本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离提取琥珀酸钠的方法。
背景技术：
丁二酸(Succinic Acid，Butanedioic Acid)，又称琥珀酸，被美国FDA认定为“一般认为安全”(GRAS)，因此可以用于多种用途。2004年美国能源部的一份报告指出，丁二酸是合成大宗日用品和重要化学品的平台化学物质，有着巨大的经济价值。随着能源紧缺，利用生物发酵法生产丁二酸的前景非常广阔。
目前已开发出多项技术将丁二酸转化为重要的工业化学品，包括N-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、己二酸、PBT树脂、PBS可降解材料等。其中许多化工产品目前都是以石油或煤化工产品(如苯、丁烷等)为原料合成的，受原料价格波动较大，且资料紧缺，不可再生。现报道大约有250种以苯或丁烷为原料的化工产品可以通过丁二酸为原料来生产。因此，全球对丁二酸的需求将不断加大。
目前从发酵液中分离提取丁二酸的主要有钙盐法、液液萃取法、吸附法、电渗析法、膜分离等方法。
发酵液中提取丁二酸的经典方法是液/液萃取，该法缺点是在提取过程中使用大量的有机溶剂，从而影响了其在医药食品行业的应用。
钙盐法是在柠檬酸、乳酸等行业中应用较为广发的方法。专利号CN101643400A公开了一种丁二酸的钙盐法提取工艺，主要通过丁二酸盐与氯化钙进行反应生成丁二酸钙沉淀，然后将丁二酸钙进行酸化结晶从而得到丁二酸产品，当钙盐法最大的 弊端就是产生大量的较难处理的副产物石膏，污染环境。
电渗析技术。发酵过程中用NaOH中和发酵液形成可溶的丁二酸钠，然后发酵液经过过滤，电渗析膜脱盐使丁二酸钠和其它离子、浓缩的糖、蛋白质及氨基酸分离，使丁二酸全部转化为丁二酸的钠盐，再将丁二酸钠溶液打人分批的两极膜电渗析单元，丁二酸钠转化为丁二酸，钠离子在阳极膜转化为氢氧化钠，可重新用于中和发酵液。CN101486637A公开了一种从发酵液中采用电渗析方法提取丁二酸的工艺，但是此方法能耗较高，且膜组件容易污染，目前工业上应用的较少。
近年来膜技术在发酵领域的成功应用使得生物发酵在分离提取过程中的连续操作性得到大大提升。本发明基于膜分离技术，开发出了新的丁二酸分离纯化工艺。
专利号为ZL200610086003.7公开了一种从厌氧发酵液中分离提取丁二酸的方法，该方法是将发酵液采用微滤膜过滤，然后再用超滤膜过滤，再用活性炭脱色除杂质，得到澄清的丁二酸溶液，浓缩，结晶得到丁二酸产品。主要存在的问题是活性炭用量较大，丁二酸损失率较大且得到的丁二酸产品纯度较低。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种新的制备琥珀酸的方法，该方法是将琥珀酸从发酵液中分离纯化出来。
为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种琥珀酸的制备方法，其步骤具体如下：
(1)微生物发酵法培养得到琥珀酸钠发酵液；
(2)调节含有琥珀酸发酵液的pH值，将琥珀酸发酵液进行固液分离及部分蛋白和色素的去除，得到澄清的发酵液，发酵液浓缩、结晶，再将晶体进行溶解，溶解后的液体进行活性炭脱色，得到的脱色发酵液进行酸化、结晶、烘干得到琥珀酸。
所述的步骤(1)中微生物发酵法生产琥珀酸钠发酵液包括种子培养和发酵两部分， 所述的种子培养步骤中，种子培养的培养基为pH6.0-8.0的能够提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，培养时通入CO2气体，在温度为37℃，摇床转速为100-300rpm的条件下培养10-16h；发酵采用的菌种为产琥珀酸放线杆菌和大肠杆菌；
所述的发酵步骤中，发酵培养的培养基为pH 6.0-8.0的能够提供碳源、氮源及无机盐的液体培养基，接种量为7％(v/v)，温度为37℃，以碳酸钠为pH调节剂，始终通入CO2气体来保持厌氧环境，整个发酵过程中pH为6.2-7.0，搅拌速度为100-300rpm。
步骤(2)中所述的调节含有琥珀酸发酵液的pH值为5.5～6.5。
步骤(2)中的固液分离采用膜过滤的方式，超滤膜的截留分子量为2000～5000。
步骤(2)中的发酵液浓缩是将发酵液中丁二酸的浓度控制在250g/L～300g/L，浓缩采用的是减压蒸发，温度控制在55～65℃，真空度控制在80～200mbar。
步骤(2)发酵液结晶的温度为4～10℃。
步骤(2)晶体溶解的温度为60～70℃，溶解后的丁二酸浓度为300g/L～350g/L。
步骤(2)进行活性炭脱色的温度为60～70℃，采用活性炭柱的方式进行脱色，活性炭采用颗粒活性炭。
步骤(2)酸化采用盐酸进行酸化，酸化的pH为1.5～2.5，结晶的温度为0～4℃。
有益效果：
本发明专利的一个有益效果便是可以大大降低活性炭的使用量进而降低脱色的成本以及减少琥珀酸因被活性炭吸附造成的损失，原因在于一开始对发酵液的pH控制，让一开始的结晶主要是琥珀酸钠盐的形式存在而不是现有技术的琥珀酸，琥珀酸钠盐具体比琥珀酸在结晶时包裹更少的色素以及其他杂质下来，因而可以降低脱色成本以及提高丁二酸产品的纯度，而现有技术的过程是将发酵液采用微滤膜过滤，然后再用超滤膜过滤，再用活性炭脱色除杂质，得到澄清的丁二酸溶液，浓缩，结晶得到丁二酸产品。主要存在的问题是活性炭用量较大，丁二酸损失率较大且得到的丁二酸产品纯度较低。本发明专利与现有技术采用浓缩前脱色的方式相比，首先 在活性炭用量上将减少50％～75％左右，因为浓缩后脱色的体积将是脱色前的20％～25％，且本发明采用的是活性炭柱进行脱色，方便再生，而现有技术脱色后的活性炭还需要与发酵液进行固液分离，同时活性炭也无法再生，其次本发明专利通过两次结晶可以得到高纯度的丁二酸产品(99.5％以上)而现有技术中并未给出相关纯度。
具体实施方式
用以下的实施例对本发明作进一步说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的进一步说明，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113。
种子培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏5，NaHCO310，NaH2PO4·2H2O 2，K2HPO4·3H2O 3蛋白胨2。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母膏10，玉米浆5，乙酸钠1，KH2PO 3，MgCl2·6H2O 0.3，无水CaCl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为100rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中pH控制在6.2。以碳酸钠作为pH调节剂获得的含丁二酸钠盐的发酵液，其中折合成丁二酸的浓度为60g/L，甲酸浓度为5g/L，乙酸浓度为11g/L，无残糖，发酵液调节至pH 6.0。固液分离采用膜过滤的方式，即先进行微滤在进行超滤的步骤，超滤膜的截留分子量为5000；浓缩时将丁二酸的浓度控制在250g/L，浓缩温度为55℃，真空度控制在80mbar；结晶温度控制在4℃，此时得到的为丁二酸钠的晶体，略带一点黄色；将获得的晶体重新溶解，溶解温度为60℃，溶解后的丁二酸浓度控制在300g/L，经活性炭柱脱色，脱色温度控制在60℃。将获得的澄清脱色液，进行酸化、 冷却结晶，酸化pH控制在1.5，结晶温度控制在0℃，离心烘干晶体即得到高纯度的丁二酸产品，丁二酸产品的纯度为99.7％。
实施例2
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113。
种子培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏5，NaHCO310，NaH2PO4·2H2O 2，K2HPO4·3H2O 3蛋白胨2。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母膏10，玉米浆5，乙酸钠1，KH2PO 3，MgCl2·6H2O 0.3，无水CaCl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为200rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中pH控制在6.8。以碳酸钠作为pH调节剂获得的含丁二酸钠盐的发酵液，其中折合成丁二酸的浓度为60g/L，甲酸浓度为5g/L，乙酸浓度为11g/L，无残糖，发酵液pH调节至6.5。固液分离采用膜过滤的方式，即先进行微滤在进行超滤的步骤，超滤膜的截留分子量为3000；浓缩时将丁二酸的浓度控制在300g/L，浓缩温度为55℃，真空度控制在80mbar；结晶温度控制在8℃，此时得到的为丁二酸钠的晶体，略带一点黄色；将获得的晶体重新溶解，溶解温度为60℃，溶解后的丁二酸浓度控制在300g/L，经活性炭柱脱色，脱色温度控制在60℃。将获得的澄清脱色液，进行酸化、冷却结晶，酸化pH控制在2，结晶温度控制在0℃，离心烘干晶体即得到高纯度的丁二酸产品，丁二酸产品的纯度为99.7％。
实施例3
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113。
种子培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏5，NaHCO310，NaH2PO4·2H2O 2， K2HPO4·3H2O 3蛋白胨2。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母膏10，玉米浆5，乙酸钠1，KH2PO 3，MgCl2·6H2O 0.3，无水CaCl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为300rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中pH控制在7.0。以碳酸钠作为pH调节剂获得的含丁二酸钠盐的发酵液，其中折合成丁二酸的浓度为60g/L，甲酸浓度为5g/L，乙酸浓度为11g/L，无残糖，发酵液pH调控至5.5。固液分离采用膜过滤的方式，即先进行微滤在进行超滤的步骤，超滤膜的截留分子量为2000；浓缩时将丁二酸的浓度控制在350g/L，浓缩温度为55℃，真空度控制在80mbar；结晶温度控制在10℃，此时得到的为丁二酸钠的晶体，略带一点黄色；将获得的晶体重新溶解，溶解温度为60℃，溶解后的丁二酸浓度控制在300g/L，经活性炭柱脱色，脱色温度控制在60℃。将获得的澄清脱色液，进行酸化、冷却结晶，酸化pH控制在2.5，冷却结晶，结晶温度控制在0℃，离心烘干晶体即得到高纯度的丁二酸产品，丁二酸产品的纯度为99.7％。
实施例4
按照实施例1的方式获得含有琥珀酸的发酵液发酵液pH调节至6.0。固液分离采用膜过滤的方式，即先进行微滤在进行超滤的步骤，超滤膜的截留分子量为5000；浓缩时将丁二酸的浓度控制在250g/L，浓缩温度为55℃，真空度控制在80mbar；结晶温度控制在4℃，此时得到的为丁二酸钠的晶体，略带一点黄色；将获得的晶体重新溶解，溶解温度为60℃，溶解后的丁二酸浓度控制在300g/L，经活性炭柱脱色，脱色温度控制在60℃。将获得的澄清脱色液，进行冷却结晶，结晶温度控制在0℃，离心烘干晶体即得到高纯度的丁二酸产品，丁二酸产品的纯度为99.7％。