本发明涉及一种疾病相关基因的检测技术，尤其涉及一种引物组，用于判断抗凝血酶基因缺失和突变与否，以及使用该引物组检测抗凝血酶基因缺失和突变与否的方法，以及在检测中应用。
背景技术：
血栓形成是目前最常见的临床疾病和死亡原因之一，其临床特点为高发病、高死亡和高医疗费用。1965年，Egeberg在报道一个挪威家族具有血栓形成倾向时使用了易栓症(Thrombophilia)这一词(Thromb Diath Haemorrh.1965,13,516～530)。该症是一类具有高危血栓栓塞倾向的疾病综合症，多因抗凝蛋白(抗凝血酶、蛋白C、蛋白S等)、凝血因子(因子VIII、IX和XI等)和纤溶蛋白等缺陷所致，分遗传性和获得性两大类。
根据栓塞类型，易栓症包括动脉和静脉血栓形成，但主要为静脉血栓栓塞症，常分布在少见部位如：下肢深静脉、肠系膜静脉及脑静脉血栓形成。其栓塞部位具有分布广泛、反复发作的特点，而使其临床表现差异很大。
遗传学研究揭示了易栓症部分遗传机制，该病症栓塞部位与其对应的基因异常有关，来自多项病例-对照研究显示，因子V Leiden、凝血酶原G20210A基因多态性是深静脉血栓重要的危险因素(J Thromb Thrombolysis.2005,19,189～196)，而因子V Leiden G1691A与脑静脉窦血栓形成密切相关(J Clin Neurosci.2012,19,1326～1327)。又有研究表明，易栓症的遗传病因存在明显的种族差异，中国人多存在蛋白C、蛋白S缺乏，而高加索人则更多见于因子V Leiden、凝血酶原G20210A基因异常(Br J Haematol.2000,111,1253～1255)。更为有趣的发现是，蛋白S缺乏和R355C的突变与脑白质梗塞有关(Neurology.2010,75,2185～2189)。上述研究揭示了易栓症的基因型与其临床表型存在密切关联，推测其遗传机制亦可能极其复杂。
抗凝血酶(Antithrombin，AT)是一种由肝脏细胞合成，分泌至血浆中的丝氨酸蛋白酶抑制剂，作为一种内源性抗凝剂，它与凝血酶、激活因子X(FXa)、FIXa、FXIa和FXIIa形成失活复合体达到抑制凝血的作用，AT缺乏将导致血栓风险的明显增高。众多研究表明，遗传性AT缺失症患者，较其他原因如：蛋白C和蛋白S缺乏患者，表现出更加严重的临床征象，其深静脉血栓形成风险高达20倍左右(Thromb Res.2013,132,367～373)
遗传性AT蛋白缺失症是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，由编码AT蛋白的基因SERPINC1突变引起。已有研究发现，SERPINC1基因突变后通过影响AT蛋白的定 位、分泌和活性等，进而影响易栓症的发病(Blood Cells Mol Dis.2012,48,254～259；Thromb Res.2013,132,367～373)。
虽然已有诸多研究揭示了易栓症的临床表现与多种蛋白的缺失存在密切关联，但该症的遗传病因可能极其复杂。目前，易栓症遗传方面的研究多采用传统的遗传学方法，且停留在抗凝血酶、蛋白C、蛋白S等活性或基因多态性检测层面，这些远不能完全解释易栓症这一复杂疾病的遗传性。
鉴于遗传因素在易栓症发病过程中的重要作用，有必要进一步探索相关影响因素的检测手段和检测方法，以指导临床医疗。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种引物对，用于实现抗凝血酶基因缺失和突变与否的判断，利于临床防治手段的实施。
本发明的另一个目的在于提供一种检测方法，采用引物对扩增并检测抗凝血酶相关基因，判断是否存在缺失和突变情形，利于临床防治手段的实施。
本发明的再一个目的在于提供一种检测试剂盒，以检测抗凝血酶相关基因，为临床诊断提供判断的参照依据。
本发明的又一个目的在于提供一种引物对，在检测抗凝血酶基因SERPINC1中的应用。
本发明提供的一种引物对，由具有如下序列的引物组成：
引物1，其具有SEQ ID No 1所示序列或其同源序列；
引物2，其具有SEQ ID No 2所示序列或其同源序列。
本发明引物对在检测易栓症抗凝血酶相关基因突变中的应用，判断SERPINC1基因是否缺失突变。
与SERPINC1基因序列相比较，本发明引物对获得的试样SERPINC1基因序列为360bp，在2号和3号外显子(第834位～第845位)上存在连续12个碱基序列的缺失突变(GTGAGCTCATTGA>G)。
本发明引物对能用于检测试样并获得缺失突变的抗凝血酶基因SERPINC1，通过电泳与SERPINC1基因序列进行比较，判断试样中的抗凝血酶基因是否存在缺失。
本发明提供一种检测方法，以对抗凝血酶基因进行检测，判断是否存在缺失和突变情形，其步骤为：
先将引物1和引物2组成引物对，对试样进行一代PCR扩增，获得抗凝血酶基因SERPINC1扩增试样；
然后，将抗凝血酶基因SERPINC1扩增试样与抗凝血酶基因SERPINC1基因序列扩增产物同时电泳，比较电泳条带的运动距离，运动距离长的表明试样的抗凝血酶基因 SERPINC1存在缺失突变。
对于缺失突变的电泳条带，进一步可通过测序的方式进行验证。
本发明提供的引物对，还包括在引物1的5’端结合标记物，如：但不仅限于荧光标记物(TAMRA、FAM、FITC、Dansyl和Biotin等)和同位素标记物等，以观察并直接判断试样的抗凝血酶基因SERPINC1存在缺失突变。
本发明引物对用于制作检测SERPINC1相关基因的试剂盒。
本发明提供的一种检测试剂盒，包括
引物1，其具有SEQ ID No 1所示序列或其同源序列；和
引物2，其具有SEQ ID No 2所示序列或其同源序列。
本发明提供的引物对用于筛查和验证抗凝血酶低于临床检测参考水平的原因。临床检测参考水平应理解为，依据一种检测方法，对受检者的检测项目进行临床评价，而设定的数值范围(包括数值点和数值区间)。如：抗凝血酶Ⅲ活性检测的参考范围为84.6％～120.2％；再如：抗凝血酶Ⅲ抗原检测的参考范围为25mg/dl～26mg/dl。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明提供的引物对适用于扩增SERPINC1基因，以判断试样中的SERPINC1基因是否存在缺失突变，为该病症的诊断提供有益参考，与其它诊断手段一起互相应证，而利于患者的临床确诊，还对该病症的诊疗方案的确定和实施提供依据。
本发明提供的引物对进行常规的分子生物学操作即可获得SERPINC1的DNA片段，在与对照比较后，即可为蛋白水平检测异常的结果提供基因水平的参考依据。
附图说明
图1为本发明引物对对取自患者的试样进行扩增并取得SERPINC1基因的电泳图；其中，“M”表示marker，由上之下4个条带分别对应1200bp、750bp、500bp和200bp，“Mut”表示获得的存在缺失突变的DNA片段，“N”表示SERPINC1基因正常的DNA片段。
具体实施方式
以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明涉及分子生物学实验，若没有特别注明，可参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域 技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。此外，根据不同实验目的，本领域技术人员在各种商品化试剂盒(Kit)所附带的操作手册的指导下完成相应的实验或委托专业化的公司进行，如：基因测序、质粒测序和确定分子量等。
本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛－奥德里奇(Sigma－Aldrich)。
先证者因“头痛、呕吐1天”就诊，后确诊为脑静脉血栓形成。该名病患最早在19岁发病，两次深静脉血栓形成，两次不良妊娠事件，一次肠系膜静脉血栓，一次脑静脉血栓。
对患者分别进行了抗凝血酶Ⅲ活性检测和抗凝血酶Ⅲ抗原检测，检测结果见表1
表1
表1可见，患者的抗凝血酶抗原及活性水平检测均显著低于临床参考范围，表明患者体内的抗凝血酶蛋白水平相较于一般的大多数人的水平呈现明显异常。
采用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司)从患者提取血液DNA试样，具体步骤为：
1)取500μl抗凝血，加入700μl的细胞裂解液CL，静置5min。
2)12,000rpm离心3min，吸去上清，留下细胞核沉淀，加入200μlGS，振荡混匀，加入20μl Proteinase K溶液，混匀。
3)加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。
4)加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀。
5)将上一步得到的溶液转入一个CB3吸附柱中，12000rpm离心30s后去除废液。
6)利用试剂盒的GD和PW依次洗脱柱子，室温放置7min晾干。
7)加入100μl的洗脱缓冲液TB，静置3min后离心，收集洗脱液。
8)紫外分光光度计测OD值，检测DNA浓度和纯度，保证DNA浓度>50ng/ml。
9)保存于-20℃备用。
采用SEQ ID No 1和SEQ ID No 2组成引物对，对取自该患者的试样进行PCR扩增检测。
PCR扩增具体方法如下：
反应体系为：
反应条件为：
3.PCR产物鉴定
PCR扩增获得产物经2％琼脂糖凝胶电泳，比较电泳条带的运动距离，发现试样的运动距离略长于正常的SERPINC1基因序列扩增产物(参见图1)。此外，亦可通过标记物判断是否获得缺失的目标基因。
割胶获得抗凝血酶基因SERPINC1扩增试样，经一代测序判断获得的缺失突变的基因长度为360bp，还发现试样的SERPINC1基因在第834位～第845位上存在连续12个碱基序列的缺失突变(GTGAGCTCATTGA>G)。由此，从基因水平验证了患者体内的抗凝血酶蛋白水平相较于一般的大多数人的水平呈现明显异常的原因。
进一步分析，该段缺失突变的基因使得抗凝血酶的氨基酸编码更改为INELT239T，位于AT蛋白的功能区(Serpin domain)。
在获得病人知情同意后，收集该易栓症家系共38人临床资料及血样，发现多名家系成员出现类似症状(参见表2)。
表2
该家系所有成员均否认存在获得性易栓疾病，如：抗磷脂综合征、肿瘤、肾病综合症和心衰等，以及获得性易栓因素，如：手术、外伤、口服避孕药和激素治疗等。总结该家系的临床特点：①发病年龄较轻；②有明确的家族史；③复发性血栓栓塞事件，一个患者可先后出现相同或不同部位的血栓形成；④存在少见部位的血栓栓塞，如：下肢、肠系膜、脑静脉；⑤同时合并动脉血栓形成；⑥复发性不良妊娠。
同样的，采用本发明引物组对该家系的另二名病患和一名家系中正常者进行检测(参见图1)，检测结果显示两名患者的SERPINC1基因均在第834位～第845位上存在连续12个碱基序列的缺失突变(GTGAGCTCATTGA>G)。该名家系中的正常者并未被检测出具此种基因缺失突变。
由此进一步验证SERPINC1基因在第834位～第845位上存在连续12个碱基序列的缺失突变，破坏了抗凝血酶蛋白的功能区，而与抗凝血酶蛋白水平检测具有相关性。