噻唑杂环类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及噻唑杂环类化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

白血病，亦称作血癌，是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。

白血病通常分为:1)急性淋巴细胞白血病，2)急性非淋巴白血病(简称急非淋)，3)慢性白血病，4)特殊类型白血病，

其中,慢性粒细胞白血病(CML)又叫慢性髓细胞白血病，它是血液系统的造血干细胞恶性克隆增殖性疾病，导致病人出现贫血、出血、感染等症状。CML占成人白血病的20％左右，大约每年的发病率为五万分之一，其在任何年龄段都有可能发病，尤其是在老年人中发病率更高，且男性比女性发病率高。根据CML患者的疾病进展状况和严重程度分为慢性期(CP)、加速期(AP)和急变期(BP)。大约85％～90％的慢性粒细胞白血病患者在慢性期被诊断发现，这个阶段症状并不明显，或者仅有乏力、关节疼痛或腹胀，如果药物治疗及时，慢性期就会变长，在没有及时治疗的情况下，疾病会进入到加速期。CML形成的主要原因是9号和22号染色体发生异位t(9:22)(q34:q11)(费城染色体Ph)形成一种融合基因即BCR-ABL融合基因，该基因能够编码BCR-ABL蛋白，是一种活性酪氨酸激酶。这种BCR-ABL激酶能使下游的一些底物磷酸化，进而激活与细胞增殖有关的信号转导通路，造成成熟粒细胞无限增殖而导致CML的发生。

目前，临床上对CML的治疗方法主要是传统的药物治疗、造血干细胞 移植和新兴的分子靶向治疗。普通的药物治疗包括烷化剂白消安、羟基脲、干扰素(IFN-α)、阿糖胞苷及高三尖杉酯碱。其中，由于白消安副反应比较大，目前在临床上已经停止使用；羟基脲虽然价格低廉，治疗成本低，毒副作用小，但是其对于处于加速期的CML病人作用效果差，而且对于急变期的CML患者基本没有效果；α-干扰素较前两者虽然毒副作用有所减小，但是其对加速期和急变期的CML患者效果很差。这种普通药物治疗的一个很大弊端是在对肿瘤细胞产生杀伤作用的同时也能对正常的机体细胞产生损伤。造血干细胞移植是目前理论上唯一可以治愈CML的方法，它是通过先用大剂量放化疗将CML患者体内的肿瘤细胞清除，再将自体或异体的造血干细胞移植给患者，使其重新建立正常的的造血免疫系统。但是这种方法在实际操作起来存在很多困难，比如对患者的年龄有一定的要求，手术复杂，成功率低，耗费高，且必须要有合适的骨髓捐献者，而且移植后期有可能发生感染，会使CML患者和家人面临很大的风险，所以造血干细胞移植在实际应用过程中很受限制。

达沙替尼是新颖的、口服的、多靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂，是第二代TKIs。达沙替尼最初是作为SRC家族(例如Fyn，Yes，Src和Lyk等)激酶抑制剂被研制的，它也可以抑制BCR-ABL、EphA2、血小板生长因子受体及c-Kit。虽然达沙替尼具有一定的治疗效果，但其也存在着一些临床治疗的缺点。达沙替尼临床试验结果表明，达沙替尼有存在很普遍的骨髓移植现象，最常见的不良反应包括体液潴留(包括胸腔积液)、腹泻、头痛、恶心、皮疹、呼吸困难、出血、疲劳、肌肉骨骼疼痛、感染、呕吐、咳嗽、腹痛和发热，偶尔可见心力衰竭。与药物相关的发热性中性粒细胞减少症的发生率为5％。所以寻找一种对白血病干细胞有杀伤力并且副作用较低的化合物迫在眉睫，而且这也将开启CML治疗的新方向和改变抗CML药物的临床评估标准。

技术实现要素：

为了解决现有技术中用于治疗白血病的药物疗效不佳的问题，根据本发明的一个方面，提供了一种噻唑杂环类化合物，该噻唑杂环类化合物具 有以下结构通式：

在上述噻唑杂环类化合物中，所述通式中X为：

并且其中，R包括以下基团：

在上述噻唑杂环类化合物中，所述通式中X为：

并且其中，R包括以下基团：

在上述噻唑杂环类化合物中，所述通式中X为：

并且其中，R包括以下基团：

根据本发明的另一方面，还提供了一种噻唑杂环类化合物的制备方法，包括：使2-((6-(4-(2-(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧)乙基)哌嗪-1-基)2-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N’-(2-氯-6-甲苯甲酰)噻唑-5-碳酸肼)和叔丁基(2-(4-(6-((5-(2-(2-氯-6-甲苯甲酰)酰基羰基)噻唑-2-基)氨基)2-甲基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸酯分别发生脱氢环化反应来制备N-(6-(4-(2-(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧)乙基)哌嗪-1-基)2-甲基嘧啶-4-基)5-(5-(2-氯6-甲苯基)1，3，4-恶二唑-2-基)噻唑-2-胺和叔丁基(2-(4-(6-((5-(5-(2-氯-6-甲苯1,3,4-恶二唑-2-基)噻唑-2-基)氨基)2-甲基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸酯

使所述N-(6-(4-(2-(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧)乙基)哌嗪-1-基)2-甲基嘧啶-4-基)5-(5-(2-氯6-甲苯基)1，3，4-恶二唑-2-基)噻唑-2-胺和所述叔丁基(2-(4-(6-((5-(5-(2-氯-6-甲苯1,3,4-恶二唑-2-基)噻唑-2-基)氨基)2-甲基嘧啶 -4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸酯分别发生取代反应以生成所述噻唑杂环类化合物；

其中，所述噻唑杂环类化合物的化学结构式为：

，其中，R为：

根据本发明的另一方面，还提供了一种噻唑杂环类化合物的制备方法，包括：使叔丁基(5-乙炔噻唑-2-基)氨基甲酸酯与1-叠氮-2-氯苯反应生成叔丁基(5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-基l)氨基甲酸酯；

使所述叔丁基(5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸酯与三氟乙酸反应生成5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-胺；

使5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-胺与4,6-二氯-2-甲基嘧啶反应生成N-(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)-5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-胺；

使所述N-(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)-5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-胺与哌嗪类化合物反应，生成所述噻唑杂环类化合物；

其中，所述哌嗪类化合物的化学结构式为：

所述噻唑杂环类化合物的化学结构式为：

并且其中，R至少包括

根据本发明的又一方面，还提供了上述噻唑杂环类化合物在用于治疗白血病的药物中的应用。

在上述应用中，所述用于治疗白血病的药物包含所述噻唑杂环类化合物、所述噻唑杂环类化合物在药学上可接受的盐、酯、水合物或它们的组 合以及辅料。

在上述应用中，所述治疗白血病的药物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、糖浆剂、酒剂、酊剂、露剂、膜剂或它们的组合。

在上述应用中，所述治疗白血病的药物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。

从而，本发明提供了一类新的噻唑杂环类化合物及其制备方法和应用，通过细胞水平实验发现，本发明提供的噻唑杂环类化合物均可以抑制K562、HL60、KG1a细胞的增殖，通过测定IC₅₀和IC₉₀值发现，本发明提供的噻唑杂环类化合物对K562、HL60、KG1a细胞的增殖的抑制作用均可达到90％，并且特别是本发明提供的实例3化合物(化合物4c)在药物浓度低于阳性对照药物达沙替尼的情况下，可以同样实现抑制K562、HL60、KG1a细胞增殖的效果，因此本发明提供的噻唑杂环类化合物可以用于治疗白血病。

附图说明

图1示出了化合物4a的1H NMR。

图2示出了化合物4a的¹³C NMR。

图3示出了化合物4b的¹H NMR。

图4示出了化合物4b的¹³C NMR。

图5示出了化合物4c的¹H NMR。

图6示出了化合物4c的¹³C NMR。

图7示出了化合物4d的¹H NMR。

图8示出了化合物4d的¹³C NMR。

图9示出了化合物13a的¹H NMR。

图10示出了化合物13a的¹³C NMR。

图11示出了化合物13b的¹H NMR。

图12示出了化合物13b的¹³C NMR。

图13示出了化合物13c的¹H NMR。

图14示出了化合物13c的¹³C NMR。

图15示出了化合物13d的¹H NMR。

图16示出了化合物13d的¹³C NMR。

图17示出了化合物13e的¹H NMR。

图18示出了化合物13e的¹³C NMR。

图19示出了化合物25a的¹H NMR。

图20示出了化合物25a的¹³C NMR。

图21示出了化合物25c的¹H NMR。

图22示出了化合物25c的¹³C NMR。

图23示出了化合物25d的¹H NMR。

图24示出了化合物25d的¹³C NMR。

图25示出了化合物25e的¹H NMR。

图26示出了化合物25e的¹³C NMR。

图27示出了化合物25f的¹H NMR。

图28示出了化合物25f的¹³C NMR。

图29示出了达沙替尼、实例1和实例4化合物对K562细胞的抑制作用。

图30示出了实例2化合物对K562细胞的抑制作用。

图31示出了实例3化合物对K562细胞的抑制作用。

图32示出了实例5化合物、实例6化合物、实例7化合物、实例8化合物、实例9化合物对K562细胞的抑制作用。

图33示出了实例10化合物、实例11化合物、实例12化合物、实例13化合物、实例14化合物对K562细胞的抑制作用。

图34示出了达沙替尼、实例1化合物、实例4化合物对HL60细胞的抑制作用。

图35示出了实例2化合物对HL60细胞的抑制作用。

图36示出了实例3化合物对HL60细胞的抑制作用。

图37示出了实例5化合物、实例6化合物、实例7化合物、实例8化合物、实例9化合物对HL60细胞的抑制作用。

图38示出了实例10化合物、实例11化合物、实例12化合物、实例13化合物、实例14化合物对HL60细胞的抑制作用。

图39示出了达沙替尼、实例1化合物、实例2化合物、实例3化合物、实例4化合物对KG1a细胞的抑制作用。

图40示出了实例5化合物、实例6化合物、实例7化合物、实例8化合物、实例9化合物对KG1a细胞的抑制作用。

图41示出了实例10化合物、实例11化合物、实例12化合物、实例13化合物、实例14化合物对KG1a细胞的抑制作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明中提供的噻唑杂环类化合物的结构通式为：

其中，通式中

即，上述通式可以为：

实施例1具有通式一的噻唑杂环类化合物的化学合成和结构鉴定

在上述通式一中：

具有通式一的噻唑杂环类化合物的化学合成实验步骤(通式一所包含的实例化合物实验步骤)如下：

1.通用合成路线

2.具体合成步骤：

2.1：化合物3：N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(2-(1，3-二氧代异吲哚啉)乙基) 哌嗪)-2-甲基嘧啶)氨基)噻唑-5-甲酰胺的合成

0℃下，将化合物1(500mg，1.02mmol)，三苯基磷PPh₃(349mg，1.33mmol)，邻苯二甲酰亚胺2(195.7mg，1.33mg)加入到有10mL重蒸的无水四氢呋喃中，然后在搅拌条件下加入偶氮二甲酸二异丙酯DIAD(226.4mg，1.33mmol)，低温搅拌10min后移至室温反应，直至原料1反应完全(有时反应不能进行到底)。反应结束后，低压浓缩除去反应溶剂，然后柱层析纯化即可得到化合物3(白色固体，555mg)。产率为87.8％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δppm 8.04(br，1H)，7.83-7.85(m，2H)，7.70-7.72(m，2H)，7.45(s，1H)，7.30(dd，J＝0.8，7.2Hz，1H)，7.14-7.20(m，2H)，5.78(s，1H)，3.85(t，J＝6.4Hz，2H)，3.56(br，4H)，2.68(t，J＝6.4Hz，2H)，2.60(br，4H)，2.50(s，3H)，2.35(s，3H)。

实例1化合物4a:N-(2-氯-(6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-氨乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的合成

将化合物3(606mg，0.98mmol)加入到有10mL乙醇的圆底烧瓶中，然后加入5mL水合肼，加热至78℃回流两个小时即可反应完全，减压浓缩除去反应溶剂，然后加氯化钠饱和溶液，用四氢呋喃萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。柱层析进一步纯化得化合物4a(白色固体)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm9.88(br，1H)，8.23(s，1H)，7.40(dd，J＝7.2Hz，1H)，7.24-7.30(m，2H)，6.06(s，1H)，3.52(br，4H)，2.68(t，J＝6.4Hz，2H)，2.44(t，J＝4.4Hz，4H)，2.41(s，3H)，2.36(t，J＝6.4Hz，2H)，2.24(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.61，163.11，162.84，160.42，157.47，141.32，139.29，134.02，132.92，129.48，128.62，127.47，126.11，83.14，60.63，52.89，44.09，38.72， 26.05，18.77；

HRMS-ESI(+)：C₂₂H₂₈ClN₈OS计算值487.1759，检测到487.1805[M+H]⁺。

实例2化合物4b:N-(2-氯-(6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-异硫氰酸酯)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的合成

0℃下，将化合物4a(100mg，0.21mmol)加入到有3mL二氯甲烷圆底烧瓶中，然后加入二环己基碳二亚胺DCC(1.1eq)，然后搅拌条件下，缓慢滴加二硫化碳CS₂(15eq)，滴加完后，在低温下搅拌5min后，移去冰水浴，然后常温搅拌至反应完全。减压浓缩除去反应溶剂，硅胶柱层析纯化即可得到化合物4b(白色固体)。该化合物的¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm11.47(s，1H)，9.88(s，1H)，8.23(s，1H)，7.40(dd，J＝1.2，7.2Hz，1H)，7.24-7.30(m，2H)，6.07(s，1H)，3.80(t，J＝6.0Hz，2H)，3.54(br，4H)，2.66(t，J＝6.0Hz，2H)，2.54(br，4H)，2.42(s，3H)，2.24(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.67，163.02，162.81，160.39，157.44，141.30，139.29，134.00，132.91，130.09，129.49，128.63，127.47，126.19，83.17，56.80，52.24，44.11，43.07，26.05，18.77；

HRMS-ESI(+)：C₂₃H₂₆ClN₈OS₂计算值，529.1359；检测到529.1356.[M+H]⁺。

实例3化合物4c：N-(2-氯-(6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-丙烯酰胺)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的合成

0℃下，将化合物4a(150mg，0.31mmol)加入到有3mL二氯甲烷的圆底烧瓶中，然后搅拌条件下加入上述制备的丙烯酰氯(3mL，0.35mmol)和Et₃N(47mg，0.46mmol)，加毕，在低温下搅拌5min后，移去冰水浴，然后常温搅拌至反应完全。反应液用饱和食盐水洗涤2次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析纯化即可得到化合物4c(白色固体)。该化合物的 ¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm11.48(s，1H)，9.89(s，1H)，8.23(s，1H)，8.08(s，1H)，7.40(dd，J＝1.2，7.2Hz，1H)，7.24-7.31(m，2H)，7.25(dd，J＝10，16.8Hz，1H)，6.11(d，J＝1.2Hz，1H)，6.07(s，1H)，5.59(dd，J＝0.4，9.6Hz，1H)，3.52(br，4H)，3.31(s，2H)，2.50-2.51(m，9H)，2.42(s，1H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.64，165.07，163.02，162.82，160.41，157.44，141.34，139.29，134.02，133.03，132.29，129.47，128.61，127.46，126.19，125.43，83.16，57.30，52.67，43.93，36.51，26.04，18.78；HRMS-ESI(+)：C₂₅H₃₀ClN₈O₂S计算值541.1901；检测到541.1879[M+H]⁺。

实例4化合物4d：N-(2-氯-(6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-氯乙酰胺)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺的合成

0℃下，将化合物4a(100mg，0.20mmol)加入到有2mL二氯甲烷的圆底烧瓶中，然后搅拌条件下加入氯乙酰氯(44mg，0.39mmol)和Et₃N(45.5mg，0.45mmol)，加毕，在低温下搅拌5min后，移去冰水浴，然后常温搅拌至反应完全。反应液用饱和食盐水洗涤2次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析纯化即可得到化合物4d(米白色固体)。该化合物的 ¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm9.95(s，1H)，8.27(s，2H)，7.40(d，J＝7.2Hz，1H)，7.23-7.30(m，2H)，6.09(s，1H)，4.08(s，2H)，3.52(br，4H)，3.25(q，J＝6，12Hz，1H)，2.41-2.48(m，9H)，2.24(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.86，162.79，162.44，161.47，160.37，157.78，141.42，139.30，134.05，132.96， 129.47，128.60，127.46，126.51，84.03，59.44，58.19，53.07，43.16，37.88，26.01，18.81；HRMS-ESI(+)：C₂₄H₂₉Cl₂N₈O₂S计算值563.1511；检测到563.1542[M+H]⁺。

实施例2具有通式二的噻唑杂环类化合物的化学合成和结构鉴定

具有通式二的噻唑杂环类化合物的化学合成实验步骤(通式二所包含的实例化合物实验步骤)如下：

1.通用路线

2.具体合成步骤：

2.1化合物9a-9b的制备

将化合物7(5.67g，18.98mmol)，不同R基团的哌嗪(2-5eq)以及DIPEA(4.91g，37.99mmol)加入到搅拌的1，4-二氧六环(95mL)中，然后加热至100-105℃回流3-12h，反应完全后冷却至室温(一般过夜)，有大量固体析出，抽滤，然后用蒸馏水洗涤滤饼得化合物9(白色固体)。产率90％左右。

化合物9a的核磁数据如下：¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δppm8.01(s，1H)，7.71(dd，J＝1.2，7.6Hz，4H)，7.35-7.46(m，6H)，5.74(s，1H)，4.33(q，J＝7.2Hz，2H)，3.84(t，J＝6.0Hz，2H)，3.59(br，4H)，2.63(t，J＝6.0Hz，2H)，2.57(br，4H)，2.54(s，3H)，1.35(t，J＝7.2Hz，3H)，1.071(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ166.31，165.51，162.94，162.30，156.567，143.36，135.63，133.68，129.73，127.73，121.44，82.93，62.09，60.86，60.32，53.34，44.09，26.89，25.80，19.21，14.45。

化合物9b的核磁数据如下：¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δppm10.72(s，1H)，8.05(s，1H)，5.79(s，1H)，5.02(br，1H)，4.36(q，J＝7.2Hz，2H)，3.64(s，4H)，3.28(br，2H)，2.54(s，9H)，1.46(s，9H)，1.38(t，J＝7.2Hz，3H)； ¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ165.62，164.22，162.85，162.30，157.23，156.03，145.98，120.59，83.32，78.01，60.89，57.75，52.71，44.06，37.83，28.73，26.03，14.78。

1.2.化合物10a-10b的制备

将化合物9加入两口圆底烧瓶中，加入213mL乙醇，搅拌下加入80％的水合肼106.5mL，加热至78℃回流反应2h。反应后，冷却至室温，有大量固体析出。然后抽滤，滤饼用大量水洗涤，真空干燥得化合物10(白色固体)。

化合物10b的核磁数据如下：¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δppm11.33(s，1H)，9.56(s，1H)，7.92(s，1H)，6.69(t，J＝4.8Hz，1H)，6.03(s，1H)，4.51(s，1H)，3.49(br，1H)，3.07(q，J＝6.0Hz，2H)，2.45(br，4H)，2.41(s，3H)，2.36(t，J＝6.8Hz，2H)，1.38(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ165.60，162.84，162.26，161.94，157.48，156.03，139.41，125.39，82.95，78.01，57.74，52.71，44.06，37.81，28.72，26.05。

2.3酸铵缩合制备双酰肼化合物11a-11b

0℃下将化合物10(1.0eq)和三乙胺(8.7g，8.60mmol)分批缓慢加入到29的二氯甲烷溶液中，约4h后反应完毕。直接向反应体系中加入20mL蒸馏水，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤，干燥即可得化合物11(白色固体)。产率50％-80％。

化合物11a：2-((6-(4-(2-(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧)乙基)哌嗪-1-基)2- 甲基嘧啶-4-基)氨基)-N’-(2-氯-6-甲苯甲酰)噻唑-5-碳酸肼)的结构式如下：

化合物11a的核磁数据如下：¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δppm11.64(s，1H)，10.49(s，1H)，10.40(s，1H)，8.18(s，1H)，7.66(dd，J＝1.2，7.2Hz，4H)，7.45-7.53(m，6H)，7.33-7.38(m，2H)，7.27(dd，J＝2.4，6.4Hz，1H)，6.20(s，1H)，4.36(dd，J＝0.8，12.4Hz，2H)，4.07(br，2H)，3.64(d，J＝10.8Hz，2H)，3.47(t，J＝12.4Hz，2H)，3.38(s，2H)，3.22(d，J＝9.6Hz，2H)，2.48(s，3H)，2.46(s，3H)，1.02(s，9H)；

化合物11b：叔丁基(2-(4-(6-((5-(2-(2-氯-6-甲苯甲酰)酰基羰基)噻唑-2-基)氨基)2-甲基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸酯的结构式如下：

化合物11b的核磁数据如下：¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δppm11.45(s，1H)，10.44(s，1H)，10.38(s，1H)，8.14(s，1H)，7.33-7.38(m，2H)，7.27(dd，J＝6.4HZ，1H)，6.69(t，J＝1.2Hz，1H)，6.06(s，1H)，3.51(br，4H)，3.08(q，J＝6.4Hz，2H)，2.46(s，7H)，2.433(s，3H)，2.37(t，J＝6.4Hz，2H)，1.39(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ166.01，165.61，163.04，162.87，161.32，157.39，156.04，141.29，138.34，135.79，130.67，130.51，129.16，126.85，124.49，83.17，78.02，57.72，52.70，45.99，44.07，37.80，28.73，26.00，19.54。

2.4脱氢环化反应制备噁二唑化合物12a-12b

将化合物11(5.78mmol)溶于30mL二氯甲烷中，然后加入3eq的DIPEA(2.24g，17.34mmol)和1.5eq的TsCl(1.65g，8.68mmol)，常温搅拌至化合物11反应完全，大约3h，反应体系由悬浮液变为黄色澄清溶液。反应完全后加入氨的水溶液除去过量的TSCl，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，粗品过柱纯化得到化合物12(白色固体)。产率76.3％-79％。

化合物12a：N-(6-(4-(2-(叔丁基二苯基甲硅烷基)氧)乙基)哌嗪-1-基)2-甲基嘧啶-4-基)5-(5-(2-氯6-甲苯基)1，3，4-恶二唑-2-基)噻唑-2-胺的结构式如下：

化合物12a的¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δppm10.13(br，1H)，8.10(s，1H)，7.68(d，J＝6.4Hz，4H)，7.32-7.45(m，8H)，7.22-7.25(m，1H)，5.81(s，1H)，3.83(t，J＝5.2Hz，2H)，3.60(br，4H)，2.55-2.60(m，9H)，1.05(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆):δ166.34，164.14，162.88，160.65，160.45，156.30，141.48，140.14，135.56，134.91，133.59，132.04，129.69，128.86，127.69，127.35，123.72，113.31，82.85，61.90，60.19，53.20，44.00，26.81，25.61，20.59，19.15。

化合物12b：叔丁基(2-(4-(6-((5-(5-(2-氯-6-甲苯1,3,4-恶二唑-2-基)噻唑-2-基)氨基)2-甲基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸酯的结构式如下：

化合物12b的制备方法同上。其核磁数据如下：¹HNMR(400MHz，CDCl3)：δppm10.87(br，1H)，8.07(s，1H)，7.38-7.42(m，2H)，7.28(d，J＝4Hz， 1H)，5.84(s，1H)，4.99(br，1H)，3.63(br，4H)，3.26(d，J＝3.2Hz，2H)，2.51(s，9H)，2.40(s，3H)，1.47(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃):δ166.39，164.04，162.85，160.56，160.51，156.33，156.00，141.57，139.98，134.92，132.14，128.98，127.46，123.76，113.42，82.82，79.31，57.30，52.49，43.94，37.04，29.69，28.48，25.57，20.64。

2.5噁二唑化合物13a-13e的合成

实例5化合物：13a的合成

将化合物12a(3.00g，4.00mmol)加入到有40mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，然后加入固体TBAF(3.14g，12.01mmol)，常温搅拌3h，反应完全后用120mL饱和食盐水洗涤3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，粗品进一步柱层析纯化得到化合物13a(白色固体，1.974g)。产率为96.3％。化合物的 ¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆):δppm11.77(s，1H)，8.17(s，1H)，7.55-7.61(m，2H)，7.46(d，J＝7.2Hz，1H)，6.07(s，1H)，4.45(t，J＝5.2Hz，1H)，3.53(br，6H)，3.33(s，6H)，2.42-2.45(m，9H)，2.30(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)：165.53，162.97，162.82，160.83，160.14，156.97，142.50，141.84，134.15，133.40，129.85，127.79，123.64，112.04，83.24，60.63，58.94，53.16，44.06，25.94，20.30；HRMS-ESI(+)：C₂₃H₂₆ClN₈O₂S，计算值513.1588；检测到513.1607[M+H]⁺。

实例6化合物13b:N-(6-(4-(2-氨基乙基)哌嗪基)-2-甲基嘧啶基)-2-(5-(2-氯-6-甲基苯基)-1，3，4-噁二唑基)氨基噻唑的合成

将化合物12b(173mg，0.28mmol)溶于2.5mL二氯甲烷中，常温搅拌下加入 CF₃COOH，室温反应至化合物12b完全消失。低压浓缩除去反应中的溶剂，然后加入饱和食盐水，用饱和的NaHCO₃调节pH9～10，用四氢呋喃萃取三次，合并有机相，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，粗品进一步柱层析纯化得到化合物13b(白色固体，144.5mg)。产率为83％。该化合物的 ¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆):δppm8.17(s，1H)，7.55-7.61(s，1H)，7.45(d，J＝6.4Hz，1H)，6.15(s，1H)，3.56(br，4H)，2.92(t，J＝6.4Hz，2H)，2.56(t，J＝6.4Hz，2H)，2.50(s，4H)，2.45(s，3H)，2.30(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)：165.54，162.97，162.80，160.84，160.15，157.06，142.53，141.85，134.15，133.41，129.86，127.80，123.65，112.01，83.37，55.06，52.47，43.98，36.34，25.95，20.29；HRMS-ESI(+)：C₂₃H₂₇ClN₉O_S，计算值512.1748；检测到512.1733[M+H]⁺。

从化合物13b进一步合成其它衍生物13c-13e(实例7-9化合物)：具体合成方法见上述4b-4d。

实例7化合物

合成化合物13c的产率为37％。该化合物的¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆):δppm11.77(s，1H)，8.18(s，1H)，7.61-7.55(m，2H)，7.48-7.46(dd，J＝7.2，0.8Hz，1H)，6.10(s，1H)，3.80(t，J＝6.4Hz，2H)，3.56(br，4H)，2.66(t，J＝6.4Hz，2H)，2.54(br，4H)，2.46(s，3H)，2.30(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆):δ165.57，162.97，162.80，160.84，160.16，157.02，142.49，141.85，134.17，133.39，129.85，127.80，123.66，112.08，88.33，56.80，52.23，44.13，43.08，25.95，20.30；HRMS-ESI(+)：C₂₄H₂₅ClN₉OS₂，计算值554.1311；检测到554.1332[M+H]⁺。

实例8化合物

化合物13d的¹HNMR(400MHz，CDCl₃):δppm10.09(br，1H)，8.10(s，1H)，7.39(m，2H)，7.30(d，J＝2Hz，1H)，6.34(dd，J＝1.2，17.2Hz，1H)，6.14-6.21(m，2H)，6.88(dd，J＝1.2，10Hz，1H)，33.68(br，4H)，3.51(q，J＝5.6，11.2Hz，2H)，2.56-2.61(m，9H)，2.41(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆):δ165.57，165.05，162.98，162.82，160.84，160.16，157.00，142.51，141.85，134.17，133.40，132.30，129.85，127.80，125.43，123.66，112.07，83.29，57.33，52.70，44.01，36.54，25.95，20.30；HRMS-ESI(+)：C₂₆H₂₉ClN₉O₂S，计算值566.1848；检测到566.1868[M+H]⁺。

实施例9化合物

化合物13e的¹HNMR(400MHz，CDCl₃):δ9.62(br，1H)，8.10(s，1H)，7.40-7.44(m，2H)，7.22(d，J＝0.8Hz，1H)，5.82(s，1H)，4.10(s，2H)，3.68(br，4H)，3.46(q，J＝5.6，11.2Hz，2H)，2.55-2.62(m，9H)，2.40(s，3H)；¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆):166.54，165.61，162.92，162.70，160.82，160.16，157.09，142.51，141.84，134.16，133.40，129.85，127.80，123.64，112.11，83.54，58.24，56.61，52.21，43.15，37.89，25.93，20.30；HRMS-ESI(+)：C₂₅H₂₈Cl₂N₉O₂S，计算值588.1459；检测到588.1359[M+H]⁺。

实施例3具有通式三的噻唑杂环类化合物的化学合成和结构鉴定

具有通式三的噻唑杂环类化合物的化学合成实验步骤(通式三所包含的实 例化合物实验步骤)如下：

1.通用路线

2.具体合成步骤：

2.1化合物15的合成

取100mL两口烧瓶，加入化合物14(5.00g，49.93mmol)，THF(50mL)，在0℃下搅拌，然后分别加入三乙胺(10.10g，99.81mmol)和DMAP(30mg，0.25mmol)。10min后，向烧瓶中滴加(Boc)₂O(13.08g，59.93mmol)。滴加完毕，撤掉冰浴，升至室温，继续搅拌3h，TLC检测反应完全，滴加蒸馏水淬灭。抽滤，将滤液旋干，与滤饼合并到一起，加入100mL二氯甲烷稀释，用饱和的柠檬酸溶液(100mL)洗涤有机相3-5次，再用饱和氯化钠溶液(100mL)洗有机相1-2次，无水硫酸钠干燥，浓缩得到化合物15(白色固体，7.65g)。产率为76.4％。该化合物的¹HNMR(400MHz，CDCl₃):δppm12.71(bs，1H)，7.41(d，J＝3.5Hz，1H)，6.90(d，J＝3.5Hz，1H)，1.61(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ162.17，153，13，136.67，111.94，81.73，28.33；MS:[M+H]⁺201.01。

2.2化合物16的合成

化合物15(7.65g，38.20mmol)，二氯甲烷(76mL)置于烧瓶中，搅拌下分批加入NIS(8.6g，38.22mmol)，溶液迅速由无色变为深紫色，加毕，室温搅拌2h，TLC检测反应完全。混合液加入二氯甲烷稀释至100mL，用Na₂S₂O₃饱和溶液(100mL/次)洗涤有机相2-3次，分离出有机相，然后有机相用无水Na₂SO₄干燥，浓缩得到粗品，黄色固体11.42g；然后进一步经硅胶柱层析纯化得到化合物16(白色固体粉末，8.32g)。产率为66.8％。该化合物的¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δppm12.19(bs，1H)，7.38(s，1H)，1.60(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ165.77，152.96，143.94，82.49，62.56，28.26；MS:[M+H]⁺326.85。

2.3化合物17的合成

化合物16(2.00g，6.13mmol)置于一干燥两口烧瓶，在手套箱中加入CuI(116.7mg，0.61mmol)，PdCl₂(PPh₃)₂(215mg，0.31mmol)，然后抽真空，充氮气(重复2-3次)；用注射器分别加入干燥三乙胺(1.86g，18.38mmol)，重蒸THF(20mL)和三甲基硅基乙炔(1.20g，12.26mmol)，溶液很快变为黑色，室温搅拌12h。反应结束后，用蒸馏水淬灭。砂芯漏斗铺一层硅藻土，过滤除去反应混合液中的固体，加压浓缩除去有机溶剂，用二氯甲烷溶解，分别用蒸馏水，饱和氯化钠溶液洗涤有机相2-3次，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离纯化。2.5％EtOAc/PE洗脱得到化合物17(黄色固体粉末，2.02g)。产率为55.5％。该化合物的¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δppm12.11(bs，1H)，δ7.46(s，1H)，δ1.60(s，9H)，0.26(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ161.44，152.63，141.83，111.78，101.17，94.33，82.53，53.42，28.27；MS:[M+H]⁺297.02。

2.4化合物18：叔丁基(5-乙炔噻唑-2-基)氨基甲酸酯的合成

化合物17(2.22g，7.49mmol)悬浮在溶剂甲醇(70mL)中，边搅拌边加入无水碳酸钾(2.07g，15.00mmol)，30min后反应结束，将溶剂旋干。加入二氯甲烷溶解，用蒸馏水洗涤有机相3次，饱和氯化钠溶液洗涤有机相1-2次，无水硫酸钠干燥，浓缩得到化合物18(黄色粉末，1.64g)。产率为97.6％。该化合物 ¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δppm11.84(bs，1H)，7.53(s，1H)，3.39(s，1H)，1.61(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ161.94，152.75，142.42，110.49，83.27，82.59，73.96，28.26。

2.5化合物21：叔丁基(5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-基)氨基甲酸酯的合成

0℃下，化合物19(425mg，3.00mmol)，NaNO₂(414mg，6.00mmol)和5mLH₂O加至圆底烧瓶中，边搅拌边缓慢滴加3N盐酸(3mL，9.00mmol)，加毕，继续搅拌1h。称取NaN₃(214.5mg，3.30mmol)，溶于2mLH₂O中，缓慢滴加至上述烧瓶中，继续搅拌1.5h，TLC检测，原料已消失，反应完全。用二氯甲烷萃取反应混合液，合并有机相，旋转除去部分溶剂，加入乙腈溶液，继续将二氯甲烷旋干，得到20的混合物，产物溶于乙腈，直接投下一步；

取另一烧瓶，加入化合物18，抽真空，充氮气，在氮气流中加入化合物20(1-叠氮-2-氯苯)的乙腈溶液和催化量的纳米Cu₂O(悬浮于H₂O中)，在氮气保护下，室温搅拌反应过夜。反应结束后，柱层析分离纯化产品，先用P:E＝5:1洗脱除去部分杂点，2％甲醇/二氯甲烷洗脱得到产品，即化合物21(751mg，85.8％)。该化合物的¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δppm10.91(bs，1H)，7.86(s，1H)，7.77(s，1H)，7.32-7.46(m，3H)，2.17(s，3H)，1.64(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ161.260，152.824，140.00，138.18，134.16，133.97，131.80，131.15，129.54，127.90，121.35，82.49，28.34，17.92；MS:[M+H]⁺391.78。

2.6化合物22：5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-胺的合成

化合物21(2.3g，5.88mmol)溶于CH₂Cl₂(30mL)中，常温下边搅拌边加入 CF₃COOH(6mL)，室温继续搅拌3h，TLC检测反应完全，旋蒸除去溶剂和部分CF₃COOH，加入饱和碳酸氢钠溶液至pH8～9。二氯甲烷萃取2-3次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，低压浓缩得到产品，即化合物22(棕黄色固体，1.67g)。产率为97.6％。该化合物的¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δppm7.77(s，1H)，7.40-7.45(m，3H)，7.32(s，1H)，5.33(bs，2H)，2.14(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ140.43，138.20，135.85，133.99，131.83，131.15，129.49，127.85，120.78，17.88。

2.7化合物24：N-(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)-5-(1-(2-氯-6-甲苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)噻唑-2-胺的合成

0℃下，将化合物22(1.67g，5.74mmol)加入到60％的NaH(1148mg，28.70mmol使用前用石油醚洗涤3次)的四氢呋喃溶液(57mL)中，搅拌下，将化合物23(1.12g，6.89mmol)分批加入到上述悬浮液中，加毕，低温搅拌30min后移至室温反应过夜。旋蒸除去四氢呋喃溶液，加入60mL蒸馏水，用柠檬酸调节pH5～6.5，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。柱层析进一步纯化得化合物24(乳白色固体，1.8g)。产率为75.3％。该化合物的¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm12.06(br，1H)，8.86(s，1H)，7.88(s，1H)，7.57-7.64(m，2H)，7.52(d，J＝7.2Hz，1H)，6.94(s，1H)，2.61(s，3H)，2.07(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ167.86，158.79，158.22，158.08，140.20，138.37，135.62，134.10，132.24，131.13，130.37，128.22，123.50，121.50，103.51，25.64，17.66；MS:[M+H]⁺418.03。

实例10至实例11化合物：25a-25b的合成

将化合物24(1.8g，4.30mmol)，哌嗪类化合物(21.51mmol)，DIPEA(1.11g，8.59mmol)均加入到圆底烧瓶中，然后加入反应溶剂1，4-二氧六环43mL，加热103℃回流搅拌3h，反应完毕。冷却至室温(一般过夜)，有固体析出，抽滤，用水和乙酸乙酯分别洗涤2次，干燥后即可得到化合物25(白色固体)，产率为73-88％。注：反应时间主要取决于哌嗪的量，反应时间随哌嗪量的增多而减少，大概可在3-20h浮动。

实例10化合物

该化合物的¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm11.26(s，1H)，8.78(s，1H)，7.76(s，1H)，7.50-7.63(m，3H)，6.05(s，1H)，4.47(bs，1H)，3.54(t，J＝5.6Hz，6H)，2.43-2.50(m，9H)，2.06(s，H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.58，162.84，159.56，157.60，140.64，138.37，135.34，134.16，132.18，131.13，130.34，128.20，123.04，119.99，82.65，60.61，58.89，53.15，44.01，26.05，17.64；HRMS-ESI(+)：C₂₃H₂₇ClN₉OS，计算值512.1748；检测到512.1744[M+H]⁺。

该化合物的¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm9.89(br，1H)，7.86(s，1H)，7.84(s，1H)，7.40-7.47(m，2H)，7.33(dd，J＝0.8，7.2Hz，1H)，5.87(s，1H)，5.03(br，1H)，3.66(br，4H)，3.29(d，J＝5.2Hz，2H)，2.51-2.56(m，9H)，2.18(s，3H)，1.48(s，9H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.59，162.86，159.59，157.62，156.04，140.64，138.38，135.35，134.18，132.18，131.15，130.34，128.20，123.04，120.01，82.67，78.02，66.83，57.76，52.74，44.11，37.84，28.73，26.05，17.65；MS:[M+H]⁺611.16。

2.9化合物25c-25f的合成

实例11化合物：25c的合成

将化合物25b(500mg，0.82mmol)加入到含有8mL二氯甲烷的圆底烧瓶中，搅拌下加入2mLCF₃COOH，加毕室温反应3h，TLC监测反应完全。低压浓缩除去二氯甲烷，然后向体系中加入5mL甲醇，再加入固体碳酸钠调节pH9～10，过滤除去不溶的固体，滤液浓缩，进一步通过柱层析纯化得化合物25c(334mg，白色固体)。产率为80％。该化合物的¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm8.78(s，1H)，7.76(s，1H)，7.56-7.64(m，2H)，7.51(dd，J＝0.4，7.2Hz，1H)，6.06(s，1H)，3.52(br，4H)，2.69(t，J＝6.4Hz，2H)，2.44-2.45(m，7H)，2.37(t，J＝6.4Hz，2H)，2.07(s，3H)，1.83(s，1H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.58，162.85，159.61，157.63，140.66，138.37，135.36，134.17，132.18，131.14，130.34，128.20，123.04，119.99，82.67，60.41，52.89，44.11，38.60，26.06，17.64；HRMS-ESI(+)：C₂₃H₂₈ClN₁₀S，计算值511.1908；检测到511.1905[M+H]⁺。

实例12-14化合物：25d-25f的合成

在化合物25c基础上采用与4b-4d同样的方法合成了一系列的衍生物，如下示：

化合物25d：

实例12化合物

¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm11.25(s，1H)，8.79(s，1H)，7.76(s，1H)，7.64-7.56(m，2H)，7.51(d，J＝7.2Hz，1H)，6.06(s，1H)，3.80(t，J＝5.6Hz，2H)，3.54(br，4H)，2.66(t，J＝5.6Hz，2H)，2.54(t，J＝4.4Hz，4H)，2.44(s，3H)， 2.07(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.62，162.82，159.59，157.65，140.65，138.37，135.36，134.18，132.16，131.15，130.33，130.19，128.19，123.04，120.03，82.75，56.83，52.26，44.14，43.09，26.06，17.65；HRMS-ESI(+)：C₂₄H₂₆ClN₁₀S₂，计算值553.1472；检测到553.1387[M+H]⁺。

化合物25e：

实例13化合物

¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm9.95(s，1H)，8.27(s，2H)，7.40(d，J＝7.2Hz，1H)，7.23-7.30(m，2H)，6.09(s，1H)，4.08(s，2H)，3.52(br，4H)，3.25(q，J＝6，12Hz，2H)，2.41-2.48(m，9H)，2.24(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ172.39，165.55，165.12，162.77，159.53，157.70，140.67，138.35，135.41，134.16，132.37，132.17，131.12，130.34，128.19，125.33，123.10，119.98，82.88，57.17，52.55，43.77，36.30，26.05，17.64；HRMS-ESI(+)：C₂₆H₃₀ClN₁₀OS，计算值565.2014；检测到565.1992[M+H]⁺。

化合物25f：

实例14化合物

¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δppm11.26(s，1H)，8.79(s，1H)，8.18(t，J＝5.2Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.51-7.64(m，1H)，6.05(s，1H)，4.08(s，2H)，3.52(br，1H)，3.263(q，J＝6.4Hz，2H)，2.42-2.49(m，9H)，2.07(s，3H)；¹³CNMR(100MHz，DMSO-d₆)δ165.82，162.40，161.48，159.35，157.94，140.58，138.36，135.43，134.15，132.21，131.13，130.36，128.21，123.17，120.27，83.59，59.45，58.20，53.05，43.15，37.89，26.02，17.65；HRMS-ESI(+)：C₂₆H₃₀ClN₁₀OS，计算值587.1624；检测到587.1640[M+H]⁺。

实施例4由实施例1至实施例3制备的实例1至实例14化合物的活性测试

MTT粉末购买于Sigma公司，用磷酸缓冲液(PBS)将其配制成浓度为5毫克/毫升的溶液，选取0.22μm滤膜进行过滤，然后于4℃下避光保存。K562细胞(慢性粒细胞白血病细胞系)购于自北京金紫晶生物科技有限公司。实验中所使用的细胞培养基为改良型RPMI-1640(Hyclone)基础培养基，添加10％的胎牛血清(Hyclone)。

MTT比色法测定细胞活性包括下面几个步骤(以K562细胞的测试方法为例，KG1aHL60细胞的测试方法与K562细胞的方法一致)：

(1)选取处于对数生长期的K562细胞，按每孔3×10³接种于96孔板，5％CO₂，37℃孵育培养过夜。

(2)加药，本实验中设置了9个浓度梯度，体系中药物终浓度梯度为：30μM，15μM，7.5μM，3.7μM，1.8μM，0.9μM，0.5μM，0.2μM，0.1μM。每个浓度5个复孔，同时设置对照组(不加药仅接种细胞)及空白孔(未接种细胞仅加培养基)，5％CO₂，37℃培养箱孵育72小时。

(3)每孔再加入20μLMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4小时。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲洗2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

(4)4小时后终止培养，小心地吸去孔内的液体。并向每孔加入150μL的二甲基亚砜。然后置于摇床上低速振荡15分钟左右，使结晶物充分溶解。采用酶联免疫检测仪MULTISKANFC(Thermoscientific)测定490nm处及570nm各孔的吸光度值，测量时以空白孔作为调零孔。

(5)处理数据。以药物浓度为横坐标，细胞数为纵坐标，用数据处理软件SPSS软件(IBM公司)进行几率单位加权回归法(Bliss法)进行数据处理，作图，得到IC₅₀和IC₉₀值，见表1。

表1 实例1至实例14化合物对K562，KG1a，HL60细胞的抑制作用

通过表1，可以看出在实施例中制备的实例1至实例14化合物(分别对应于化合物4a-4d，13a-13e，25a以及25c-25f)均可以有效地抑制K562，HL60，KG1a细胞的增殖，特别是实例3化合物(化合物4c)在药物浓度低于阳性对照药物达沙替尼的情况下，仍可以同样实现有效抑制K562，HL60，KG1a细胞增殖的效果，因此，本发明提供的实例1至实例14化合物可以用于治疗白血病。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改，等同替换，改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。