本发明涉及基因工程
技术领域：
中一种水稻穗顶部生长发育相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：水稻是重要的粮食作物，为世界上大约一半的人口提供主食。提高水稻产量的研究一直是作物遗传育种的主要目标。水稻产量主要是由单位面积有效穗数、每穗粒数和千粒重三个因素所决定的，在穗数不变的前提下，增加每穗粒数能够较大程度地提高水稻的产量。稻穗的形成过程是一个涉及腋生分生组织发育、花序结构建成和籽粒发育的复杂生理生化过程，是众多基因参与调控的一个复杂有序的网络系统。然而在水稻花序结构形成之后到开花之前，穗顶部已经形成的小花容易发生退化，造成单个穗子实粒数减少，单株产量严重降低，这种在水稻育种和生产上普遍存在的现象即为水稻穗顶部小花退化现象。近年来，一些在水稻穗发育过程中发挥调控作用的重要基因陆续被克隆和研究，然而，水稻穗顶部退化性状的遗传和分子研究很少，而且退化的程度极易受环境条件的影响，从而增加了研究的难度。因此，深入研究穗顶部小穗退化现象的遗传和分子机理，克隆鉴定引起穗顶部退化相关的功能基因，不仅能了解水稻穗顶部生长发育这一重要的生物学过程，同时也对分子遗传改良提高水稻的产量的研究具有重要的理论意义和应用价值。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种调控水稻穗顶部生长发育相关的蛋白及其编码基因。为解决上述技术问题，本发明首先提供了水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1在调控水稻穗顶部生长发育中的应用。本发明所提供的水稻穗顶部生长发育相关蛋白，名称为OsPAA1，来源于稻属水稻(Oryzasativa)的正常穗型品种Kita-ake的氨基酸序列，在调控水稻穗顶部生长发育中的应用中，所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1为a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQIDNo.1所示的蛋白质；b)在SEQIDNo.1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1活性的由a)衍生的蛋白质。所述调控水稻穗顶部生长发育可为调控水稻穗顶部小花发育。其中，SEQIDNo.1由488个氨基酸残基组成。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQIDNo.1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的OsPAA1蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的OsPAA1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的OsPAA1蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNo.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料在调控水稻穗顶部生长发育中的应用。本发明所提供的与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料在调控水稻穗顶部生长发育中的应用中，与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：A1)核酸分子1；所述核酸分子1为编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子1的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子1的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子1的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子1的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；A13)含有A1)所述核酸分子1的转基因植物组织；A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；A17)含有A1)所述核酸分子1的转基因植物器官；A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料在调控水稻穗顶部生长发育中的应用或在培育水稻穗顶部退化的转基因水稻中的应用。本发明所提供的与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料在调控水稻穗顶部生长发育中的应用或在培育水稻穗顶部退化的转基因水稻中的应用中，与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料为下述B1)至B20)中的任一种：B1)核酸分子2；所述核酸分子2为降低所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因表达的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子2的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子2的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子2的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子2的转基因植物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；B13)含有B1)所述核酸分子2的转基因植物组织；B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；B17)含有B1)所述核酸分子2的转基因植物器官；B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。上文中，所述调控水稻穗顶部生长发育可为调控水稻穗顶部小花发育。上述与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料在调控水稻穗顶部生长发育中的应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述应用中，所述核酸分子1为如下1)-5)中任一所示的基因：1)其编码序列是SEQIDNo.2的cDNA分子或DNA分子；2)序列是SEQIDNo.3的cDNA分子或DNA分子；3)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的cDNA分子或基因组DNA分子；4)与2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的cDNA分子或基因组DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的cDNA分子或基因组DNA分子。上述用于编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQIDNo.2的第1-1467位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQIDNo.3的第1-3342位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评 价相关序列之间的同一性。所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。其中，SEQIDNo.2由1467个核苷酸组成，其编码序列是第1-1467位，编码SEQIDNo.1所示的蛋白质。上述与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料在调控水稻穗顶部生长发育中的应用或在培育水稻穗顶部退化的转基因水稻中的应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述应用中，所述核酸分子2如下式I所示的DNA片段：SEQ正向-X-SEQ反向(I)；所述SEQ正向是SEQIDNo.2中的第1-423位的核苷酸序列；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。所述式I所示的DNA片段的核苷酸序列为SEQIDNo.4，SEQIDNo.4中第1-423位的核苷酸序列为SEQIDNo.2中的第1-423位的核苷酸序列，第429-1616位的核苷酸序列为ArabidopsisFAD2intron的核苷酸序列，第1623-2045位的核苷酸序列为SEQIDNo.2中的第1-423位的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列。上述与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如A2)所述的含有编码所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的DNA。上述与所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1相关的生物材料中，所述表达盒是指能够抑制宿主细胞中相应蛋白的编码基因表达的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如B2)所述的含有降低所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因表达的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中抑制所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因表达的DNA。进一步，A2)所述表达盒或B2)所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型 启动子。启动子的例子包括但不限于：组成型启动子T7lac、花椰菜花叶病毒的组成型启动子CaMV35S、番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(Smallsubunitofribulose-1,5-bisphospatecarboxylase,rbcs)基因启动子；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol.120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：T7终止子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等(1985)，Nature，313:810；Rosenberg等(1987)，Gene,56:125；Guerineau等(1991)，Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)，Cell,64:671；Sanfacon等，GenesDev.，5:141；Mogen等(1990)，PlantCell,2:1261；Munroe等(1990)，Gene，91:151；Ballad等(1989)，NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等(1987)，NucleicAcidRes.,15:9627)。可用现有的植物表达载体构建含有所述OsPAA1基因表达盒的重组载体，如pET-28a、pCAMBIA2301、pSP72、pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。可用现有的RNA干扰载体构建含有降低所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因表达的DNA分子的表达盒的重组载体，如pLHRNAi。OsPAA1基因载体或降低所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因表达的基因载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的OsPAA1基因或降低所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因表达的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。A3)或A4)所述重组载体可含有SEQIDNo.2的第1-1467位所示的用于编码水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的DNA序列。B3)或B4)所述重组载体可含有SEQIDNo.4所示的降低所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因表达的DNA序列。上述生物材料中，A5)-A8)中任一所述重组微生物或B5)-B8)中任一所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。A9)-A12)中任一所述的转基因细胞系，A13)-A16)中任一所述的转基因植物组织，A17)-A20)中任一所述的转基因植物器官，B9)-B12)中任一所述的转基因细胞系，B13)-B16)中任一所述的转基因植物组织和B17)-B20)中任一所述的转基因植物器官不包括植物的繁殖材料。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育水稻穗顶部退化的转基因水稻的方法。本发明所提供的一种培育水稻穗顶部退化的转基因水稻的方法，是抑制受体水稻中所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因的表达，得到穗顶部退化的转基因水稻。上述方法中，所述抑制受体水稻中所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因的表达具体可为降低受体水稻中所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因的表达水平。上述方法中，所述水稻穗顶部退化体现为结实率降低。上述方法中，所述抑制受体水稻中所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因的表达是通过将如下式I所示的DNA片段导入受体水稻中实现的：SEQ正向-X-SEQ反向(I)；所述SEQ正向是SEQIDNo.2中的第1-423位的核苷酸序列；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。上述方法中，所述式I所示的DNA片段的核苷酸序列为SEQIDNo.4。上述方法中，抑制受体水稻中所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因的表达可通过将RNA干扰载体导入到受体水稻中实现的，所述RNA干扰载体具体可为重组表达载体pLHRNAi-OsPAA1。重组表达载体pLHRNAi-OsPAA1是将表达载体pLHRNAi的SacI和SnaBI识别位点间的序列替换为SEQIDNo.4所示的DNA序列。所述重组表达载体pLHRNAi-OsPAA1可通过使用农杆菌介导、Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞或组织。所述方法还包括从导入SEQIDNo.4所示的DNA分子的受体水稻中筛选所述水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因的表达量降低的水稻，得到所述OsPAA1基因表达水平降低的转基因水稻的步骤。上文中，所述转基因水稻理解为不仅包含将所述基因转化受体水稻得到的第一代转基因水稻，也包括其子代。对于转基因水稻，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因水稻包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。本发明所提供的所述核酸分子2也属于本发明保护的范围。上文中，所述水稻具体可为Kita-ake。实验证明，将本发明的SEQIDNo.4所示的DNA分子(靶基因是OsPAA1基因)导入水稻中,获得OsPAA1基因表达水平降低的RNAi干扰转基因水稻的OsPAA1基因表达水平低于受体亲本水稻，而且该RNAi干扰转基因水稻出现了穗顶部退化的表型。本发明首次鉴定了与水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1，水稻穗顶部生长发育相关蛋白OsPAA1的编码基因在功能丧失或表达量下降的条件下会引起水稻穗顶部的小穗发生退化，证明水稻穗顶部生长发育相关蛋白或其基因在控制水稻穗顶部小花发育过程中发挥重要作用。本发明不仅为进一步阐明水稻穗顶部退化的分子机理提供基础，而且为水稻育种提供新的基因资源和育种资源。本发明获得的OsPAA1基因表达降低的转基因水稻，作为新的水稻种质材料，可用于研究水稻穗顶部退化的分子机理和发现更多的调控水稻穗发育的基因。本发明对于通过遗传育种和基因工程方法利用该基因资源有效地控制水稻穗顶部退化现象具有重要的应用价值。附图说明图1为OsPAA1基因表达水平降低的RNAi干扰转基因水稻的OsPAA1基因的转录水平的检测。图2为OsPAA1基因表达水平降低的RNAi干扰转基因水稻的表型观察。图1和2中的WT代表受体亲本Kita-ake植株，RNAi-1代表转入重组载体pLHRNAi-OsPAA1的干扰阳性植株RNAi-1植株和RNAi-2代表转入重组载体pLHRNAi-OsPAA1的干扰阳性植株RNAi-2植株。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的水稻Kita-ake(也称为野生型水稻，简称WT)记载在如下文献中，GaoH,ZhengXM,FeiG,ChenJ,JinM,RenY,WuW,ZhouK,ShengP,ZhouF,JiangL,WangJ,ZhangX,GuoX,WangJL,ChengZ,WuC,WangH,WanJM.Ehd4encodesanovelandOryza-genus-specificregulatorofphotoperiodicfloweringinrice.PLOSGENET.2013，9(2):e1003281)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中所用表达载体pLHRNAi按照下述专利中的方法构建：一种RNA干扰载体及其应用，专利申请号：201110055864.X。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的农杆菌为根癌农杆菌EHA105(AgrobacteriumtumefaciensEHA105)(NewAgrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.Hood,ElizabethE；Gelvin,StantonB；Melchers,LeoS；Hoekema,Andre.Transgenicresearch,2(4):p.208-218(1993))公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、抗退化相关蛋白OsPAA1的编码基因OsPAA1的RNA干扰载体的构建1、OsPAA1基因的获得以水稻Kita-ake(Oryzasativavar.Kita-ake)的基因组DNA为模板，用如下引物primer1和primer2进行PCR扩增获得目的基因。其中的下划线部分为In-Fusion酶连接用接头。primer1：5'-ATCCTCTAGAGTCGACATGGACGCCGCCGCGAGGGAA-3'；primer2：5'-ATCCTCTAGAGTCGACTTAGACCTGTTCAGGGTGCTTC-3'。将PCR产物回收纯化后连接入pBS-T(购买自北京Tiangen公司)测序载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆后，进行测序。测序结果表明，扩增得到的PCR产物的长度为1.5Kb，序列如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，命名为OsPAA1基因。OsPAA1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，将该蛋白命名为OsPAA1。2、OsPAA1基因干扰片段的获得1)使用RNApreppure植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取水稻Kita-ake(Oryzasativa)的14天幼苗的总RNA，反转录得到cDNA。2)以步骤1)得到的cDNA为模板，用OsPAA1-sense-F和OsPAA1-sense-R组成的引物进行PCR扩增，得到片段1(SEQ正向)。OsPAA1-sense-F：5'-TTCTGCACTAGGTACCAGGCCTGATGGACGCCGCCGCGAGGG-3'；OsPAA1-sense-R：5'-CTGACGTAGGGGCGATAGAGCTCGTTCACGCCGAGCGCGAGCAG-3'。3)以步骤1)得到的cDNA为模板，用OsPAA1-antisense-F和OsPAA1-antisense-R组成的引物进行PCR扩增，得到片段2(SEQ反向)。OsPAA1-antisense-F:5'-CGGGGATCCGTCGACTACGTTCACGCCGAGCGCGAGCAG-3'；OsPAA1-antisense-R:5'-AGGTGGAAGACGCGTTACATGGACGCCGCCGCGAGGG-3'。3、OsPAA1基因RNA干扰载体(重组表达载体pLHRNAi-OsPAA1)的构建1)用限制性内切酶SacI酶切表达载体pLHRNAi，得到线性表达载体pLHRNAi，回收该线性片段。将步骤2的2)中得到的片段1采用同源重组定向克隆的方法整合到线性表达载体pLHRNAi上(具体方法参考clontechinfusionkit说明书)，得到同源重组产物1，再将同源重组产物1转入DH5α感受态细胞，37℃培养过夜，得到重组载体pLHRNAi-sense-OsPAA1。2)用限制性内切酶SnaBI酶切重组载体pLHRNAi-sense-OsPAA1，得到了线性载体pLHRNAi-sense-OsPAA1，回收该线性载体。将步骤2的3)得到的片段2采用同源重组定向克隆的方法整合到线性载体pLHRNAi-sense-OsPAA1上(具体方法参考clontechinfusionkit说明书)，得到同源重组产物2，再将同源重组产物2转入DH5α感受态细胞，37℃培养过夜，得到重组载体pLHRNAi-OsPAA1。3)对重组载体pLHRNAi-OsPAA1进行测序，结果表明该重组载体pLHRNAi-OsPAA1是在表达载体pLHRNAi的SacI酶切位点正向插入了SEQIDNo.2的自5’末端第1至423位核苷酸序列所示的双链DNA片段，SnaBI酶切位点插入了与SEQIDNo.2自5’末端第1至423位核苷酸序列所示的双链DNA片段反向互补的双链DNA片段，即成功将pLHRNAi的SacI和SnaBI识别位点(识别序列)间的DNA序列替换为SEQIDNo.4所示的DNA序列。实施例2、培育OsPAA1基因表达水平降低的RNAi干扰转基因植株及转基因 植株的鉴定一、培育OsPAA1基因表达水平降低的RNAi干扰转基因植株将重组载体pLHRNAi-OsPAA1通过根癌农杆菌EHA105介导转化Kita-ake粳稻，具体方法如下：1、将实施例1得到的重组载体pLHRNAi-OsPAA1用热激法导入根癌农杆菌EHA105中得到含有重组载体pLHRNAi-OsPAA1的重组根癌农杆菌EHA105。将含有重组载体pLHRNAi-OsPAA1的重组根癌农杆菌EHA105在28℃培养16h，收集菌体。采用含有浓度为100μM乙酰丁香酮的N6液体培养基(Sigma，产品目录号为C1416)将菌体进行稀释，得到稀释菌液，稀释菌液的OD600≈0.5。2、将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤1的稀释菌液混合侵染30min，采用滤纸吸干菌液后转入N6固体共培养培养基中，在24℃共培养3d，得到共培养处理后的愈伤组织。3、将步骤2的共培养处理后的愈伤组织接种在含有质量浓度为150mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基(向N6固体培养基中加入潮霉素得到N6固体筛选培养基，N6固体筛选培养基中潮霉素的质量浓度为150mg/L)上进行第一次筛选。4、在第一次筛选开始的第16天挑取健康愈伤组织转入含有质量浓度为200mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基(向N6固体培养基中加入潮霉素得到N6固体筛选培养基，N6固体筛选培养基中潮霉素的质量浓度为200mg/L)上进行第二次筛选，每15天继代一次，共继代1次。5、挑取步骤4获得的抗性愈伤组织转入含有质量浓度为150mg/L潮霉素的分化培养基上(分化培养基：6-BA2mg,NAA0.2mg,N64g,水解酪蛋白1g,肌醇0.1g，蔗糖25g,山梨醇2.4g,琼脂粉7g，去离子水1L)进行分化，在24℃培养45d(此时植株地上部分高度约为15cm),打开瓶口炼苗3天，然后移栽至温室栽培，即为转pLHRNAi-OsPAA1植株(T0代)。二、OsPAA1基因表达水平降低的RNAi干扰转基因植株的PCR鉴定提取步骤一获得的转pLHRNAi-OsPAA1植株的T0代幼苗和受体亲本水稻Kita-ake植株的幼苗(简称为WT)的基因组DNA，并采用引物1390-F(5’-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3’)和引物FAD2-R(5’-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3’)进行PCR分子检测鉴定阳性苗，得到562bpPCR产物的植株为阳性苗，取两株阳性苗，分别命名为转入pLHRNAi-OsPAA1植株RNAi-1(简称RNAi-1植株)和转入pLHRNAi-OsPAA1植株RNAi-2(简称RNAi-2植株)。三、OsPAA1基因表达水平降低的RNAi干扰转基因植株的OsPAA1基因表达水平的鉴定分别提取步骤二得到的RNAi-1植株、RNAi-2植株和受体亲本水稻Kita-ake植株(简称为WT)叶片的RNA，设定内参为Ubiquitin，利用内参引物UBI-F和UBI-R，以及OsPAA1基因特异性定量引物OsPAA1-qRT-F和OsPAA1-qRT-R进行荧光定量PCR反应来检测不同转基因干扰植株OsPAA1基因的表达水平的变化。结果表明(图1)，在转入重组载体pLHRNAi-OsPAA1的干扰阳性植株RNAi-1植株和RNAi-2植株中OsPAA1基因的表达水平均比对照(WT)的OsPAA1基因的表达水平的显著下降。上述引物如下：UBI-F：5’-GCTCCGTGGCGGTATCAT-3’UBI-R：5’-CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3’OSPAA1-qRT-F：5’-GCCTTTGTCACGTTCCTCTC-3’OSPAA1-qRT-R:5’-CTGGGTTGACCTCTGCTCTC-3’四、OsPAA1基因表达水平降低的RNAi干扰转基因植株的表型鉴定分别将步骤二得到的RNAi-1植株、RNAi-2植株和受体亲本水稻Kita-ake植株(简称为WT)种植在中国农业科学院作物科学研究所昌平实验基地，观察整个生长期内RNAi-1植株、RNAi-2植株和受体亲本水稻Kita-ake植株(简称为WT)的表型差异。观察结果如图2，与受体亲本水稻Kita-ake植株相比，RNAi-1植株和RNAi-2植株均出现了穗顶部退化的表型，小花发育停滞，稻穗成熟之后逐渐干瘪并脱落，从而证明了OsPAA1基因参与控制水稻穗顶部小花的生长发育，即该OsPAA1基因为水稻穗顶部抗退化相关基因。当前第1页1 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