本发明涉及一种以从自然界中分离的对大肠杆菌具有广泛抗菌活性的噬菌体为有效成份且可用于防止或处理大肠杆菌感染的组合物及利用该组合物的防止或处理大肠杆菌感染的方法。具体讲，就是涉及一种在防止大肠杆菌感染和感染后以处理目的而使用的组合物，该组合物将带有由序列号1-25特定的部分序列基因组的噬菌体和以所述噬菌体为有效成份包含；以及利用该组合物防止大肠杆菌感染与感染后的处理方法。
背景技术：
：：大肠杆菌是属于杆菌的肠内细菌，还属于革兰氏阴性菌。大部分的大肠杆菌都是常驻菌，而不是病原菌。但是E.coliO157：H7或肠内毒素型大肠杆菌(ETEC，enterotoxigenicE.coli)等作为病原性大肠杆菌会在人体诱发食物中毒或让牛、猪、羊等多种动物产生腹泻。病原性大肠杆菌在60℃的条件下加热10分钟时会产生失去活性的不耐热性肠毒素(heat-labileenterotoxin，LT)，或者在100℃的条件下加热30分钟还产生显示出抵抗性的耐热性肠毒素(heat-stableenterotoxin，ST)。病原性大肠杆菌中的肠内毒素型大肠杆菌会给动物带来严重的问题，新生仔猪或断奶仔猪的腹泻症在畜牧业属于非常大的问题。其中，K88型大肠杆菌、K99型大肠杆菌、987P型大肠杆菌及F41型大肠杆菌是主要的肠内毒素型病原性大肠杆菌形态。由于这种病原性大肠杆菌的危害性，因此就迫切需要研发出一种能够防止其感染并能够有效处理其感染的方法。过去针对这种病原性大肠杆菌感染的防止或处理一直使用多种抗生素，但是现在随着耐抗生素菌的不断增加，就急需确定一种除抗生素之外的其它有效方案。最近，作为应对细菌性疾病的方案，噬菌体(bacteriophage)的使用受到了极大关注。特别是，由于人们普遍喜欢选择自然、环保的方式，因此可以说当前人们对噬菌体的关注度比任何时候都要高。噬菌体作为感染细菌的非常小的微生物，也普遍被简称为抗菌素(phage)。噬菌体感染(infection)细菌后，就在细菌细胞内部进行繁殖。完成繁殖后，子孙噬菌体游离到细菌外时就可以通过破坏宿主即细菌细胞壁的方式将细菌杀灭。噬菌体感染细菌的方式具有非常高的特异性，因此能够感染特定细菌的噬菌体种类仅限定在一部分。即，特定噬菌体只能感染特定范围内的细菌。因此，噬菌体只杀灭特定的细菌，而对其它细菌并不产生影响。噬菌体是英国细菌学家Twort于1915年在对葡萄球菌(Micrococcus)菌落被某种物质熔化变透明的现象进行的研究中发现的。另外，1917年法国细菌学家d'Herelle发现痢疾患者粪便的过滤液中存在熔化志贺氏菌(Shigelladisentriae)作用的物质，他通过对此现象进行研究而独立发现了噬菌体，并从猎食细菌的含义出发将其命名为“噬菌体”。此后，针对痢疾菌、伤寒杆菌、霍乱菌等多种病原性细菌的噬菌体相继被发现。由于其具有杀灭细菌的特殊能力，因此噬菌体被发现之后，研发人员都期望其能够成为应对细菌感染的有效方案，并开展了大量的相关研究。但是，Flemming发现青霉素之后，抗生素得到广泛普及，因此针对噬菌体的研究就仅限于在一部分东欧国家和原苏联开展。不过，2000年以后，由于耐抗生素菌的增加，现有抗生素表现出一定的局限性。研发人员又开始探讨是否能够研究出一种可替代现有抗生素的物质，噬菌体作为一种抗菌剂重新受到关注。特别是，最近随着世界各国从政府角度对抗生素的使用强化了规制，因此进一步提升了人们对噬菌体的关注度。技术实现要素：技术问题因此，本发明人为了利用从自然界中分离的对包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌具有广泛抗菌活性的噬菌体研发可用于防止或处理大肠杆菌感染的组合物以及利用该组合物研发防止或处理大肠杆菌感染的方法而进行了不懈努力，最终从自然界中分离出了合适的对大肠杆菌具有广泛抗菌活性的噬菌体。为了能够将分离的噬菌体与其它噬菌体相区别而赋予其基因组的部分序列。然后，研发出了以所述分离的噬菌体为有效成份的组合物，并确认该组合物可有效地用于防止及处理大肠杆菌的感染，由此完成了本发明。因此，本发明的一个目的在于，提供一种对包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌具有广泛抗菌活性的新型分离的噬菌体。本发明的另一个目的在于，提供一种以对包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌具有广泛抗菌活性的新型分离的噬菌体为有效成份包含的可用于防止大肠杆菌感染的组合物及利用该组合物防止大肠杆菌感染的方法。本发明的另一个目的在于，提供一种以对包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌具有广泛抗菌活性的新型分离的噬菌体为有效成份包含的可用于处理大肠杆菌感染的组合物及利用该组合物处理大肠杆菌感染的方法。本发明的另一个目的在于，提供一种利用所述组合物用于防止及处理大肠杆菌感染的消毒剂。本发明的另一个目的在于，提供一种利用所述组合物用于防止及处理大肠杆菌感染的饮用水添加剂。本发明的另一个目的在于，提供一种利用所述组合物用于防止及处理大肠杆菌感染的饲料添加剂。技术方案本发明提供了一种以从自然界中分离的对包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌具有广泛抗菌活性的噬菌体为有效成份包含的组合物及利用该组合物防止及处理大肠杆菌感染的方法。作为本发明组合物的有效成份包含的分离噬菌体是一种对包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌具有广泛抗菌活性并且作为基因组特征带有以序列号1-25表示的部分序列的噬菌体EK88P-1。噬菌体EK88P-1在由本发明人分离后于2014年4月10日保藏于韩国生命工学研究院生物资源中心保藏号KCTC12574BP)。另外，本发明提供了一种可用于防止或处理大肠杆菌感染的消毒剂、饮用水添加剂及饲料添加剂。本发明组合物所含噬菌体EK88P-1对包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌具有广泛抗菌活性，因此它在预防(防止感染)或治疗(处理感染)因包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌诱发的多种疾病方面具有有益效果。因此，本发明的组合物可用于预防及治疗因包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌诱发的疾病。本说明书中所称“包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌诱发的疾病”是对因感染包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌而出现的病死、腹泻及生长迟缓等各种症状的总称。本说明书中使用的“处理”或“治疗”等术语的涵义为：(ⅰ)对因包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌诱发的疾病进行抑制；(ⅱ)减轻因包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌诱发的疾病。本说明书中的“分离”或“分离的”是指在自然状态下利用多种实验方法分离噬菌体和为了将其与其它噬菌体区分而使其具有特定特征的过程。此外，还包括为了能够在产业中使用噬菌体通过生物工程技术对其进行繁殖。本发明的噬菌体包括噬菌体EK88P-1及其变体(variants)。本说明书中的“变体”是指有基因组序列(genomicsequence)或遗传信息编码(coding)的多肽(polypeptide)中虽然存在微小变异(minorvariation)但整体上具有的基因型(genotypic)及表型(phenotypic)特征相同于噬菌体EK88P-1的噬菌体。所述变体自然也包括多态性变体(polymorphicvariants)。优选地，所述变体具有与噬菌体EK88P-1相同(same)或同等的(equivalent)生物学功能(biologicalfunction)。本发明的组合物中所包含的药剂学上允许使用的载体是在制药时通常都会用到的，上述载体包括：葡萄糖、麦芽糊精、乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基羟苯酸酯(Propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并非仅限定于此。本发明的组合物除了包含上述成份之外，还包括：润滑剂、润湿剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。本发明的组合物以噬菌体EK88P-1或其变体作为有效成份包含在内。此时，其所含的噬菌体EK88P-1或其变体含量为1×101pfu/ml～1×1030pfu/ml或1×101pfu/g～1×1030pfu/g。优选地，其含量为1×104pfu/ml～1×1015pfu/ml或1×104pfu/g～1×1015pfu/g。本发明的组合物可以按照具有本发明所属
技术领域：
：相关知识的人很容易实施的方法，利用药学上允许使用的载体及/或赋形剂进行制备，既可以按照单位用量形态制备也可以装入大容量容器内而制备。在这种情况下，剂型既可以是油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态或者萃取剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，也可以是分散剂或稳定剂形态。本发明的组合物并非仅局限于上述形态，根据使用方式的不同也可以制成消毒剂、饮用水添加剂及饲料添加剂。有益效果本发明的组合物及利用该组合物防止及处理包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌感染的方法与基于现有抗生素等化学物质的方式相比，它对包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌具有非常高的特异性。这意味着它在不影响其它有用常驻菌的前提下可用于防止或处理包括K88型大肠杆菌在内的多种大肠杆菌感染，由此产生的副作用很小。通常情况下，如果使用抗生素等化学物质，普通常驻菌也会遭受损害，最终导致动物的免疫力下降，从而产生多种副作用。另外，本发明通过分离出自然界已经存在的噬菌体用作组合物的有效成份，因此很具有环境友好性。附图说明图1是噬菌体EK88P-1的电子显微镜照片；图2是显示通过一维电泳法对噬菌体EK88P-1的主要结构蛋白进行分析的结果。泳道M是蛋白质大小标记，泳道1是噬菌体EK88P-1的蛋白质样本，主要结构蛋白用*标记。图3是示出了以噬菌体EK88P-1的基因组为模型的聚合酶链式反应结果。泳道1是使用序列号26及序列号27的聚合酶链式反应结果，泳道2是使用序列号28及序列号29的聚合酶链式反应结果，泳道3是使用序列号30及序列号31的聚合酶链式反应结果，泳道4是使用序列号32及序列号33的聚合酶链式反应结果，泳道5是使用序列号34及序列号35的聚合酶链式反应结果，泳道M是DNA大小标记。图4示出了噬菌体EK88P-1对大肠杆菌的杀灭能力的代表性的实验结果。所形成的透明圆斑是培养皿上生长的大肠杆菌被溶解后最终形成的噬菌斑。具体实施方式下面，将依据实施例对本发明进行更加具体的说明。但是，这些实施例仅是为了对本发明进行说明而列举的示例，本发明的范围并非仅限定于这些实施例。实施例1：分离能杀灭大肠杆菌的噬菌体筛选能杀灭大肠杆菌的噬菌体时利用从自然环境中获取的样本。另外，用于分离噬菌体的大肠杆菌由本发明人预先分离出来并鉴定(identification)其为K88型大肠杆菌。下面，详细介绍一下噬菌体分离过程。将采集的样本与大肠杆菌一起添加到按1/1000比例接种的TSB(胰蛋白酶大豆肉唐)培养基(酪蛋白胰酶消化物，17g/L；大豆木瓜酶消化物，3g/L；右旋糖，2.5g/L；氯化钠，5g/L；磷酸氢二钾，2.5g/L)中，然后在37℃的条件下振荡培养3-4小时。培养后，以8,000rpm离心分离20分钟，回收上清液。将大肠杆菌按1/1000比例接种到回收的上清液中后再在37℃的条件下振荡培养3-4小时。当样本中含有噬菌体的情况下，为了使噬菌体的数(titer)增加，重复执行这一过程，总共实施了5次。重复实施5次后，将培养液以8,000rpm离心分离了20分钟。离心分离后，将回收的上清液利用0.45μm的过滤器进行过滤。通过利用获得的过滤液进行普通的点滴试验(spotassay)调查是否存在能杀灭大肠杆菌的噬菌体。所述点滴试验按如下步骤实施。将大肠杆菌按1/1000比例接种到TSB培养基中，然后在37℃条件下振荡培养一夜。将通过上述方法制备的大肠杆菌培养液2ml(OD600为2.0)涂抹(spreading)到TSA(胰蛋白酶大豆琼脂)平板培养基(酪蛋白胰酶消化物，17g/L；大豆木瓜酶消化物，3g/L；氯化钠，5g/L琼脂，15g/L)上，将涂抹后的平板培养基在超净工作台(cleanbench)上放置30分钟左右，使涂抹液干燥。干燥后，将前述制备的过滤液10μl滴到涂有大肠杆菌的平板培养基上，再将其放置30分钟左右使其干燥。干燥后将滴有过滤液的平板培养基在37℃条件下静置培养一天，然后观察滴有过滤液的位置是否生成透明环(clearzone)。如果生成了透明环就可以判断该过滤液中含有能杀灭大肠杆菌的噬菌体。通过上述调查获得了含有能杀灭大肠杆菌噬菌体的过滤液。利用确认含有能杀灭大肠杆菌的噬菌体的过滤液分离出纯噬菌体。纯噬菌体的分离利用普通的噬菌斑测定(plaqueassay)法。下面，对此进行详细说明。将在噬菌斑分析中形成的一块噬菌斑利用灭菌的吸嘴(tip)进行回收后再将其添加到大肠杆菌培养液中，在37℃的条件下一起振荡培养4-5小时。培养后以8,000rpm离心分离20分钟，取上清液。接着，向获得的上清液中按50分之1的体积添加大肠杆菌培养液后再在37℃的条件下振荡培养4-5小时。为了增加噬菌体的数量，这一过程至少实施了5次以上后，最终以8,000rpm离心分离20分钟，获得上清液。再次利用所获得的上清液进行噬菌斑分析。通常情况下，纯噬菌体的分离不能经过1次的上述过程而完成，因此，就利用此时形成的噬菌斑完整地重复了上述步骤，实施至少5次的同样的上述过程获得了含有纯噬菌体的溶液。一般来说，重复纯噬菌体的分离过程直到形成的噬菌斑大小与形状全都相似为止。同时，最终通过电子显微镜观察噬菌体是否已纯粹分离。重复执行前述过程直到通过电子显微镜观察确认已纯粹分离为止。通过电子显微镜的观察是按照常用的方法实施的。下面，对此进行简单说明。将含有纯噬菌体的溶液涂到铜载网(coppergrid)上，利用2％乙酸铀酰(uranylacetate)进行负染色(negativestaining)，经干燥之后再通过透射电子显微镜拍摄了其形态。噬菌体的电子显微镜照片如图1所示，通过其形态特征判断确认其为肌病毒科(Myoviridae)噬菌体。含有通过上述方式确认的纯噬菌体的溶液又经过了下述提纯过程。按照含有纯噬菌体溶液全部体积50分之1的体积标准添加大肠杆菌培养液后再在37℃的条件下振荡培养培养4-5小时。培养后，以8,000rpm离心分离20分钟，取上清液。为了获得含有充足数量噬菌体的上清液，总共重复执行了上述过程5次。将最终通过离心分离获得的上清液利用0.45μm的过滤器进行过滤。然后，再执行普通的聚乙二醇(polyethyleneglycol；PEG)沉淀过程。具体讲，为了确保过滤液100ml中最终浓度达到10％PEG8000/0.5MNaCl，添加PEG与NaCl后在4℃的条件下静置2-3小时，然后以8,000rpm离心分离30分钟获得噬菌体沉淀物，并用缓冲液(buffer；10mMTris-HCl，10mMMgSO4，0.1％明胶，pH8.0)5ml悬浮了通过上述方法获得的噬菌体沉淀物，这被称作噬菌体悬浮液或噬菌体液。通过上述方法可以确保获得提纯的纯噬菌体。将该噬菌体命名为噬菌体EK88P-1后，于2014年4月10日将其保藏到了韩国生命工学研究院生物资源中心(保藏号KCTC12574BP)。实施例2：分离噬菌体的主要结构蛋白分析通过一维电泳法对所获得的噬菌体主要结构蛋白进行确认。因此，为了获得构成噬菌体外廓的蛋白质，将实施例1中获得的噬菌体悬浮液200μl与丙酮800μl混合后剧烈晃动使其充分混匀后在-20℃的环境下静置10分钟。然后，在4℃的条件下以13,000rpm离心分离20分钟，除去上清液后让其自然风干(airdry)。向其中加入按5倍浓缩的电泳用样本缓冲液(5×样本缓冲液)50μl使其悬浮在上面，然后将其煮沸5分钟左右。将通过上述方式制备的样本通过一维电泳进行分析，其结果如图2所示，可以观察到约49kDa、53kDa、94kDa及103kDa大小的主要结构蛋白。实施例3：噬菌体EK88P-1的基因组分离及特性分析将噬菌体EK88P-1的基因组按如下方式进行分离。在进行基因组分离时使用了按照与实施例1相同的方法制备的噬菌体悬浮液。首先，为了将悬浮液中可能含有的大肠杆菌的DNA与RNA除去，向噬菌体悬浮液10ml中分别添加200U的DNaseI与RNaseA之后在37℃的条件下放置30分钟。放置30分钟后，为了去除DNaseI与RNaseA的活性，添加0.5M乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid；EDTA)500μl后再静置10分钟。然后，再将其在65℃的条件下静置10分钟。为了使噬菌体外壁瓦解，添加蛋白酶K(20㎎/ml)100μl后在37℃的条件下使其反应20分钟。然后，添加10％十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate；SDS)500μl，再在65℃的条件下使其反应1小时。反应1小时后，向该反应液中添加具有25：24：1构成比的苯酚(phenol)：三氯甲烷(chloroform)：异戊醇(isoamylalcohol)的混合液10ml使其充分混合。接着，将其以13,000rpm离心分离15分钟，将其分层后，在分离的层中取其上层并向该上层中添加1.5体积比的异丙醇(isopropylalcohol)。然后，以13,000rpm离心分离10分钟使基因组沉淀。回收沉淀物后向沉淀物中添加70％乙醇(ethanol)。然后，再以13,000rpm离心分离10分钟对沉淀物进行清洗。对清洗后的沉淀物回收后经真空干燥，然后将其溶于100μl的水中。重复执行上述过程获得了大量噬菌体EK88P-1的基因组。利用通过上述方法获得的基因组在首尔大学农业与生命科学共同仪器院(NationalInstrumentationCenterforEnvironmentalManagement)通过新一代碱基序列分析(NextGenerationSequencing；NGS)对噬菌体EK88P-1的基因组实施了序列分析。下面，对此简要介绍。将DNA片断固定在载玻片上后，通过桥式扩增，最大扩增至1,000分子，使其形成相同序列的DNA片断簇(cluster)后，以该簇为模型执行利用4种荧光标识碱基的一个碱基合成反应即SBS(SequencebySynthesis)。这种方法的特征在于，并不是将DNA序列像其它方法那样在溶液中扩增而是将其固定于板上，然后随着其在板上变弯曲并扩增以形成序列组。这样形成的簇按组分别进行测序(sequencing)，将其转换成各读取(read)的碱基序列信息后转至分析过程。利用所获得的基因序列按照常用的方法构建多种大小的重叠群(contig)25组。最终确认的噬菌体EK88P-1重叠群序列记载在序列目录1-25中，这些序列是构成噬菌体EK88P-1全部基因组序列的部分序列(partialsequence)，通过所述部分序列也可以将噬菌体EK88P-1与其它噬菌体区分开来。实施例4：利用聚合酶链式反应分析噬菌体EK88P-1的基因组特征为了查明分离的噬菌体EK88P-1的基因组特征而进行了聚合酶链式反应(polymerasechainreaction；PCR)。此时，所使用的PCR引物(primer)是参照序列号5的部分序列构建的，所用引物的信息如表1所示。【表1】引物信息PCR反应引物序列PCR1F-1(序列号26)TATCACCCATGTTCCACGCTPCR1R-1(序列号27)TGGTATTACTCGTCCGCAGTPCR2F-2(序列号28)CCAAGTGCCAGTCCTAAACGPCR2R-2(序列号29)ATGGGTCGGGTTACTGGTTCPCR3F-3(序列号30)ACCCAATCTCCTATTCTGTCCAPCR3R-3(序列号31)TGACTGATATTGATTCTGGCGAPCR4F-4(序列号32)GGTTTCAACTCGAGCAAGGGPCR4R-4(序列号33)TCGGTTGTATCTTGGGCTGAPCR5F-5(序列号34)CGGAATTTGTACATCACCGCTPCR5R-5(序列号35)CTTGATACGCAGGACCAAGC另外，PCR是以实施例3中制备的噬菌体EK88P-1的基因组作为模板(template)使用iNtRON生物技术株式会社生产的MaximePCRPreMixKit(i-Taq；Cat.No.25026)并按照产品使用说明书实施的。PCR装置使用GeneProPCR机械(BIOER)，PCR反应条件需要经过一系列的加温过程，即以94℃加温10分钟后，在94℃加温1分钟，在56℃加温30秒，在72℃加温1分30秒，总共反复执行30次这一连串加温过程后，将其在72℃再加温4分钟，最后将其放置在4℃的环境中。将通过上述过程获得的PCR产物在1.5％琼脂糖胶上按常用的方法进行电泳后，通过MolecularImagerGelDocTMXR+(BIO-RAD)对胶体进行最后确认。PCR结果如图3所示，确认“PCR1”中存在与理论值834bp类似大小的扩增产物，确认“PCR2”中存在与理论值885bp类似大小的扩增产物，确认“PCR3”中存在与理论值893bp类似大小的扩增产物，确认“PCR4”中存在与理论值645bp类似大小的扩增产物，确认“PCR5”中存在与理论值562bp类似大小的扩增产物。使用表1中所列PCR引物时，从特征上看，产生了834bp，885bp，893bp，645bp或562bp的扩增产物，这可以说就是噬菌体EK88P-1的特征，这一特征可以用作将噬菌体EK88P-1与其它噬菌体相区别的手段。实施例5：分析噬菌体EK88P-1杀灭大肠杆菌的能力对分离的噬菌体EK88P-1杀灭大肠杆菌的能力进行了调查。调查杀灭能力时按照与实施例1相同的方法通过点滴试验观察是否生成透明环。进行杀灭能力调查所用的大肠杆菌是由本发明人分离并鉴定其为大肠杆菌的，总共有10种，从形态上看包括K88型、K99型、987P型，F41型，F18型各2株。噬菌体EK88P-1针对成为实验对象的所有大肠杆菌不论其形态如何均发挥了杀灭能力。以大肠杆菌为对象的具有代表性的实验结果如图4所示。另外，还分析了噬菌体EK88P-1对粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、轻型链球菌(Streptococcusmitis)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)及金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的杀灭能力，其结果表明，噬菌体EK88P-1对这些菌种不具有杀灭能力。从上述结果可以确认，噬菌体EK88P-1对大肠杆菌具有广泛的抗菌活性，这一事实表明，噬菌体EK88P-1能够用作防止及处理大肠杆菌感染组合物的有效成份。实施例6：噬菌体EK88P-1预防大肠杆菌感染的实验例向一个装有9mlTSB培养基的试管中加入1×109pfu/ml标准的噬菌体EK88P-1溶液100μl，向另一个装有9mlTSB培养基的试管内仅加入等量的TSB培养基。然后，向各试管内加入与实施例1中所用大肠杆菌相同种类的大肠杆菌培养液使600nm处的吸光度达到0.5左右。添加大肠杆菌后，将试管移入37℃的振荡培养装置中进行培养，并观察大肠杆菌的生长状态。如表2所示，在添加了噬菌体EK88P-1液的试管内大肠杆菌的生长受到抑制。相反，在未添加噬菌体液的试管内大肠杆菌的生长未受到抑制。【表2】大肠杆菌的生长抑制通过以上结果可以确认，本发明的噬菌体EK88P-1不仅阻碍大肠杆菌的生长而且还具有将其杀灭的能力。由此可以得出噬菌体EK88P-1可以用作防止大肠杆菌感染组合物的有效成份的结论。实施例7：利用噬菌体EK88P-1处理大肠杆菌感染疾病的实施例通过实验调查了噬菌体EK88P-1对诱发了由大肠杆菌引起的疾病的猪的处理效果。将出生25天的断奶仔猪4头为一组，总共分为两组。然后，将其分开饲养在实验饲养猪圈(1.1m×1.0m)内，饲养实验进行了14天。实验过程中对周边环境进行了控制，确保其处理于保温设施下，使猪圈的温度与湿度保持恒定，每天都对猪圈的地面进行清扫。在实验开始日起的第7天利用口腔注入管向所有猪给药大肠杆菌(K88型)液，给药的大肠杆菌溶液按如下步骤准备。利用TSB培养基将大肠杆菌在37℃的条件下培养18小时后仅对菌体进行回收，然后用生理盐水(pH7.2)将其调整到1010CFU/ml。从给药大肠杆菌的第二天开始每天给实验组(给药噬菌体液的组)的猪采用与注入大肠杆菌液相同的方式口腔给药2次109PFU的噬菌体EK88P-1。对照组(未给药噬菌体液的组)的猪则不做任何处理。给对照组和实验组都投喂相同的饲料与饮用水。从给药大肠杆菌后开始每天以所有试验动物为对象调查了腹泻发生的状况。腹泻发生状况调查通过测定腹泻指数的方式实施。腹泻指数测定采用常用的测定排泄物稠度(FC)值(正常：0，软便：1，轻微腹泻：2，严重腹泻：3)的方式实施。其结果如表3所示。【表3】腹泻指数测定结果给药大肠杆菌后经过的天数0123456对照组(未给药噬菌体液)1.01.51.51.251.01.01.0实验组(给药噬菌体液)1.00.50.250.25000从以上结果可以确认，本发明的噬菌体EK88P-1对于处理因大肠杆菌诱发的感染性疾病也非常有效。实施例8：制备饲料添加剂及饲料利用噬菌体EK88P-1液制备饲料添加剂，确保每1g饲料添加剂中含有1×109pfu的噬菌体EK88P-1。饲料添加剂的制备方法如下，相对全部体积按重量比向噬菌体液中添加40％的麦芽糊精及10％的海藻糖后，经冷冻干燥完成制备。最后将其粉碎成细粉形态。在上述制备过程中的干燥步骤也可以采用减压干燥、加温干燥、常温干燥来代替。为了进行对照实验，不含噬菌体的饲料添加剂也利用制备噬菌体液时使用的缓冲液(buffer；10mMTris-HCl，10mMMgSO4，0.1％明胶，pH8.0)进行制备，而不使用噬菌体液。将通过上述方法制备的2种饲料添加剂分别按重量比与1,000倍的养猪用饲料混合最终制备出2种饲料。实施例9：制备饮用水添加剂及消毒剂饮用水添加剂或消毒剂仅在其用途上有所差异，其剂型是相同的。因此，可以采用相同的方式制备。利用噬菌体EK88P-1制备饮用水添加剂(或消毒剂)，确保每1ml饮用水添加剂(或消毒剂)中含有1×109pfu的噬菌体EK88P-1。饮用水添加剂(或消毒剂)的制备方法如下，为确保制备噬菌体溶液时使用的缓冲液每1ml中含有1×109pfu的噬菌体EK88P-1，采用添加所述噬菌体EK88P-1液并充分混合的方式制备。为了进行对照实验，不含噬菌体的饮用水添加剂(或消毒剂)直接使用制备噬菌体液时所用的缓冲液。将通过上述方法制备的2种饮用水添加剂(或消毒剂)按体积比用1,000倍的水稀释最终用作饮用水或消毒剂。实施例10：确认猪饲养过程中的饲养效果利用实施例8及实施例9中制备的饲料、饮用水及消毒剂调查饲养猪的饲养结果是否改善。特别是，本项调查是基于病死率角度实施的。将总共30头仔猪每10头为一组，共分为3组(投喂饲料的组-A；供给饮用水的组-B；经消毒处理的组-C)，试验进行了4周。再将各组分为由5头仔猪构成的小组，所述各小组包括使用噬菌体EK88P-1的小组(小组-①)及不使用噬菌体的小组(小组-②)。在本试验中作为试验对象的仔猪是出生后20天的断奶仔猪，各试验小组的仔猪放入按一定间隔分隔设置的各自的分房中饲养，各小组按表4所示形式进行区分。【表4】猪饲养试验中的小组区分及标示关于投喂饲料的情况，将实施例8中制备的饲料根据表4的区分按照常用的饲料投喂方式进行投喂。关于饮用水供给的情况，将实施例9中制备的饮用水根据表4的区分按照常用的饮用水供给方式进行提供。关于消毒处理的情况，一周3次与现有消毒方式轮流实施，喷射本发明消毒剂的日子就不使用普通的消毒剂进行消毒。试验结果如表5所示。【表5】组病死率(％)A-0A-20B-0B-40C-0C-40通过以上结果可以确认，在动物饲养过程中投喂依据本发明制备的饲料及饮用水和用依据本发明制备的消毒剂处理能够有效降低病死率。由此可以得出使用本发明的组合物能够有效改善动物的饲养状况的结论。在上述说明中，对本发明的特定部分进行了详细说明。对于具有本领域相关知识的人来说，这种具体技术仅仅是优选实施例，它并不限定本发明的范围。因此，本项发明的实际范围要根据权利范围及其等价物来确定。保藏号保藏机构名称：KCTC保藏号：KCTC12574BP保藏日期：20140410当前第1页1 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