养包含含有编码该结合分子的核酸序列的载体的宿主细胞，和(b)从培养物回收结合分子。宿主细胞优选地为哺乳动物宿主细胞，如非人类哺乳动物宿主细胞。因此，另一方面涉及编码结合分子(或其片段)的核酸分子。这些核酸分子可插入至载体(即，表达载体)中，并且接着在适当宿主细胞中转化(或转染)和/或在转基因动物中表达。如此表达的结合分子(或其片段)可接着通过所属领域中已知的方法分离。参看例如Maniatis等人,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL[第3版]ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)，其以引用的方式整体并入本文。本发明的重组载体包含呈适用于本发明核酸在宿主细胞中的表达的形式的核酸，其意指所述重组表达载体包括基于欲用于表达的宿主细胞所选择的一个或多个调控序列，调控序列操作性连接于欲表达的核酸序列。在重组表达载体内，“操作性连接”意图意指所关注的核苷酸序列以允许该核苷酸序列的表达的方式连接于调控序列(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体被引入至宿主细胞中时在宿主细胞中)。术语“调控序列”意图包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。调控序列描述于例如GoeddelGENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress(1990)中，其以引用的方式整体并入本文。调控序列包括指导多种类型的宿主细胞中核苷酸序列的组成性表达的那些和指导某些宿主细胞中核苷酸序列的表达的那些(例如组织特异性调控序列)。所属领域的技术人员应了解，表达载体的设计可取决于如欲转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平的因素。本发明的表达载体可引入至宿主细胞中以由此产生由如本文所述的核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。宿主细胞可用两种或更多种如本文所述的表达载体共转染，第一表达载体含有编码操纵子和第一结合结构域(例如，结合于糖基化葡萄球菌表面蛋白的抗体或抗体片段)的DNA并且第二载体含有编码操纵子和第二结合结构域(例如结合于葡萄球菌白细胞毒素的替代骨架，如FN3)的DNA。这两种载体含有不同的可选标记物，但优选地实现第一结合结构域和第二结合结构域多肽的大致相等表达。或者，可使用单一载体，载体包括编码第一结合结构域和第二结合结构域的DNA。第一结合结构域和第二结合结构域的编码序列可包含cDNA、基因组DNA或两者。本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中制造结合分子。例如，本发明的结合分子可在如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞进一步论述于Goeddel,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress(1990)中，其以引用的方式整体并入本文。或者，重组表达载体可体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。原核生物中蛋白的表达最通常在大肠杆菌中用含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成性或诱导性启动子的载体进行。融合载体添加多个氨基酸至其中编码的蛋白，至重组蛋白的氨基或羧基端。融合载体典型地用于三种目的：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解度；和(iii)通过充当亲和纯化中的配体来帮助纯化重组蛋白。通常，在融合表达载体中，蛋白水解裂解位点被引入融合部分和重组蛋白的结处以使得能够在融合蛋白的纯化之后使重组蛋白与融合部分分离。酶和其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶、PreScission、TEV和肠激酶。典型融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith和Johnson,“Single-StepPurificationofPolypeptidesExpressedinEscherichiacoliasFusionsWithGlutathioneS-Transferase,”Gene67:31-40(1988)，其以引用的方式整体并入本文)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，其分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A至靶标重组蛋白。重组哺乳动物表达载体能够指导特定细胞类型中核酸的表达(例如使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件是所属领域中已知的。关于本文所述的结合分子的有效制造，优选将编码结合分子的核苷酸序列放置于针对所需宿主中的表达优化的表达控制序列的控制下。例如，序列可包括优化的转录和/或翻译调控序列(例如改变的Kozak序列)。一种最大化大肠杆菌中的重组蛋白表达的策略是在具有削弱的蛋白水解裂解重组蛋白的能力的宿主细菌中表达该蛋白(参看例如Gottesman,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGYAcademicPress185:119-128(1990)，其以引用的方式整体并入本文)。另一种策略是改变欲插入至表达载体中的核酸的核酸序列，使得针对每种氨基酸的个别密码子为优先用于大肠杆菌中的那些(参看例如Wada等人,“CodonUsageTabulatedFromtheGenBankGeneticSequenceData,”Nucl.AcidsRes.20:2111-2118(1992)，其以引用的方式整体并入本文)。核酸序列的改变可通过标准DNA合成技术来进行。另一种解决密码子偏好的策略是通过使用BL21-密码子加上细菌株(Invitrogen)或Rosetta细菌株(Novagen)，这些菌株含有罕见大肠杆菌tRNA基因的额外拷贝。编码本文所述的结合分子的表达载体可为酵母表达载体。用于酵母酿酒酵母中的表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari等人,“ANovelLeaderPeptideWhichAllowsEfficientSecretionofaFragmentofHumanInterleukin1betainSaccharomycescerevisiae,”EMBOJ.6:229-234(1987)，其以引用的方式整体并入本文)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,“StructureofaYeastPheromoneGene(MFalpha):aPutativeAlpha-FactorPrecursorContainsFourTandemCopiesofMatureAlpha-Factor,”Cell30:933-943(1982)，其以引用的方式整体并入本文)、pJRY88(Schultz等人,“ExpressionandSecretioninYeastofa400-kDaEnvelopeGlycoproteinDerivedFromEpstein-BarrVirus,”Gene54:113-123(1987)，其以引用的方式整体并入本文)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA.)和picZ(InvitrogenCorp,SanDiego,CA.)或者，本文所述的结合分子可在昆虫细胞中使用杆状病毒表达载体来制造。可用于培养的昆虫细胞(例如SF9细胞)中蛋白的表达的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,“ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCellsInfectedWithaBaculovirusExpressionVector,”Mol.Cell.Biol.3:2156-2165(1993)，其以引用的方式整体并入本文)和pVL系列(Luckow等人,“HighLevelExpressionofNonfusedForeignGenesWithAutographacalifornicaNuclearPolyhedrosisVirusExpressionVectors,”Virology170:31-39(1989)，其以引用的方式整体并入本文)。在另一实施方案中，本发明的核酸在哺乳动物细胞中使用哺乳动物表达载体表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,B.,“AnLFA-3cDNAEncodesaPhospholipid-LinkedMembraneProteinHomologoustoitsReceptorCD2,”Nature329:840(1987)，其以引用的方式整体并入本文)和pMT2PC(Kaufman等人,“TranslationalEfficiencyofPolycistronicmRNAsandTheirUtilizationtoExpressHeterologousGenesinMammalianCells,”EMBOJ.6:187-193(1987)，其以引用的方式整体并入本文)、pIRESpuro(Clontech)、pUB6(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)pREP4(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由病毒调控元件提供。例如，通常使用的启动子源于多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒、劳氏肉瘤病毒和猿猴病毒40。关于用于原核细胞和真核细胞的其它合适表达系统，参看例如Sambrook等人(编),MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第3版)ColdSpringHarborLaboratory(2001)，其以引用的方式整体并入本文。宿主细胞可为任何原核细胞或真核细胞。例如，本发明的结合分子可在如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS、HEK293细胞)中制造。其它合适的宿主细胞为所属领域的技术人员已知的。载体DNA可经由常规转化或转染技术引入至原核细胞或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”意图指多种用于将外来核酸(例如DNA)引入至宿主细胞中的公认技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可发现于Sambrook等人[编],MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第3版)冷泉港实验室和其它实验室手册(2001)，其以引用的方式整体并入本文。可使用任何用于将外来核苷酸序列引入至宿主细胞中的众所周知的程序。这些程序包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和任何用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传材料引入至宿主细胞中的其它众所周知的方法。参看例如Sambrook等人(编)MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第3版)ColdSpringHarborLaboratory(2001)和Walker和PapleyMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY(第5版)RoyalSocietyofChemistry(2009)，其以引用的方式整体并入本文。唯一有必要的是，所用的特定基因工程改造程序能够成功地将至少一种核酸分子引入至能够表达所关注的一种或多种结合分子的宿主细胞中。关于哺乳动物细胞的稳定转染，已知视所用的表达载体和转染技术而定，仅一小部分的细胞可将外来DNA整合至其基因组中。为了鉴定并且选择这些整合体，编码可选标记物的基因(例如抗生素抗性)一般连同所关注的基因被引入至宿主细胞中。各种可选标记物包括对如G418、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素和甲氨蝶呤的药物赋予抗性的那些。编码可选标记物的核酸可被引入至宿主细胞中与编码如本文所述的一种或多种结合分子的载体相同的载体上，或可被引入至独立载体上。用所引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如，已经并入可选标记物基因的细胞将存活，而其它细胞死亡)。本发明的宿主细胞，如培养的原核或真核宿主细胞可用于制造(即，表达)本发明的结合分子。相应地，本发明进一步提供使用本发明的宿主细胞来制造本发明的结合分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经引入编码如本文所述的结合分子的重组表达载体)，使得制造一种或多种本发明的结合分子。在另一实施方案中，该方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离本发明的结合分子。在表达载体被引入至细胞中之后，转染的细胞在有利于所关注的一种或多种结合分子的表达的条件下培养，结合分子接着使用标准技术从培养物回收。该技术的实例为所属领域中众所周知的(参看例如Zuker等人的WO00/06593，其以引用的方式整体并入本文)。此外，本发明的结合分子可用于治疗、预防或改善葡萄球菌感染。葡萄球菌感染可由任何葡萄球菌属引起。一方面，葡萄球菌感染由金黄色葡萄球菌(包括金黄色葡萄球菌的MRSA和MSSA菌株)引起。相应地，本公开提供一种用于治疗、预防或改善葡萄球菌感染的方法，该方法涉及向有需要的受试者施用如本文所述的结合分子。根据这一方面，靶标“受试者”涵盖任何动物，例如哺乳动物，如人类。在出于预防受试者中的葡萄球菌感染的目的施用本发明的组合物的情形中，靶标受试者涵盖处于感染葡萄球菌或发展葡萄球菌感染的风险中的任何受试者。易感性受试者包括婴儿和青少年，以及免疫受损的青少年、成人和老年人。然而，处于发展葡萄球菌感染的风险中的任何婴儿、青少年、成人或老年人或免疫受损个体均可根据本文所述的方法进行治疗。在出于治疗受试者中的葡萄球菌感染的目的施用本发明的组合物的情形中，靶标受试者群体涵盖感染葡萄球菌的任何受试者。尤其合适的受试者包括处于感染风险中的那些或感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)的那些。其它合适的受试者包括可具有由葡萄球菌感染引起的病状或处于发展由葡萄球菌感染引起的病状的风险中的那些受试者，该病状即葡萄球菌相关病状，例如皮肤伤口和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血病、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎和中毒性休克综合征。在一个实施方案中，预防性施用本文所述的结合分子以预防、延迟或抑制处于发展葡萄球菌感染或相关病状的风险中的受试者中葡萄球菌感染的发展。一方面，一种或多种本文所述的结合分子的预防性施用有效地完全预防个体中的金黄色葡萄球菌感染。在其它实施方案中，预防性施用有效地预防将在其它情况下在施用不存在下发展的全感染程度，即大致预防、抑制或最小化个体中的葡萄球菌感染。在另一实施方案中，本文所述的结合分子治疗性施用于具有葡萄球菌感染的个体以抑制感染的进展和进一步发展，即抑制和/或预防感染扩展至个体中的其它细胞、减少感染和治疗或缓解感染的一种或多种症状。本文所述的结合分子的治疗有效量可根据标准程序来确定，该标准程序考虑多种因素，包括例如药物组合物中结合分子的浓度、施用模式和频率、欲治疗(或预防)的葡萄球菌感染的严重程度和受试者详情(如年龄、重量和总体健康状况和免疫病状)。一般指导可发现于例如国际协调会议(InternationalConferenceonHarmonization)的公布中和REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPublishingCompany1990)(其以引用的方式整体并入本文)中。临床医生可以单一剂量施用包含本文所述的结合分子的组合物或根据多剂量方案施用该组合物直至达到提供所需或需要的预防或治疗效应的剂量。这种疗法的进展可容易通过常规分析来监测。在预防性应用中，以相对不频繁的时间间隔在一段长时期内施用相对低剂量。在治疗性应用中，有时需要在相对短时间间隔下的相对高剂量，直至疾病的进展减小或终止，并且优选地直至受试者显示疾病症状的部分或完全改善。本发明的治疗组合物可单独或作为联合一种或多种其它活性剂的组合疗法的一部分施用，视所治疗的葡萄球菌感染的性质而定。所述额外活性剂包括所属领域中容易知晓的抗感染剂、抗生素剂和抗微生物剂。本文所述的结合分子的施用模式可为递送所述结合分子至宿主的任何合适途径，如肠胃外施用，例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺；经粘膜(口服、鼻内、阴道内、直肠)；使用呈片剂、胶囊剂、溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂形式的制剂；和含于注射器、植入器件、渗透泵、药筒、微型泵中；或熟练技术人员所了解的其它方式，如所属领域中众所周知。位点特异性施用可通过例如关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮递送实现。本文所提供的结合分子也可用于诊断受试者中的葡萄球菌感染的方法中。一方面，用于诊断葡萄球菌感染的方法涉及使如本文所述的结合分子与来自欲诊断的受试者的样品接触，和检测该样品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素，即检测样品中糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的存在或不存在。基于这种检测在受试者中诊断葡萄球菌感染。换句话说，糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的检测指示葡萄球菌感染的阳性诊断。根据这一方面，来自受试者的样品可包含血液、组织、细胞、血清或其它生物样品。另一方面涉及一种用于检测样品中的葡萄球菌感染的方法。这种方法涉及使如本文所述的结合分子与样品接触，和检测糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的存在或不存在。糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的检测指示样品中葡萄球菌的存在。根据这一方面，样品可为获自环境、动物或人类的任何生物样品。本文所述的涉及检测来自受试者或别处的样品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的方法涉及使用可检测性标记的结合分子。相应地，一方面，如本文所述的结合分子可偶联于可检测标记。合适的可检测标记为所属领域中众所周知的并且包括可检测标签(例如聚组氨酸(His6–)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST–)标签或麦芽糖结合蛋白(MBP–)标签)；放射性标记(例如碳(14C)或磷(32P))；荧光标记(例如荧光素和其衍生物、荧光素异硫氰酸酯、若丹明和其衍生物、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白)；发光标记(例如鲁米诺)；生物发光标记(例如荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白)；或酶标记(例如荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶)。或者，结合分子可由可检测标记结合，例如由含有可检测标记的二次抗体结合。用于检测结合于样品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素的标记的结合分子的检测分析为所属领域中众所周知的并且包括例如免疫沉淀、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)或荧光激活细胞分选(FACS)。此外，本发明的结合分子可用于预防葡萄球菌感染。这种方法涉及使如本文所述的结合分子与来自受试者的样品接触，和由于所述接触检测该样品中的糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素。如果在受试者样品中检测到糖基化葡萄球菌表面蛋白和/或葡萄球菌白细胞毒素，那么将适用于预防葡萄球菌感染的试剂施用于所述受试者。示例性预防剂包括但不限于：本文所述的结合分子、一种或多种抗生素(例如莫匹罗星、萘夫西林、头孢唑林、双氯西林、氯林肯霉素、万古霉素、利奈唑胺、利福平、新诺明-三甲氧苄二氨嘧啶)和/或有效对抗葡萄球菌感染的其它抗感染剂。实施例下文提供实施例以说明本发明。这些实施例并未意图将本发明限于任何特定应用或操作理论。实施例1.结合并且中和白细胞毒素的纤连蛋白III型(FN3)结构域的建构和选择。Tencon(SEQIDNO：1)为由来自人类肌腱蛋白C的十五个FN3结构域的共有序列设计的免疫球蛋白样骨架、纤连蛋白III型(FN3)结构域(Jacobs等人，“DesignofNovelFN3DomainsWithHighStabilitybyaConsensusSequenceApproach，”ProteinEngineering，Design，andSelection25：107-117(2012)，其公开内容以引用的方式整体并入本文)。Tencon的晶体结构显示连接七个β-链的六个表面暴露环。这些环或在各环内的所选残基可随机化以便建构可用于选择结合于LukAB、LukD或LukE的新颖分子的纤连蛋白III型(FN3)结构域文库。Tencon：LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQIDNO：1)程序TCL7(TCL18)和TCL9(TCL17)文库的建构。建构经过设计以仅随机化Tencon的F：G环TCL9(TCL17)或BC和FG环的组合TCL7(TCL18)的文库以用于顺式展示系统(Odegrip等人，“CISDisplay：InVitroSelectionofPeptidesFromLibrariesofProtein-DNAComplexes，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：2806-2810(2004)，其公开内容以引用的方式整体并入本文)。在这种系统中，产生针对Tac启动子、Tencon文库编码序列、RepA编码序列、顺式元件和ori元件的线性双链DNA并入序列。在体外转录/翻译系统中表达后，形成FN3结构域-RepA融合蛋白的复合物，该RepA融合蛋白顺式结合于用于对其进行编码的DNA。接着分离结合于靶标分子的复合物并且通过如下文所述的聚合酶链反应(PCR)进行扩增。使用Slonomics技术(SloningBiotechnologyGmbH)合成编码具有随机化BC或FG环序列的Tencon基因序列的DNA片段以便控制文库的氨基酸分布并且消除终止密码子。随机化BC环或FG环的DNA分子的两个不同集合独立地合成并且稍后如下文所述进行组合，使得产生具有环长度的不同组合的文库。下表1概述了这些Tencon环文库的设计特征。表1.TCL7(TCL18)和TCL9(TCL17)文库的BC和FG环的设计的氨基酸序列。显示非随机化TenconBC和FG环的序列以用于比较。X表示缺乏半胱氨酸和甲硫氨酸的18种氨基酸的混合物。FG环文库(TCL9(TCL17))的产生。产生合成DNA分子的集合，该分子由5’Tac启动子、随后Tencon的完全基因序列(除FG环中的随机化密码子以外)组成(Diem等人的美国专利公布号2013/0079243，其以引用的方式整体并入本文)。关于FG环随机化，除了半胱氨酸和甲硫氨酸以外的所有氨基酸以相等百分比编码。多样化部分的长度使得其编码FG环中的7、8、9、10、11或12个氨基酸。每个长度变化的子文库单独地以2ug的规模合成并且接着通过PCR使用oligosSloning-FOR和Sloning-Rev扩增。文库的3’片段为含有用于展示的元件的恒定DNA序列，该元件包括PspOMI限制位点、repA基因的编码区和顺式和ori元件。执行PCR反应以使用质粒(pCR4Blunt)(Invitrogen)作为模板由M13正向和M13反向引物扩增这一片段。所得PCR产物通过PspOMI消化过夜并且凝胶纯化。为了接合文库DNA的5’部分至含有repA基因的3’DNA，在NotI和PspOMI酶和T4连接酶存在下在37℃下将2pmol(约540ng至560ng)的5’DNA接合至相等摩尔(约1.25ug)的3’repADNA过夜。接合的文库产物通过使用12个PCR循环用oligosPOP2250(SEQIDNO:6)和DigLigRev(SEQIDNO:7)扩增。关于每个子文库，组合来自12个PCR反应的所得DNA并且通过Qiagen离心柱纯化。关于TCL9(TCL17)的各子文库的产量介于32-34ug范围内。TCL7(TCL18)文库建构。TCL7(TCL18)文库提供具有随机化TenconBC和FG环的文库。在这一文库中，长度6-9个氨基酸的BC环与7-12个氨基酸长的随机化FG环组合性混合。产生合成Tencon片段BC6、BC7、BC8和BC9(分别为SEQIDNO:80-83)以包括编码蛋白的N端部分直至并且包括残基VX的Tencon基因，使得BC环用6、7、8或9个随机化氨基酸置换。这些片段在L17A、N46V和E86I突变(CEN5243)的发现之前合成，但这些突变在下文所述的分子生物学步骤中引入。为了组合这一片段与编码随机化FG环的片段，进行以下步骤。首先，通过PCR使用oligosPOP2222ext(SEQIDNO:85)和LS1114(SEQIDNO:86)产生编码Tac启动子和Tencon的5’序列直至编码氨基酸A17的核苷酸的DNA片段(130聚体-L17A)(SEQIDNO:84)。进行此举以在文库中包括L17A突变。接着，通过PCR使用作为模板的BC6、BC7、BC8或BC9和oligosLS1115(SEQIDNO:87)和LS1117(SEQIDNO:88)扩增编码Tencon残基R18-V74的DNA片段(包括随机化BC环)。这一PCR步骤在3’末端引入BsaI位点。这些DNA片段随后通过重叠PCR使用oligosPOP2222ext和LS1117作为引物来接合。汇集所得240bp的PCR产物并且通过QiagenPCR纯化试剂盒纯化。纯化的DNA用BsaI-HF消化并且凝胶纯化。编码FG环的片段通过PCR使用作为模板的FG7、FG8、FG9、FG10、FG11和FG12用寡核苷酸SDG10(SEQIDNO:89)和SDG24(SEQIDNO:90)扩增以并入BsaI限制位点和N46V和E86I变异。消化的BC片段和FG片段以16种可能的组合接合在一起，呈两种BC环长度与2种FG环长度的组合的4种接合反应。各接合含有约300ng的总BC片段和300ng的FG片段。这4种接合方案接着通过PCR使用oligosPOP2222(SEQIDNO:5)和SDG28(SEQIDNO:91)扩增。7.5ug的每种反应产物接着用Not1消化并且用QiagenPCR纯化柱净化。5.2ug的这种DNA接合至相等摩尔量的用PspOMI消化的RepADNA片段(约14ug)并且产物通过PCR使用oligosPOP2222扩增。TCL19、TCL21、TCL23和TCL24文库的设计。欲以特定文库设计随机化的残基的选择控制了所产生的相互作用表面的总体形状。含有从其中BC、DE和FG环随机化的文库选择以结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的骨架蛋白的FN3结构域的X射线结晶学分析显示具有大的弯曲界面，该界面适合MBP的活性位点(Koide等人,“High-AffinitySingle-DomainBindingProteinsWithaBinary-CodeInterface,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:6632-6637(2007)，其以引用的方式整体并入本文。相比之下，发现所选的结合于MBP的锚蛋白重复序列骨架蛋白具有平坦得多的相互作用表面并且结合于远离活性位点的MBP外表面(Binz等人,High-AffinityBindersSelectedFromDesignedAnkyrinRepeatProteinLibraries,”Nat.Biotechnol.22:575-82(2004)，其以引用的方式整体并入本文)。这些结果表明骨架分子的结合表面的形状(弯曲相对平坦)可规定何种靶标蛋白或那些靶标蛋白上的特异性表位能够由骨架有效地结合。公布的围绕工程改造含有用于蛋白结合的FN3结构域的蛋白骨架的努力已经依赖于工程改造用于靶标结合的相邻环，因此产生弯曲结合表面。这种方法可限制骨架可接近的靶标和表位的数目。Tencon和其它FN3结构域含有位于分子的相对面上的CDR样环的两个集合，第一个集合由BC、DE和FG环形成，并且第二个集合由AB、CD和EF环形成。这些环的两个集合由形成FN3结构的中心的β-链分离。这种略微凹入的表面通过CD和FG环和两个反向平行β-链C和Fβ-链形成，并且在本文中称为C-CD-F-FG表面。C-CD-F-FG表面可用作模板以通过随机化形成表面的残基的子集设计蛋白骨架相互作用表面的文库。β-链具有重复结构，该结构具有暴露于蛋白的表面的所有其它残基的侧链。因此，可通过随机化β链中的一些或全部表面暴露残基来产生文库。通过选择β-链中的适当残基，Tencon骨架的固有稳定性应最小程度地受损，同时提供用于与其它蛋白相互作用的独特骨架表面。基于这种前体的文库(称为TCL14)先前描述于Diem等人的US2013/0079243A1中，其以引用的方式整体并入本文。接着根据与TCL14的文库极其类似的设计产生新的文库。尽管所用的TCL14简并NNS密码子以多样化Tencon骨架，但使用利用Slonomics技术(SloningBiotechnologyGmbH)合成的编码Tencon基因的DNA片段产生TCL19(SEQIDNO：86)以便控制文库的氨基酸分布并且消除终止密码子。因此，下文中以“X”实现的各位置用18种氨基酸的等量混合物(无半胱氨酸或甲硫氨酸)置换。TCL19：LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXIXYXEXXXXGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLSAIFTT(SEQIDNO：92)；其中“X”为18种氨基酸的等量混合物(无半胱氨酸或甲硫氨酸)。表2.产生类似设计的两种额外Tencon文库。这两种文库TCL21和TCL23在与TCL14相同的位置处随机化(描述于Diem等人的US2013/0079243A1中，其以引用的方式整体并入本文)；然而，存在于这些位置处的氨基酸的分布发生改变(下表3)。TCL21是设计为在每一个位置处包括18种天然氨基酸的等量分布(每一种5.55％)，仅排除半胱氨酸和甲硫氨酸。TCL23是设计成使得每个随机化位置接近在如表3中所述的功能性抗体的CDR—H3环中发现的氨基酸分布(Birtalan等人，“TheIntrinsicContributionsofTyrosine，Serine，GlycineandArgininetotheAffinityandSpecificityofAntibodies，”JournalofMolecularBiology377：1518-1528(2008)，其以引用的方式整体并入本文)。如同TCL21文库一样，排除半胱氨酸和甲硫氨酸。建立第三种额外文库以扩展TCL21文库的潜在靶标结合表面。在这种文库TCL24中，如与文库TCL14、TCL21和TCL23相比，4个额外Tencon位置随机化。这些位置包括来自D链的N46和T48和来自G链的S84和I86。具体来说选择位置46、48、84和86，因为这些残基的侧链从β-链D和G表面暴露并且在结构上位于与C和F链的随机化位置相邻处，因此增加可接近用于结合于靶标蛋白的表面积。在TCL24的每个位置处所用的氨基酸分布与关于TCL21和在表3中所述的氨基酸分布同一。TCL24：LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXIXYXEXXXXGEAIXLXVPGSERSYDLTGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLXAXFTT(SEQIDNO：667)其中“X”表示18种天然氨基酸的等量混合物。表3.在TCL21、TCL23和TCL24的各随机化位置处的氨基酸出现率(％)。TCL21、TCL23和TCL24文库的产生。使用Colibra文库技术(Isogenica)产生TCL21文库以便控制氨基酸分布。使用Slonomics技术(Morphosys)产生TCL23和TCL24基因片段以控制氨基酸分布。在初始合成、随后接合至用于RepA的基因之后使用PCR来扩增各文库以便用于使用如先前所述的CIS-展示系统的选择(Odegrip等人,“CISDisplay:InVitroSelectionofPeptidesFromLibrariesofProtein-DNAComplexes,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:2806-2810(2004)，其以引用的方式整体并入本文)。文库筛选。使用顺式展示从TCL17、TCL18和TCL19文库选择白细胞毒素结合结构域。重组LukA’B类毒素复合物(SEQIDNO:10和11)、LukD(SEQIDNO:12)和LukE(SEQIDNO:13)白细胞毒素使用标准方法进行生物素标记并且用于淘选。尽管修饰的LukA’B类毒素复合物用于本发明实施例中的淘选，已经确认未修饰LukAB毒素的结合和/或中和。关于体外转录和翻译(ITT)，2-6μg文库DNA用总体积为100μL的0.1mM完整氨基酸、1XS30预混合组分和30μLS30萃取物(Promega)孵育并且在30℃下孵育。1小时后，添加450μL阻断溶液(PBSpH7.4，补充有2％牛血清白蛋白、100μg/mL鲱鱼精DNA和1mg/mL肝素)并且反应在冰上孵育15分钟。关于结合，500μL阻断的ITT反应物与100μL生物素标记的白细胞毒素混合并且在室温下孵育1小时，之后用磁性中性亲和素或抗生蛋白链菌素珠粒(Promega和Invitrogen)下拉结合的复合物。通过用PBST和PBS连续洗涤来去除未结合的文库成员。在洗涤五轮、七轮和九轮之后，通过加热至65℃持续10分钟从结合的复合物洗脱DNA，通过PCR扩增，并且通过限制消化和接合连接于编码RepA的DNA片段以用于其它数轮淘选(当repA并入文库中时，这一步骤为任选的)。通过在各轮期间从400nM至2.5nM连续降低靶标白细胞毒素的浓度并且增加洗涤严格程度来分离高亲和力粘合剂。通过七个(LukE)和九个(LukAB和LukD)连续轮执行淘选。在淘选之后，通过PCR使用oligosMDD40(SEQIDNO:8)和MDD62(SEQIDNO:9)扩增所选的FN3结构域，亚克隆至经过修饰以包括连接酶独立性克隆位点的pET载体中，并且使用标准分子生物学技术转化至BL21-GOLD(DE3)(Stratagene)细胞中以用于大肠杆菌中的可溶性表达。编码C端聚组氨酸标签的基因序列添加至各FN3结构域中以使得能够纯化和检测。培养物在补充有100μg/mL羧苄青霉素的2YT培养基中在1mL96孔板中在37℃下生长至0.6-0.8的光学密度，接着添加IPTG至1mM，此时温度降至30℃。大约16小时后通过离心收集细胞并且在-20℃下冷冻。通过在室温下在振荡下在0.6mLHT溶解缓冲液(NovagenEMDBiosciences)中孵育各球粒持续45分钟来实现细胞溶解。通过ELISA确认镍纯化的FN3结构域的抗原结合。结果在各毒素/类毒素分子的顺式展示淘选之后，通过ELISA鉴定结合于LukA’B(类毒素)、LukD和LukE的FN3结构域。鉴定粘合剂的DNA序列并且分离独特序列。鉴定由这些序列表达的单体蛋白并且确认预期分子量。抗原结合、序列鉴定号和单体FN3结构域报告于表4中。表4.结合于LukAB、LukD和LukE的FN3结构域的表征。结合LukAB、LukD和LukE的额外FN3结构域在下文表6中作为SEQIDNO:113-666公开。概述顺式展示淘选成功地鉴定了靶向LukA’B(4)、LukD(7)和LukE(35)的序列独特、单体、staph白细胞毒素结合FN3结构域，如通过ELISA所检测。实施例2.通过抗LukDFN3结构域中和白细胞毒素介导的免疫细胞杀灭。为了评估分离的抗LukDFN3结构域的功能性，开发基于细胞的细胞毒性中和分析。使用三种类型的FN3结构域，不具有连接子的FN3结构域和具有GS或GSM连接子的FN3结构域。程序为了针对中和活性筛选抗LukDFN3结构域，在冰上用最终体积为30μl的递增浓度的不同FN3结构域孵育75nMLukED；杀灭100％细胞所需的剂量或LD100。新鲜分离的原代人类中性粒细胞(hPMN)(2×105个细胞于70μlRPMI+10mMHEPES+0.1％HAS中)接着添加至毒素-FN3结构域混合物中。在37℃5％CO2孵育器中孵育1h之后，10μlCellTiterAQONE溶液(Promega)添加至细胞中并且孵育1小时。CellTiter为通过监测细胞代谢活性来评估细胞存活力的比色分析。比色反应使用PerkinElmerEnvisionMultilabel读取器在492nm下测量。百分比活细胞使用以下等式来计算：％存活力＝100×[(Ab492样品-Ab492TritonX100)/(Ab492组织培养基)]。膜损伤还通过监测孵育后一小时的乳酸脱氢酶(LDH)释放来测量。取出50μl上清液并且添加至含有50μlLDH试剂(CytoTox-ONEHomogeneousMembraneIntegrityAssay,Promega)的孔中并且在室温下再孵育30min。使用PerkinElmerEnvisionMultilabel读取器(激发555nm、发射590nm)测量LDH活性并且数据针对由0.1％v/vTriton-X100诱导的100％PMN溶解标准化。结果如图1所示，分析所选的抗LukDFN3结构域中和LukED对人类PMN的细胞毒性活性的能力。发现三种所选的抗LukDFN3结构域(Luk10、Luk12和Luk22)阻断LukED介导的hPMN杀灭。当测量细胞代谢(CellTiter)以及膜损伤(LDH)时观察到这种抑制作用。与抗LukDFN3结构域形成对比，使用TENCON对照FN3结构域未观察到中和。概述如所预期，TENCON分子不能阻断LukED的细胞毒性潜能。相比之下，所选的抗LukDFN3结构域中和LukED，无论其是否融合至连接子。抗LukDFN3结构域以剂量依赖性方式阻断LukED介导的细胞毒性。出于说明性目的，选择Luk12抗LukDFN3结构域用于产生mAb-FN3结构域结合物。实施例3.通过抗LukABFN3结构域中和白细胞毒素介导的免疫细胞杀灭。为了评估分离的抗LukA’BFN3结构域的功能性，开发并且使用基于细胞的细胞毒性中和分析。使用三种类型的FN3结构域，不具有连接子的FN3结构域和具有GS或GSM连接子的FN3结构域。程序为了针对中和活性筛选抗LukA’BFN3结构域，在冰上用递增浓度的FN3结构域Luk17的不同型式(+/-连接子)在96孔黑色孔透明底部组织培养物处理的板中孵育18.75nM活性LukAB毒素(LD100)持续30分钟。在无酚红RPMI+10mMHEPES+0.1％HSA中的2×105个新鲜分离的原代hPMN接着添加至毒素-FN3结构域复合物中并且样品在37℃5％CO2孵育器中孵育一小时。膜损伤通过两种分析评估：溴化乙锭渗透性和乳酸脱氢酶(LDH)释放。溴化乙锭渗透性使用PerkinElmerEnvisionMultilabel读取器(激发530nm、发射590nm)测量。LDH释放至培养物上清液中也在孵育后一小时测量。取出50μl上清液并且添加至含有50μlLDH试剂(CytoTox-ONEHomogeneousMembraneIntegrityAssay,Promega)的孔中并且在室温下再孵育30分钟。使用PerkinElmerEnvisionMultilabel读取器(激发555nm、发射590nm)测量LDH活性并且数据针对由0.1％v/vTriton-X100诱导的100％PMN溶解标准化。结果如图2所示，分析Luk17抗LukABFN3结构域中和LukAB对人类PMN的细胞毒性活性的能力。发现抗LukABFN3结构域阻断LukAB介导的hPMN杀灭，如通过溴化乙锭渗透性和LDH释放所评估。相比之下，使用对照FN3结构域分子未观察到中和。概述如所预期，TENCON分子不能阻断LukAB的细胞毒性潜能。相比之下，抗LukABFN3结构域(无论其是否融合至连接子)中和LukAB细胞毒性。抗LukABFN3结构域以剂量依赖性方式阻断LukAB介导的细胞毒性。出于说明性目的，选择Luk17抗LukABFN3结构域用于产生mAB-FN3结构域结合物。实施例4：通过抗LukEFN3结构域中和白细胞毒素介导的免疫细胞杀灭。为了评估分离的抗LukEFN3结构域的功能性，使用关于抗LukDFN3结构域的评估所述的相同的基于细胞的细胞毒性中和分析。出于说明性目的，使用五种抗LukEFN3结构域(无连接子的FN3结构域)。程序为了针对中和活性筛选抗LukEFN3结构域，在冰上用最终体积为30μl的递增浓度的不同FN3结构域孵育75nMLukED持续30分钟；杀灭100％细胞所需的剂量或LD100。新鲜分离的原代hPMN(2×105个细胞于70μlRPMI+10mMHEPES+0.1％HAS中)接着添加至毒素-FN3结构域混合物中。在37℃5％CO2孵育器中孵育1h之后，经由乳酸脱氢酶(LDH)释放监测细胞膜去稳定化。LDH释放至培养物上清液中在孵育后一小时测量。取出50μl上清液并且添加至含有50μlLDH试剂(CytoTox-ONEHomogeneousMembraneIntegrityAssay,Promega)的孔中并且在室温下再孵育30min。使用PerkinElmerEnvisionMultilabel读取器(激发555nm、发射590nm)测量LDH活性并且数据针对由0.1％v/vTriton-X100诱导的100％PMN溶解标准化。结果分析所选的抗LukEFN3结构域中和LukED对人类PMN的细胞毒性活性的能力。发现所有所测试的抗LukEFN3结构域均阻断LukED介导的hPMN杀灭(图3)。概述由抗LukEFN3结构域进行的LukED中和为剂量依赖性的。在所测试的FN3结构域中，抗LukEFN3结构域Luk26、Luk27和Luk38展现最高中和活性。实施例5.融合蛋白的建构。利用描述于Throsby等人的美国专利号8,460,666(其以引用的方式整体并入本文)中的mAb5133(SEQIDNO:60和61)设计构建体，目的是经由FabV-区衔接Staph抗原并且具有连接于轻链C端或重链C端的白细胞毒素中和构建体。下表5概述了设计的融合蛋白构建体。图4A的左侧构建体描绘了具有连接于各重链的C端的LukAB中和构建体的单特异性、二价mAb。图4A的右侧构建体描绘了具有连接于各重链的C端的LukD或LukE中和构建体的单特异性、二价mAb。图4B的左侧构建体描绘了具有连接于各轻链的C端的LukAB中和构建体的单特异性、二价mAb。图4B的右侧构建体描绘了具有连接于每个轻链的C端的LukD或LukE中和构建体的单特异性、二价mAb。图4C的左侧构建体描绘了具有连接于每个轻链的C端的LukAB中和构建体，和连接于每个重链的C端的LukD或LukE中和构建体的单特异性、二价mAb。图4C的右侧构建体描绘了具有连接于每个轻链的C端的LukD或LukE中和构建体和连接于每个重链的C端的LukAB中和构建体的单特异性、二价mAb。图4D的左侧构建体描绘了具有连接于各重链的C端的串联LukAB中和构建体和连接于LukAB中和构建体的C端的LukD或LukE中和构建体的单特异性、二价mAb。图4D的右侧构建体描绘了具有连接于各重链的C端的串联LukD或LukE中和构建体和连接于LukD或LukE中和构建体的C端的LukAB中和构建体的单特异性、二价mAb。图4E描绘了具有连接于重链识别Staph抗原2的C端的LukD或LukE中和构建体，和连接于重链识别Staph抗原1的C端的LukAB中和构建体的双特异性、二价mAb。图4F描绘了具有连接于一条重链的C端的LukAB中和构建体，和连接于相对重链的C端的LukD或LukE中和构建体的单特异性、二价mAb。表5.融合蛋白构建体的设计。实施例6.MAb5133强烈地结合于金黄色葡萄球菌的不同菌株，但不结合于sdgB突变株。mAb5133先前显示结合于金黄色葡萄球菌的不同菌株并且具有调理吞噬细胞活性(描述于Throsby等人的美国专利号8,460,666中，其以引用的方式整体并入本文)。为了进一步分析mAb5133的特异性，使用金黄色葡萄球菌的不同菌株以及来自USA300亲本JE2菌株的次代菌株执行蛋白质印迹结合实验，在次代菌株中已经使用获自NetworkonAntibioticResistanceinStaphylococcusaureus(NARSA)的序列定义的转座子突变体(Fey等人,“AGeneticResourceforRapidandComprehensivePhenotypeScreeningofNonessentialStaphylococcusaureusGenes,”mBio4(1):e00537-12(2013)，其以引用的方式整体并入本文)破坏特异性基因。程序关于细胞溶解产物的制备，所用的方法遵循Brady等人,“IdentificationofStaphylococcusaureusProteinsRecognizedbytheAntibody-MediatedImmuneResponsetoaBiofilmInfection,”Infect.Immun.74:3415-3426(2006)(其以引用的方式整体并入本文)的制备。金黄色葡萄球菌株在胰蛋白酶大豆肉汤中在37℃、190rpm下培养过夜。关于携带转座子插入的菌株，10μg/mL红霉素包括于培养基中。培养物1:100稀释于新鲜培养基中并且培养5-6小时，至约1.2的OD600。对于每个菌株，离心4.5mL培养物，并且细胞球粒再悬浮于75μL溶解缓冲液(50mMTris-HCl、20mMMgCl2和10μg/mL溶葡球菌酶)中。在37℃下孵育20分钟之后，溶解完成。溶解产物接着在6,000rpm、4℃下离心20分钟并且上清液转移至新管中。关于蛋白质印迹分析，12μL各溶解产物在70℃下加热10分钟(具有50mMDTT的LDS样品缓冲液)并且在MOPS缓冲液中在10％Bis-Tris凝胶(NovexNuPage,LifeTechnologies)上在150伏特下电泳2小时。该凝胶使用iBlot仪器(LifeTechnologies)印迹于PVDF膜上并且用CR5133使用FemtoMax试剂盒(Rockland)探测。结果如图5所示，mAb5133在由金黄色葡萄球菌株ATCC29213和亲本USA300菌株JE2产生的溶解产物中检测到高分子量色带(即，高于50kDa)。高分子量色带也在缺乏含丝氨酸-天冬氨酸重复序列(SDR)蛋白SdrC、SdrD和SdrE的NARSA菌株中检测到(泳道3NE432(sdrC突变体)、泳道4NE1289(sdrD突变体)、泳道5NE98(sdrE突变体)。模糊色带在分选酶突变体(泳道8NE1787(srtA突变体)和蛋白A突变体(泳道9NE286(蛋白A突变体)中检测到。高分子量色带未在糖基转移酶sdgB突变体(泳道7NE105(sdgB突变体))中检测到，但在糖基转移酶sdgA突变体(泳道6NE381(sdgA突变体))中检测到。概述SDR结构域内的丝氨酸通过依序添加N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)首先由SdgB、随后由SdgA修饰(Hazenbos等人,“NovelStaphylococcalGlycosyltransferasesSdgAandSdgBMediateImmunogenicityandProtectionofVirulence-AssociatedCellWallProteins,”PLoSPathog.9(10):e1003653(2013)，其以引用的方式整体并入本文)。在来自sdgB突变体的溶解产物中用mAb5133无法检测到高分子量色带与5133识别已经通过SdgB糖基化的SDR表位一致。实施例7.融合蛋白的V8蛋白水解消化。人类IgG1易于经受下部铰链区中的裂解，并且这种裂解可导致体外和体内Fc介导的效应子功能的损失(Brezski等人,“Tumor-AssociatedandMicrobialProteasesCompromiseHostIgGEffectorFunctionsbyaSingleCleavageProximaltotheHinge,”PNAS106:17864-17869(2009)，其以引用的方式整体并入本文。金黄色葡萄球菌蛋白酶GluV8裂解下部铰链区中氨基酸E233与L234之间的人类IgG1，并且先前证明这种裂解消除ADCC和CDC功能(Brezski等人,“HumanAnti-IgG1HingeAutoantibodiesReconstitutetheEffectorFunctionsofProteolyticallyInactivatedIgGs,”J.Immunol.181:3183-3192(2008)，其以引用的方式整体并入本文)。为了使mAb/FN3结构域构建体有效地起作用，其必须能够结合于金黄色葡萄球菌缔合的抗原并且衔接免疫细胞FcγR或补体以便促进吞噬作用。蛋白水解裂解可能解开mAb促进免疫效应细胞的吞噬作用的能力。因此，铰链区经过工程改造以具有增加的对GluV8的蛋白水解的抗性。程序金黄色葡萄球菌蛋白酶GluV8(目录E-006)获自BioCentrum。抗体浓度在PBS中固定在3.3μM下并且反应通过添加0.66μM的GluV8来起始以关于GluV8产生20％摩尔比。消化在pH7.5下在37℃下执行24小时。样品在变性条件下制备并且使用Agilent2100基于微流体学的生物分析仪进行分析。百分比完整IgG基于通过毛细管电泳法(AgilentTechnologies)产生的电泳图谱通过将保留于蛋白酶消化的样品中的百分比完整IgG除以保留于无蛋白酶的对照样品中的百分比完整IgG来计算。分析数据并且使用GraphPadPrism绘图。结果如图6所示，含有人类IgG1wt的下部铰链(E233/L234/L235/G236)的构建体IgG1(IgG1同型对照)和A6(表5的构建体3)展示在用GluV8消化24小时之后保留15-25％范围的完整IgG。具有突变型下部铰链(缺失G236的E233P/L234V/L235A)的构建体PRASAA6(表5的构建体4)和PRASAA6HC-AB(表5的构建体6)展示增加的对GluV8的抗性，其中在24小时GluV8消化之后保留大于70％的完整IgG。概述这些结果指示IgG1的下部铰链区的突变赋予增加的对GluV8消化的抗性。此外，在重链的C端包括抗LukABFN3结构域不会影响对GluV8裂解的易感性，因为关于不具有FN3结构域的下部铰链突变型构建体PRASAA6(构建体4)的完整IgG的总量具有与含有FN3结构域的下部铰链突变型构建体PRASAA6HC-AB(构建体6)类似的百分比保留的完整IgG。实施例8.使用竞争结合分析的Fcγ受体结合测量。使用竞争分析以便分析抗Staph靶向构建体结合于FcγR的能力。构建体最初是设计成结合于人类FcγR，因此构建体针对其结合于人类激活FcγR：FcγRI、FcγRIIa(R131)和FcγRIIIa(V158)，和抑制受体FcγRIIb的能力进行测试。程序在半孔体积96孔不透明板(Corning)中在分析缓冲液(PBS、0.05％BSA、0.01％Tween-20)中在pH7.4下进行竞争结合研究。所有竞争研究均针对生物素标记的IgG1野生型(1个IgG:2个生物素，使用EZLinkTMNHS-LC-生物素,Pierce)在固定浓度下并且使用竞争IgG1野生型和抗Staph构建体在连续3倍稀释液中进行。分析中FcγR的最终浓度为0.2μg/ml。生物素标记的IgG1(0.2μg/ml最终)和IgG1野生型和抗Staph构建体(10μl)一式两份依序添加至96孔板的各行中。其后，添加指定FcγR，随后依序添加10μl的1/50稀释的镍螯合物(Ni)-受体珠粒和1/50稀释的抗生蛋白链菌素(SA)-供体珠粒中的每一者。不透明板用铝密封件覆盖以维持避光条件，同时在定轨振荡器上振荡30分钟。其后，去除密封件并且在配备有激发/发射光谱的适当滤光片集合的ENVISIONTM板式读取器(PerkinElmer)上读取荧光。原始数据转移至GraphPadPRISMTM软件并且针对最大信号标准化并且使用非线性回归曲线拟合软件绘制竞争曲线。使用以下等式产生竞争结合曲线：％最大信号＝(Exp–Min)/(Max–Min)×100％，其中最小值(Min)通过在最高浓度的测试物品mAb存在下检测的信号确定并且最大值(Max)通过在仅含有生物素标记的IgG1、FcγR、镍螯合物(Ni)-受体珠粒和抗生蛋白链菌素(SA)-供体珠粒而无任何抗Staph构建体的孔中检测的信号确定。结果分析数种构建体竞争结合于具有人类IgG1野生型的受体的人类Fcγ家族的能力。构建体降低由生物素标记的IgG1野生型产生的最大信号的能力显示于图7A至7D中。如图7A所示，IgG1(IgG1同型对照)和A6(构建体3)稳固地结合于人类FcγRI。构建体PRASAA6(构建体4)、PRASAA6LC-D(构建体5)、PRASAA6HC-AB(构建体6)和PRASAA6LC-DHC-AB(构建体7)不展示在任何测试浓度下结合于人类FcγRI。构建体IgG1(IgG1同型对照)、A6(构建体3)、PRASAA6(构建体4)、PRASAA6LC-D(构建体5)、PRASAA6HC-AB(构建体6)和PRASAA6LC-DHC-AB(构建体7)均展示可相当结合于人类FcγRIIa(R131)(图7B)。构建体IgG1(IgG1同型对照)和A6(构建体3)展示最高结合于抑制人类FcγRIIb，而构建体PRASAA6(构建体4)、PRASAA6LC-D(构建体5)、PRASAA6HC-AB(构建体6)和PRASAA6LC-DHC-AB(构建体7)展示低至不可检测的结合(图7C)。构建体IgG1(IgG1同型对照)、A6(构建体3)、PRASAA6(构建体4)、PRASAA6LC-D(构建体5)、PRASAA6HC-AB(构建体6)和PRASAA6LC-DHC-AB(构建体7)均展示可相当结合于人类FcγRIIIa(V158)(图7D)。概述具有下部铰链突变(缺失G236的E233P、L234V、L235A)的构建体均未展示结合于人类FcγRI(参看美国专利公布号2013/0011386A1)，并且在重链或轻链上包括C端FN3结构域不影响结合。所有构建体均展示可相当结合于激活人类FcγRIIa(R131)和FcγRIIIa(V158)，这指示包括FN3结构域不会影响结合于这些受体。构建体PRASAA6(4)、PRASAA6LC-D(5)、PRASAA6HC-AB(6)和PRASAA6LC-DHC-AB(7)展示低至不可检测的结合于抑制受体FcγRIIb。这可能是有利的，因为与人类FcγRIIb的低结合和与激活受体FcγRIIa和FcγRIIIa的正常结合将增加激活(A):抑制(I)指数，一种被认为增加具有预期细胞毒性作用机制的mAb的功效的特性(Nimmerjahn和Ravetch,“DivergentImmunoglobulingSubclassActivityThroughSelectiveFcReceptorBinding,”Science310:1510-1512(2005)，其以引用的方式整体并入本文)。实施例9.蛋白A结合测量。使用基于板的ELISA分析以便分析构建体与涂布于ELISA板上的蛋白A的结合。蛋白A为Staph毒力因子，并且人类IgG1野生型抗体经由结合于IgG1野生型的Fc螯合于Staph的表面上。这种方法被认为消除抗StaphmAb通过抗体V-区结合于表面决定子的能力并且同时阻断Fc与宿主免疫系统的体液和细胞组分的相互作用。为了回避这种Staph毒力因子，工程改造构建体，目的是去除蛋白A结合。程序在透明96孔板(Nunc)中在ELISA阻断缓冲液(3％牛血清白蛋白于PBS中)中进行直接蛋白A结合ELISA。生物素标记的蛋白A在室温下在PBS中以2μg/ml持续1个小时涂布于96孔板中，在ELISA洗涤缓冲液(具有0.02％Tween-20的0.15MNaCl)中洗涤3次。板接着在室温下用ELISA阻断缓冲液阻断1小时。板接着在ELISA洗涤缓冲液中洗涤3次。构建体以10μg/ml的起始浓度应用于该板，接着在该板中连续稀释3倍并且在室温下孵育1小时。板在ELISA洗涤缓冲液中洗涤3次。构建体用1:15,000稀释于ELISA阻断缓冲液中的辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗人类κ轻链抗体(Millipore)检测并且样品在室温下孵育30分钟。板在ELISA洗涤缓冲液中洗涤5次。这种分析中用于HRP的底物为TMB(Fitzgerald)，并且孵育板直至孔变蓝。反应通过添加相等体积的0.5MHCl至TMB中来终止，并且板在450nm下读取。用GraphPadPrism软件使用非线性回归曲线拟合分析数据。结果人类IgG1野生型构建体(构建体1)展示与蛋白A的可检测结合。所有含有CH3突变H435R/Y436F的构建体(即A6(构建体3)、PRASAA6(构建体4)、PRASAA6LC-D(构建体5)、PRASAA6HC-AB(构建体6)和PRASAA6LC-DHC-AB(构建体7)在任何测试浓度下均不展示与蛋白A的可检测结合(图8)。概述CH3突变H435R/Y436F成功地消除了蛋白A结合，如这种分析中所分析。在重链或轻链的C端包括FN3结构域不会影响蛋白A结合。实施例10.如通过流式细胞术所测量结合于完整细菌。使用流式细胞术分析来分析mAb和FN3结构域-mAb结合物与金黄色葡萄球菌的Newman株的表面的结合。因为金黄色葡萄球菌毒力因子蛋白A可经由抗体的Fc部分结合于IgG1并且可混淆分析，所以使用具有H435R/Y436F突变的抗体(指定A6)来消除mAb的Fc区域与在Staph的表面上表达的蛋白A的非特异性结合(参看实施例9)。因此，比较各自含有H435R/Y436F突变的A6(构建体3)、PRASAA6(构建体4)和mAb-FN3结构域结合物。含有恒定区突变E233P/L234V/L235A(G236缺失)H435R/Y436F的具有对脂磷壁质酸(LTA)具特异性的V-区的构建体(称为“PRASAA6同型对照”)用作阴性对照，因为这种构建体的结合对于所选的金黄色葡萄球菌株为低的/阴性的。程序金黄色葡萄球菌Newman株在37℃下在脑心浸液(BHI)改良肉汤中在振荡下在225rpm下生长直至培养物达到大约0.5的OD600nM。等分试样在具有10％甘油(最终)的冷冻小瓶中冷冻。小瓶解冻并且用于通过连续稀释和BHI琼脂板上的生长来确定集落形成单位。关于流式细胞术分析，Newman株以每孔5×106个集落形成单位涂板并且在室温下在FACS缓冲液中用指示的mAb5133构建体连续稀释液孵育30分钟。样品用FACS缓冲液洗涤两次，接着用20μg/mlAlexa647结合的F(ab')2山羊抗人类IgG(重和轻)染色以检测构建体。使用BDFortessa和Flowjo软件分析样品。这些实验重复两次，具有类似结果。结果如图9所示，如通过流式细胞术结合所分析，构建体A6(构建体3)、PRASAA6(构建体4)和PRASAA6HC-AB(构建体6)具有类似的与Newman金黄色葡萄球菌株的结合。抗LukDFN3结构域添加至轻链中导致与不具有FN3结构域结合物的相同抗体(通过EC50测试mAb/EC50PRASAA6(构建体4)所计算)相比关于构建体PRASAA6LC-D(构建体5)和PRASAA6LC-DHC-AB(构建体7)的结合降低大约2至3倍。概述抗LukAB添加至重链中不会影响抗体与金黄色葡萄球菌的结合，而抗LukDFN3结构域添加至轻链的C端导致略微降低的与金黄色葡萄球菌Newman株的结合的检测(在两个独立实验中EC50的2至3倍改变)。实施例11.通过mAb-FN3结构域结合物中和白细胞毒素介导的免疫细胞杀灭。为了评估mAb-FN3结构域5133结合物的功能性，使用关于LukED和LukAB的中和的评估所述的基于细胞的细胞毒性中和分析。程序为了针对LukED和LukAB中和活性筛选mAb-FN3结构域5133结合物，75nMLukED和18.75nM活性LukAB毒素独立地在冰上用最终体积为30μl的递增浓度的不同mAb变体(IgG1同型对照；A6构建体3；PRASAA6构建体4)；PRASAA6LC-D构建体5；PRASAA6HC-D构建体8；PRASAA6HC-AB构建体6；PRASAA6LC-DHC-AB构建体7；PRASAA6HCAB-D构建体9；和PRASAA6HCD-AB构建体10)孵育30分钟。新鲜分离的原代人类中性粒细胞(hPMN)(2×105个细胞于70μlRPMI+10mMHEPES+0.1％HAS中)接着添加至毒素-mAb混合物中并且在37℃5％CO2孵育器中孵育1小时。膜损伤通过监测孵育后一小时的乳酸脱氢酶(LDH)释放来测量。取出50μl上清液并且添加至含有50μlLDH试剂(CytoTox-ONEHomogeneousMembraneIntegrityAssay,Promega)的孔中并且在室温下再孵育30min。使用PerkinElmerEnvisionMultilabel读取器(激发555nm、发射590nm)测量LDH活性并且数据针对由0.1％v/vTriton-X100诱导的100％PMN溶解标准化。结果分析不同的mAb5133和mAb-FN3结构域5133结合物中和LukED和LukAB对人类PMN的细胞毒性活性的能力。这些研究证明具有LukD(PRASAA6LC-D构建体5和PRASAA6HC-D构建体8)或抗LukABFN3结构域(PRASAA6HC-AB构建体6)的FN3结构域-mAb结合物能够中和对应的毒素，无论FN3结构域是否附接于轻链或重链(PRASAA6LC-D构建体5相对PRASAA6HC-D构建体8)(图10A)。此外，LukD和LukABFN3结构域与mAb5133的同时结合(PRASAA6LC-DHC-AB构建体7、PRASAA6HCAB-D构建体9和PRASAA6HCD-AB构建体10)(图10A-10B)还导致对应毒素的有效中和。概述这些研究显示仅FN3结构域-mAb结合物能够阻断原代hPMN的LukED和LukAB杀灭，而非IgG1同型对照、A6构建体3或PRASAA6构建体4mAb。总之，这些数据确定mAb-FN3结构域结合物为功能性的并且可阻断有效Staph毒素的细胞毒性活性。实施例12.mAb-FN3结构域结合物在金黄色葡萄球菌介导的人类中性粒细胞杀灭的模型中在吞噬后的中和效应。在由Staph产生的双组份毒素中，LukAB负责在用活细菌进行离体感染期间杀灭人类中性粒细胞(hPMN)。Staph产生的LukAB通过在吞噬后靶向质膜或吞噬体膜来杀灭hPMN。为了评估mAb-FN3结构域结合物是否保护hPMN在活Staph的吞噬后免于LukAB介导的杀灭，开发离体感染模型。程序Staph菌株Newman(高度有毒的甲氧西林敏感性菌株)1:100在RPMI+CAS中继代培养5小时并且标准化至在补充有10mMHEPES和0.1％HSA的RPMI(RPMI-HH)中的1×107CFU/mL。1mL标准化细菌的等分试样通过离心集结成粒并且以1.5mg/ml再悬浮于300μl不同mAb5133或mAb-FN3结构域结合物中或PBS(非调理)中。用RPMI-HH使样品达到1mL并且接着在37℃下孵育20分钟以进行调理。调理过的细菌随后与2×105个新鲜分离的原代hPMN以约10:1(细菌:hPMN)的感染复数(MOI)在补充有EtBr的RPMI-HH中混合。细菌和细胞通过在1500RPM下离心7分钟来同步并且放置于37℃5％CO2孵育器中。溴化乙锭荧光(作为hPMN膜渗透性的指标)在两小时感染期间加以测量。结果分析不同mAb5133和mAb-FN3结构域5133结合物中和LukAB的细胞毒性活性从而在Staph吞噬后保护hPMN的能力。这些实验证明与PBS处理的细菌(无mAb)相比，A6构建体3和PRASAA6构建体4mAb对hPMN赋予最小程度的保护以免于金黄色葡萄球菌介导的杀灭。相比之下，两种所测试的mAb-FN3结构域结合物(PRASAA6HC-AB构建体6和PRASAA6LC-DAB构建体7)保护hPMN免于吞噬后LukAB介导的膜损失。与含有抗LukAB和抗LukDFN3结构域的结合物的差异相比，在仅含有抗LukABFN3结构域的mAb-FN3结构域结合物之间未观察到显著差异(图11)。这一发现与离体感染模型期间LukED产生的缺乏一致(DuMont等人,“CharacterizationofaNewCytotoxinThatContributestoStaphylococcusaureusPathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；Alonzo等人,“StaphylococcusaureusLeucocidinEDContributestoSystemicInfectionbyTargetingNeutrophilsandPromotingBacterialGrowthInVivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABtoMediateEscapeFromWithinHumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)，其均以引用的方式整体并入本文)。概述这些实验确定StaphLukAB介导的吞噬后细胞毒性可能在细胞内由mAb-FN3结构域结合物中和。实施例13.在中性粒细胞介导的金黄色葡萄球菌杀灭模型中mAb-FN3结构域结合物的中和效应。LukAB在吞噬后杀灭hPMN并且促进Staph逃避和生长(DuMont等人,“CharacterizationofaNewCytotoxinThatContributestoStaphylococcusaureusPathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABtoMediateEscapeFromWithinHumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusLukABCytotoxinKillsHumanNeutrophilsbyTargetingtheCD11bSubunitoftheIntegrinMac-1,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA110:10794-10799(2013)，其均以引用的方式整体并入本文)。用缺乏lukAB的等基因缺失突变型菌株感染hPMN已经表明阻断LukAB活性会在离体OPK分析中减弱细菌生长(DuMont等人,“CharacterizationofaNewCytotoxinThatContributestoStaphylococcusaureusPathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABtoMediateEscapeFromWithinHumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusLukABCytotoxinKillsHumanNeutrophilsbyTargetingtheCD11bSubunitoftheIntegrinMac-1,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA110:10794-10799(2013)，其均以引用的方式整体并入本文)。为了研究LukABmAb-FN3结构域结合物是否促进hPMN介导的对金黄色葡萄球菌生长的控制；实施OPK分析，其中细菌生长通过测量GFP荧光来监测。程序关于这些实验，使用含有通过使用sarA启动子组成性地表达绿色荧光蛋白(gfp)的质粒的Staph菌株Newman(MSSA)。GFP标记的细菌1:100在补充有氯霉素的RPMI+CAS中继代培养5小时并且标准化至在补充有10mMHEPES和0.1％HSA的RPMI(RPMI-HH)中的1×107CFU/mL。1mL标准化细菌的等分试样通过离心集结成粒并且以1.5mg/ml再悬浮于300μl不同mAb或mAb-FN3结构域结合物中或PBS(非调理)中。用RPMI-HH使样品达到1mL并且接着在37℃下孵育20分钟以进行调理。调理过的细菌随后与2×105个新鲜分离的原代hPMN以约10:1(细菌:hPMN)的感染复数(MOI)在RPMI-HH中混合。细菌和细胞通过在1500RPM下离心7分钟来同步并且放置于37℃5％CO2孵育器中。感染后5小时测量GFP荧光，其为细菌生长的指标。结果分析不同mAb5133和mAb-FN3结构域5133结合物促进hPMN介导的Staph生长限制的能力。这些实验证明了与IgG1同型对照相比，A6构建体3和PRASAA6构建体4促进hPMN介导的金黄色葡萄球菌生长-限制(图12)。这与5133mAb的调理能力一致。重要的是，与PRASAA6亲本mAb(构建体4)相比，LukABFN3结构域-mAb5133结合物(PRASAA6HC-AB构建体6和PRASAA6LC-DHC-AB构建体7)增强PMN介导的生长限制(图12)。CR5133/抗LukDFN3结构域-mAb(PRASAA6LC-D构建体5)无法增强生长限制与先前的发现一致：在离体感染模型期间LukED产生为最小程度的(DuMont等人,“CharacterizationofaNewCytotoxinThatContributestoStaphylococcusaureusPathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；Alonzo等人,“StaphylococcusaureusLeucocidinEDContributestoSystemicInfectionbyTargetingNeutrophilsandPromotingBacterialGrowthInVivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；DuMont等人,“StaphylococcusaureusElaboratesLeukocidinABtoMediateEscapeFromWithinHumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)，其均以引用的方式整体并入本文)。概述这些实验确定抗LukABmAb-FN3结构域结合物中和LukAB，从而促进hPMN介导的Staph生长-限制。实施例14：用金黄色葡萄球菌细胞溶解产物对Ni-NTA树脂结合的SdrC4蛋白进行的体外糖基化会产生由mAb5133识别的表位。为了进一步验证SdgB介导的含SDR蛋白的糖基化导致产生由mAb5133识别的特异性表位，使用由不同金黄色葡萄球菌株制备的细胞溶解产物进行代表性SDR蛋白(由大肠杆菌纯化的重组SdrC4蛋白)的体外糖基化并且通过SDS-PAGE分离反应产物并且通过蛋白质印迹分析加以分析。这些研究使用获自NetworkonAntibioticResistanceinStaphylococcusaureus(NARSA)的USA300亲本JE2金黄色葡萄球菌株和具有使sdgA或sdgB糖基转移酶不活化的转座子插入的突变体(Fey等人,“AGeneticResourceforRapidandComprehensivePhenotypeScreeningofNonessentialStaphylococcusaureusGenes,”mBio4(1):e00537-12(2013)，其以引用的方式整体并入本文)。程序由金黄色葡萄球菌株JE2、NE381(JE2的sdgA转座子突变体)和NE105(JE2的sdgB转座子突变体)制备溶解产物。该菌株的25mL培养物在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中在37℃、200rpm下生长并且通过离心在6,000rpm下持续10分钟以0.4至0.6的OD600收集细胞。细胞球粒再悬浮于含有200μg溶葡球菌酶(SigmaL9043)和250单位的全能核酸酶(Pierce88700)的1mLPBS中。细胞在37℃下孵育45分钟并且接着在13,000rpm、4℃下离心持续10分钟。750μL上清液转移至另一管中并且放置于冰水。由大肠杆菌纯化的重组SdrC4蛋白结合于Ni-NTA琼脂糖(Qiagen1018244)。具体说来，100μLNi-NTA琼脂糖放置于微量离心管中，离心并且用含有蛋白酶抑制剂(RocheCompleteEDTA-free)的500μLPBS洗涤一次。该树脂接着与大约300μg蛋白一起再悬浮并且在摇动平台上在4℃下孵育1.5小时。树脂接着在12,000rpm下离心1分钟并且用500μL洗涤缓冲液(50mMNaH2PO4、300mMNaCl、10mM咪唑，pH8.0加上蛋白酶抑制剂)洗涤一次。该树脂接着再悬浮于300μLPBS或金黄色葡萄球菌溶解产物中并且在37℃下孵育1小时。1小时后，样品离心，用500μL洗涤缓冲液洗涤三次，并且结合的蛋白在150μL洗脱缓冲液(含有250mM咪唑的洗涤缓冲液)中在室温下洗脱5分钟。关于蛋白质印迹分析，洗脱的蛋白在70℃下在含有100mMDTT的1×LDS样品缓冲液(LifeTechnologiesNP0007)中加热10分钟，并且接着在两种10％bis-trisNuPAGE凝胶上在MOPS缓冲液中在150伏特下电泳1小时40分钟。在电泳后，一种凝胶用胶体蓝(LifeTechnologies46-7015和46-7016)染色，并且另一种凝胶使用iBlot仪器印迹于PVDF膜(LifeTechnologiesIB401002)。PVDF印迹用mAb5133在1:500稀释度下探测并且随后使用FemtoMax试剂盒(RocklandImmunochemicalsKCA001)检测。结果如图13所示，用由金黄色葡萄球菌株JE2(面板B，泳道2和6)制备的细胞溶解产物和其它情况下等基因的sdgA突变体衍生物(面板B，泳道3和7)孵育树脂结合的SdrC4蛋白导致在使用mAb5133的蛋白质印迹法中检测特异性约95kDa物质。相比之下，在用由金黄色葡萄球菌株JE2的sdgB突变体衍生物(面板B，泳道4和8)制备的溶解产物孵育树脂结合的SdrC4蛋白之后或在其中PBS置换细胞溶解产物的对照样品(面板B，泳道1和5)中未由mAb5133检测到蛋白色带。图13面板A中所示的胶体蓝染色的凝胶指示基本上等量的重组SdrC4蛋白装载于泳道1-4和5-8中。概述在用由菌株JE2的sdgB突变体制备的溶解产物孵育柱结合的SdrC4蛋白之后用mAb5133无法检测到约95kDa蛋白色带进一步支持以下论点：SdgB为用于SdrC蛋白的特异性糖基转移酶并且为mAb5133的表位的产生所必需的。实施例15：用纯化的SdgB糖基转移酶蛋白对SdrC4或SdrC5蛋白进行的体外糖基化导致产生由mAb5133识别的表位。为了进一步验证SdgB介导的含SDR蛋白的糖基化导致产生由mAb5133识别的特异性表位，使用金黄色葡萄球菌SdgB糖基转移酶的重组形式进行代表性SDR蛋白(SdrC4或SdrC5)的体外糖基化并且通过SDS-PAGE分离反应产物并且通过蛋白质印迹分析加以分析。程序具有C端聚组氨酸(His)6亲和标签的金黄色葡萄球菌SdgB糖基转移酶的重组形式(SEQIDNO:99)在大肠杆菌中表达并且经由Ni-NTA亲和色谱法纯化。关于体外糖基化反应，100μg重组SdrC4(SEQIDNO:100)或SdrC5(SEQIDNO:101)蛋白在37C下在最终体积100μl的100mMTrispH7.5或100μl100mMTrispH7.5加上10％甘油中+/-30μg尿苷二磷酸N-乙酰基葡糖胺(UDP-GlcNac)+/-4μg重组SdgB孵育1小时。关于蛋白质印迹分析，反应产物首先通过SDS-PAGE以在200V恒定下在NuPAGE4-12％Bis-TrisGel(NP0335BOX)上分离的每个泳道1μg蛋白解析，直至染料前部已经到达凝胶的底部。蛋白接着使用InvitrogeniBlot转移至PVDF膜(TransferiBlotGelTransferStacksPVDFIB401002)。在图14A面板A中，原代抗体为PBS+3％BSA中2μg/ml的构建体3(mAb5133A6；SEQIDNO:64HC和65LC)并且二次检测抗体为PBS+3％BSA蛋白质印迹中处于1:10,000稀释度下的来自JacksonImmunoresearch(109-036-088批号101421)的HRP结合的山羊抗人类IgG(H+L)。在HRP化学发光底物检测溶液(PierceECLPlus)中孵育之后，印迹暴露于X射线片。在图14A面板B中，用于抗His标签检测的原代抗体为PBS+3％BSA中处于1:2000稀释度下的HRP结合的抗6x组氨酸mAb(MAB050H批号EGE0608041,R&DSystems)，其中经由X射线片进行后续检测。在图14B面板A中，原代抗体为PBS+3％BSA中2μg/ml的构建体3(mAb5133A6；SEQIDNO:64HC和65LC)并且二次检测抗体为PBS+3％BSA蛋白质印迹中处于1:10,000稀释度下的来自JacksonImmunoresearch(109-036-088批号101421)的HRP结合的山羊抗人类IgG(H+L)。在HRP化学发光底物检测溶液(PierceECLPlus)中孵育之后，印迹暴露于X射线片。接着使用ThermoScientificRestoreWestern剥离缓冲液剥离该印迹并且接着使用PBS+3％BSA中处于1:2000稀释度下的HRP结合的抗6x组氨酸mAb(MAB050H批号EGE0608041,R&DSystems)进行抗his检测，其中经由X射线片进行后续检测(图14B，面板B)。在图14C面板A中，原代抗体为Rockland荧光western阻断缓冲液(MB-070)中2μg/ml的构建体1(mAb5133；SEQIDNO:60HC和61LC)。二次检测使用IRDye800CW山羊抗人类IgG(H+L)Li-cor926-32232，其中使用OdysseyInfraRed成像仪进行检测。在图14C面板B中，抗His检测使用PBS+3％BSA中处于1:2000稀释度下的HRP结合的抗6x组氨酸mAb(MAB050H批号EGE0608041,R&DSystems)，其中经由X射线片进行后续检测。结果如图14A、14B和14C所示，在SdgB和UDP-GlcNAc存在下孵育由大肠杆菌纯化的重组SdrC4或SdrC5蛋白导致产生由构建体1(mAb5133；SEQIDNO:60HC和61LC)和构建体3(mAb5133A6；SEQIDNO:64HC和65LC)检测的物质。所有泳道中SdrC4和SdrC5构建体的(His)6表位的检测验证了接近等量的蛋白存在。概述这些结果进一步证实了先前的观察结果：mAb5133仅在SdgB介导的糖基化后检测SDR家族蛋白。实施例16：mAb5133不特异性结合金黄色葡萄球菌脂磷壁质酸(LTA)。金黄色葡萄球菌的脂磷壁质酸(LTA)先前已经鉴定为mAb5133的细胞靶标(Throsby等人的美国专利号8,460,666，其以引用的方式整体并入本文)。为了确定这是否确实为实情，在平行ELISA格式分析中确定mAb5133与表面结合的金黄色葡萄球菌LTA和重组SdgB糖基化SdrC4蛋白的相对结合。作为LTA结合的阳性对照，包括帕吉昔单抗(SEQIDNO:102HC+SEQIDNO:103LC)，一种充分表征的抗LTAmAb(GinsburgI.,“RoleofLipoteichoicAcidinInfectionandInflammation,”LancetInfect.Dis.2(3):171-9(2002)；Weisman等人,“SafetyandPharmacokineticsofaChimerizedAnti-LipoteichoicAcidMonoclonalAntibodyinHealthyAdults,”InternationalImmunopharmacol.9:639-644(2009)，其以引用的方式整体并入本文)。作为SdgB糖基化SdrC4蛋白和LTA的结合的阴性对照，还包括CNTO3930(SEQIDNO:104HC+SEQIDNO:105LC)，一种特异性地靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白的mAb。程序高结合96孔ELISA板(Nunc)涂布有PBS中5μg/mL的SdgB糖基化重组SdrC4蛋白或金黄色葡萄球菌脂磷壁质酸(LTA)(L2515,Sigma)并且在4℃下孵育过夜。板用ELISA洗涤缓冲液(0.15MNaCl,0.02％Tween-20)洗涤三次并且在环境温度下用阻断缓冲液(SuperblockThermo37515)阻断一小时。在独立稀释板中，抗体从10μg/mL开始连续地三倍稀释于3％BSA-PBS阻断缓冲液中。ELISA板用ELISA洗涤缓冲液洗涤三次并且抗体稀释液从稀释板转移至ELISA板并且在环境温度下孵育一小时。ELISA板用ELISA洗涤缓冲液洗涤三次并且二次山羊抗人类Fcγ特异性HRP(JacksonImmunoresearch109-035-098)1:15,000稀释于阻断缓冲液中并且添加至该板中。板在环境温度下用二次抗体孵育一小时，接着用ELISA洗涤缓冲液洗涤五次。TMB底物(Fitzgerald)接着添加至该板中并且允许显影大约四分钟，并且接着反应通过添加0.5MHCl来终止。在SpectraMaxM5Microplate读取器上在450nm下读取吸光度。使用GraphPadPrism分析数据。值转换为log标尺并且使用非线性回归S形剂量-反应等式拟合，关于针对各抗原的各抗体产生11点结合曲线。结果如图15面板A所示，mAb5133展现与SdgB糖基化SdrC4蛋白的有效且浓度依赖性结合。相比之下，用帕吉昔单抗或CNTO3930未检测到与SdgB糖基化SdrC4蛋白的结合。图15面板B显示各测试物品与纯化的金黄色葡萄球菌LTA的相对结合并且如所预期，帕吉昔单抗展现有效且浓度依赖性结合。相比之下，用CNTO3930或mAb5133分别未检测到与LTA的结合或检测到与LTA的极其微弱的结合。mAb5133与金黄色葡萄球菌LTA的表观微弱结合可通过由原生SDR蛋白污染LTA制剂来说明，因为已知LTA制剂通常受宿主蛋白污染(Silvestri等人,“Purificationoflipoteichoicacidsbyusingphosphatidylcholinevesicles,”InfectionandImmunity22(1):107-118(1978)，其以引用的方式整体并入本文)。概述这些结果表明mAb5133识别SdgB糖基化SDR家族蛋白而非LTA。实施例17：mAb5133和具有PRASA和/或A6突变的变体保留结合于人类和小鼠FcRn受体。为了证明PRASA和A6突变不会显著干扰在确定抗体的体内半衰期中起关键作用(Kuo和Aveson,“NeonatalFcReceptorandIgG-BasedTherapeutics,”mAbs3(5):422-30(2011)，其以引用的方式整体并入本文)的FcRn受体的衔接，在ELISA格式竞争结合分析中针对与纯化的人类和/或小鼠FcRn受体的结合测试mAb5133和具有PRASA和/或A6突变的变体(Kinder等人,“EngineeredProtease-ResistantAntibodiesWithSelectableCell-KillingFunctions,”J.Biol.Chem.288:30843-30854(2013)，其以引用的方式整体并入本文)。程序所用的测试物品为mAb5133(SEQIDNO:60HC和61LC)、mAb5133PRASA(SEQIDNO:62HC和63LC)、mAb5133A6(SEQIDNO:64HC和65LC)和mAb5133PRASAA6(SEQIDNO:66HC和67LC)。CNTO3929(SEQIDNO:106HC和107LC)，一种靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白的人类IgG1抗体，用作竞争者mAb。使用竞争结合分析来分析不同测试物品与人类或小鼠FcRn-His6的重组形式(其中FcRn的跨膜和细胞质结构域与聚组氨酸亲和标签置换)的相对亲和力。在用于这些分析中之前，测试物品和CNTO3929在4℃下透析至MES缓冲液(0.05MMES,pH6.0)中过夜。96孔铜涂布板(ThermoScientific)用于捕捉磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中5μg/mL的FcRn-His6，之后板用0.15MNaCl、0.02％Tween20(pH约为5)洗涤并且接着用阻断试剂(0.05MMES、0.025％BSA、0.001％Tween20，pH6.0加上10％ChemiBLOCKER(Millipore))孵育。板如先前进行洗涤，并且接着竞争者测试抗体于阻断试剂中的连续稀释液在固定1μg/mL浓度的生物素标记的CNTO3929制剂存在下添加至该板中。板在室温下孵育1h，如先前洗涤三次，并且接着在室温下用抗生蛋白链菌素-HRP(JacksonImmunoResearchLaboratories)的1:10,000稀释液孵育30min。板如上文洗涤五次，并且结合的抗生蛋白链菌素-HRP通过添加具有StableStop(FitzgeraldIndustriesInternational)的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺过氧化物酶底物并且赋予4min来检测。通过添加0.5MHCl来终止显色。光学密度用SpectraMaxPlus384板式读取器(MolecularDevices)在450-nm波长下确定。数据使用GraphPadPrismv5拟合至S形剂量-反应曲线。结果如图16(面板A)所示，具有PRASA和/或A6突变的mAb5133变体在用于这种体外竞争结合分析(在pH6.0下进行)中的条件下展现与人类FcRn受体的不易觉察的结合。同样，如图16(面板B)所示，具有PRASA和A6突变的mAb5133变体在用于这种体外竞争结合分析中的条件下展现几乎与mAb5133的结合同一的与小鼠FcRn受体的结合。概述单独或组合引入PRASA和A6突变对mAb5133变体体外对于人类或小鼠FcRn受体的亲和力具有最小程度的(如果有的话)可检测影响。实施例18：具有PRASA和/或A6突变的融合蛋白保留结合于人类FcRn受体。为了证明在mAb-FN3结构域融合蛋白的情形中PRASA和A6突变不会显著干扰FcRn受体的衔接，在ELISA格式竞争结合分析中针对与纯化的人类FcRn受体的结合测试具有PRASA和/或A6突变的一系列融合蛋白(Kinder等人,“EngineeredProtease-ResistantAntibodiesWithSelectableCell-KillingFunctions,”J.Biol.Chem.288:30843-30854(2013)，其以引用的方式整体并入本文)。程序所用的测试物品为mAb5133PRASAA6(SEQIDNO:66HC和67LC)、mAb5133PRASAA6HCLukAB(SEQIDNO:70HC和71LC)、mAb5133PRASAA6HCLukD(SEQIDNO:74HC和75LC)、mAb5133PRASAA6HCLukDHCLukAB(SEQIDNO:78HC和79LC)和mAb5133PRASAA6HCLukABHCLukD(SEQIDNO:76HC和77LC)。CNTO3929(SEQIDNO:106HC和107LC)，一种靶向呼吸道合胞病毒F(RSV-F)糖蛋白的人类IgG1抗体，用作竞争者mAb。使用竞争结合分析来分析不同测试物品与人类FcRn-His6的重组形式(其中FcRn的跨膜和细胞质结构域与聚组氨酸亲和标签置换)的相对亲和力。在用于这些分析中之前，测试物品在4℃下透析至MES缓冲液(0.05MMES,pH6.0)中过夜。96孔铜涂布板(ThermoScientific)用于捕捉磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中5μg/mL的FcRn-His6，之后板用0.15MNaCl、0.02％Tween20(pH约为5)洗涤并且接着用阻断试剂(0.05MMES、0.025％BSA、0.001％Tween20，pH6.0加上10％ChemiBLOCKER(Millipore))孵育。板如先前进行洗涤，并且接着竞争者测试抗体于阻断试剂中的连续稀释液在固定1μg/mL浓度的生物素标记的CNTO3929制剂存在下添加至该板中。板在室温下孵育1h，如先前洗涤三次，并且接着在室温下用抗生蛋白链菌素-HRP(JacksonImmunoResearchLaboratories)的1:10,000稀释液孵育30min。板如上文洗涤五次，并且结合的抗生蛋白链菌素-HRP通过添加具有StableStop(FitzgeraldIndustriesInternational)的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺过氧化物酶底物并且赋予4min来检测。通过添加0.5MHCl来终止显色。光学密度用SpectraMaxPlus384板式读取器(MolecularDevices)在450-nm波长下确定。数据使用GraphPadPrismv5拟合至S形剂量-反应曲线。结果如图17所示，具有重链附接的抗LukD和/或抗LukABFN3结构域的基于mAb5133PRASAA6的融合蛋白在用于这种体外竞争结合分析(在pH6.0下进行)中的条件下展现与人类FcRn受体的结合，其中与亲本mAb(mAb5133PRASAA6)相比关于融合蛋白观察到略微更微弱的结合。概述引入PRASA和A6突变对基于mAb5133的融合蛋白体外对于人类FcRn受体的亲和力具有最小程度的影响。实施例19：具有A6突变的mAb1533变体不能与金黄色葡萄球菌IgG结合蛋白蛋白-A或Sbi中的任一者衔接。金黄色葡萄球菌表达两种已知的免疫球蛋白结合蛋白蛋白A(参看FosterT.J.,“ImmuneEvasionbyStaphylococci,”NatureReviewsMicrobiology3:948-958(2005)，其以引用的方式整体并入本文，和免疫球蛋白的第二结合蛋白(Sbi)(Zhang等人,“ASecondIgG-BindingProteininStaphylococcusaureus,”Microbiology144:985-991(1998)，其以引用的方式整体并入本文)，蛋白各自以细胞表面锚定或分泌形式展示(Smith等人,“TheImmuneEvasionProteinSbiofStaphylococcusaureusOccursBothExtracellularlyandAnchoredtotheCellEnvelopebyBindingtoLipotechoicAcid”Mol.Microbiol.83:789-804(2012)；Becker等人,“ReleaseofProteinAFromtheCellWallofStaphylococcusaureus,”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)111(4):1574-9(2014)，其以引用的方式整体并入本文)并且共享参与结合于IgG蛋白的Fc区的一对保守螺旋(Atkins等人,“S.aureusIgG-bindingProteinsSpAandSbi:HostSpecificityandmechanismsofImmuneComplexFormation,”Mol.Immunol.45:1600-1611(2008)，其以引用的方式整体并入本文)。为了进一步证明具有A6突变的mAb5133变体不能与金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白结合蛋白中的任一者衔接，对由表达蛋白A和Sbi或仅表达这两种蛋白之一的一系列菌株制备的溶解产物进行蛋白质印迹分析。程序用于Western分析的测试物品为mAb5133(SEQIDNO:60HC和61LC)、mAb5133A6(SEQIDNO:64HC和65LC)和mAb5133PRASAA6(SEQIDNO:66HC和67LC)。溶解产物由金黄色葡萄球菌株JE2(Fey等人,“AGeneticResourceforRapidandComprehensivePhenotypeScreeningofNonessentialStaphylococcusaureusGenes,”MBio.4:e00537-12(2013)，其以引用的方式整体并入本文)和Newman(Baba等人,“GenomeSequenceofStaphylococcusaureusStrainNewmanandComparativeAnalysisofStaphylococcalGenomes:PolymorphismandEvolutionofTwoMajorPathogenicityIslands,”J.Bacteriol.190(1):300-10(2008)，其以引用的方式整体并入本文)(均为用于表达蛋白A和Sbi的野生型)、JE2NE286(JE2的spa转座子插入突变体)、NE453(JE2的sbi转座子插入突变体)和Wood46(已知缺乏蛋白A的表达的菌株的衍生物制备(Forsgen等人,“LymphocyteStimulationbyProteinAofStaphylococcusaureus,”Eur.J.Immunol.6:207(1976)；Ringdenetal.,“ActivationofHumanBandTLymphocytesbyProteinAofStaphylococcusaureus,”Eur.J.Immunol.8:47(1978)，其以引用的方式整体并入本文)。简单地说，该菌株的培养物在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中在37℃、200rpm下生长并且在过夜生长后通过离心在6,000rpm下持续10分钟从1mL培养物收集细胞。细胞球粒再悬浮于1mL溶葡球菌酶缓冲液(50mMTris,pH8.0,20mMMgCl2，具有1微克/mL的溶葡球菌酶(SigmaL-9043))中。关于Western分析，约30微升的各样品与约10微升的4xNuPAGELDS样品缓冲液(InvitrogenNP0007)混合并且在4-12％梯度NuPAGE凝胶上电泳。凝胶转移至PVDF膜并且随后在PBS/3％牛奶溶液中阻断1小时。Western检测测试物品在室温下在Rockland荧光western阻断缓冲液中在轻柔搅动下以2μg/mL与印迹一起孵育(持续>＝2小时)并且用1XPBS0.5％洗涤四次(每次洗涤10min)。接着在室温下与二次抗体(山羊抗人类IgG(H+L)Li-coIRDye(1:10,000)一起孵育1小时印迹并且接着用1XPBS0.5％洗涤4次(每次洗涤10min)。在洗涤之后，使用OdysseyInfraRed成像仪使蛋白质印迹膜成像。结果如图18A面板A所示，mAb5133在所有测试菌株中检测到一系列对应于丝氨酸天冬氨酸重复序列(SDR)蛋白家族成员的糖基化形式的蛋白(标记C)。关于菌株JE2(泳道1)，在大约55kDa和48kDa处迁移的色带分别通过对应于蛋白A和Sbi蛋白的mAb5133检测。如所预期，仅约48kDaSbi蛋白在由缺乏蛋白A:JE2NE286(泳道2)和Wood46菌株(泳道4)的表达的两种菌株制备的溶解产物中由mAb5133检测到。相比之下，仅约55kDa蛋白A色带在由缺乏Sbi蛋白:NE453(泳道3)的菌株制备的溶解产物中由mAb5133检测到。如图18B面板B所示，对应于蛋白A或Sbi蛋白的色带在这些相同溶解产物中均未由mAb5133A6测试物品检测到并且支持以下观点：A6突变消除与两种蛋白的结合。同样，如图18B面板C所示，mAb5133PRASAA6测试物品无法在由表达这两种蛋白的金黄色葡萄球菌株Newman或JE2制备的溶解产物中检测到蛋白A或Sbi蛋白。概述这些结果证明具有A6突变的mAb5133变体不能与金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白结合蛋白蛋白A或Sbi中的任一者衔接并且由ELISA格式分析(实施例9，图8)证实了先前的观察结果，在该分析中关于具有A6突变的一系列测试物品未检测到与蛋白A的结合。实施例20：由FN3结构域结合并且中和γ溶血素HlgAB和HlgCB和Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)。为了证明FN3结构域的子集能够展现结合于并且中和多种白细胞毒素，使用γ溶血素HlgAB和HlgCB和Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)进行一系列研究。程序这些研究中所包括的测试物品包括Luk129(SEQIDNO:151)、Luk151(SEQIDNO:163)、Luk188(SEQIDNO:185)、Luk357(SEQIDNO:339)、Luk540(SEQIDNO:424)和Luk647(SEQIDNO:526)的重组、纯化的聚组氨酸标记形式。FN3结构域与纯化的重组白细胞毒素的结合通过ELISA确定。简单地说，96孔WhiteMaxisorp板(Nunc-目录号436110)的每孔添加100μl5μg/mL的抗生蛋白链菌素溶液(于PBS中)并且在4℃下孵育过夜。孔接着用TBST(50mMTrisHCl(pH7.4)、150mMNaCl、0.1％Tween20)洗涤3次并且用StartingBlockT20(Pierce目录号37543)以每孔300μL阻断并且在室温(RT)下孵育45-60分钟。接着用TBST洗涤板3次并且0.2μg的白细胞毒素靶标蛋白的生物素标记形式(于100μL中)添加至各测试孔中并且在RT下在轻柔振荡下孵育板45-60分钟。接着用TBST洗涤板3次。测试物品在StartingBlockT20中稀释至1μM并且100μL添加至测试孔中并且在RT下在轻柔振荡下孵育板45-60分钟。接着用TBST洗涤板3次。关于结合的测试物品的检测，添加每孔100μL的1:5000稀释于StartingblockT20中的多克隆抗FN3-HRP抗体并且在RT下在轻柔振荡下孵育板45-60分钟。接着用TBST洗涤板3次。为了检测结合的抗FN3-HRP抗体，在板读取之前即刻添加每孔100lμL的POD化学发光底物(Roche-目录号11582950001)并且在底物添加的15分钟内使用Paradigm或Envision读取器读取该板。关于白细胞毒素中和研究，Fn3结构域测试物品(每孔4μg/10μl的400μg/ml)在4℃下与纯化的重组白细胞毒素一起孵育30min。新鲜分离的原代人类中性粒细胞(hPMN，200,000个细胞于RPMI+10mMHEPES+0.1％HSA中)添加至毒素和FN3结构域蛋白的混合物中至100μl的最终体积。溴化乙锭接着以1:2000最终稀释度添加至细胞中并且板在毒素添加后30和60min读取。在37℃CO2孵育器中中毒1小时之后，使板1500RPM短暂离心持续10min，之后将25μl上清液小心地转移至新的板中。CellTiter试剂(Promega)添加至剩余细胞中并且孵育1.5小时。25μl上清液与等量的CytoTox-ONETM分析试剂(Promega)混合，分析试剂快速地测量具有损伤膜的细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放。释放至培养基中的LDH用10-分钟偶联酶分析测量，该分析导致刃天青转化为荧光试卤灵产品。关于中和实验，使用以下浓度的纯化的重组白细胞毒素：HlgAB1.25μg/mL、HlgCB0.63μg/mL和PVL0.31μg/mL。结果如图19所示，Fn3结构域变体Luk151展现结合于HlgA亚单位，但不中和HlgAB白细胞毒素的溶细胞活性。相比之下，Luk129展现结合于HlgA亚单位并且中和HlgAB白细胞毒素的溶细胞活性，如通过LDH释放的完全抑制所例示。如图20所示，Fn3结构域变体Luk357展现结合于HlgC亚单位，但不中和HlgCB白细胞毒素的溶细胞活性。相比之下，Luk188展现结合于HlgC亚单位并且中和HlgCB白细胞毒素的溶细胞活性，如通过LDH释放的完全抑制所例示。如图21所示，Fn3结构域变体Luk540展现结合于PVL白细胞毒素的LukS-PV亚单位，但不中和PVL的溶细胞活性。相比之下，Luk647展现结合于PVL白细胞毒素的LukS-PV亚单位并且中和PVL白细胞毒素的溶细胞活性，如通过LDH释放的完全抑制所例示。概述已经鉴定展现结合于和/或中和γ溶血素HlgAB和HlgCB和Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的FN3结构域。表6.本公开的核酸和氨基酸序列当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3