本发明涉及了一种海藻酸盐微球载体产品，具体地说是一种半乳糖基团接枝改性的海藻酸盐微球载体。
背景技术：
将具有生物活性的物质包封在选择性透过膜中，形成球状的微胶囊，称之为“生物微胶囊”[Chang TMS.Hemoglobin corpuscles.Research report for honours physiology.Medical Library,McGill University,1957]。以生物微胶囊作为细胞的免疫隔离和运载工具，利用基因重组细胞或原代细胞的代谢产物来调节机体生理功能，治疗相关疾病是生物医学工作者的研究热点[Basic D,Vacek I,Sun A M.Microencapsulation and transplantation of engineered cells：a new approach to somatic gene therapy.Art Cells Blood Subs ImmobBiotechnol,1996,24(3)：219-255]。海藻酸盐因其具有优良的物理化学性能和生物医学性能，成为微囊化技术的主要材料。现有的微囊化技术在培养肝细胞时，由于肝细胞贴壁依赖的生长特性，微囊内部三维立体环境不能够使肝细胞迅速适应生长。半乳糖基团是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体，能够特异性识别肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体，因此，在微囊材料上引入肝靶向的半乳糖基团，可诱导和提高肝细胞在微胶囊内部的黏附和增殖行为[Jun Yang,Galactosylated alginate as a scaffold for hepatocytes entrapment,Biomaterials,2002,23:471-479]。目前在微囊内部引入半乳糖基团可通过在海藻酸上的共混或共价修饰。含有半乳糖基团的大分子物质[Seog-Jin Seo,Yun-Jaie Choi,Alginate microcapsules prepared with xyloglucan as a synthetic extracellular matrix for hepatocyte attachment,Biomaterials,2005,26:3607-3615]主要通过与海藻酸共混制备微胶囊来发挥作用，共混的物质易发生泄漏因此导致了这类微胶囊的稳定性降低；而针对于海藻酸的共价修饰主要发生在海藻酸的羧基部位，羧基位点的占据使得海藻酸在凝胶化反应形成微胶囊的时候凝胶化程度降低，为了不过度影响海藻酸的成胶性能，半乳糖基取代度受到限制，文献报道取代度19％对凝胶化过程无影响[Ivan Donati,AmedeoVetere,Galactose-Substituted Alginate:Preliminary Characterization and Study of Gelling Properties,Biomacromolecules,2003,4:624-631]。由于微胶囊稳定性及半乳糖基取代度的限制，无论是共混或共价修饰海藻酸，目前报道的方法中均无法在微胶囊内部引入较高浓度的半乳糖基团。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提出了一种新型半乳糖共价修饰的海藻酸盐/聚阳离子微胶囊产品，能够在保证微胶囊强度和免疫隔离性能的前提下，利用海藻酸 羟基基团共价接枝半乳糖基团衍生物来制备半乳糖基海藻酸盐/聚阳离子微胶囊，实现微胶囊内部含有半乳糖基团的同时又不影响微胶囊的稳定性，从而诱导和提高肝细胞在微胶囊内部的黏附和增殖行为。
技术方案
本发明的一种新型海藻酸盐/聚阳离子微胶囊，海藻酸盐羟基经含有氨基基团的半乳糖基衍生物修饰，微胶囊内为含有活细胞的经半乳糖接枝改性的海藻酸盐的液体或水凝胶环境。微胶囊表面可以通过聚阳离子和海藻酸盐形成聚电解质复合水凝胶膜，此类聚阳离子材料包括：壳聚糖，其脱乙酰度为80-98％，分子量为1kDa-800kDa；α-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa；ε-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa；聚精氨酸，分子量为1kDa-500kDa；聚鸟氨酸，分子量为1kDa-500kDa；聚组氨酸，分子量为1kDa-500kDa。微胶囊可浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部海藻酸盐凝胶，参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA溶液，微胶囊与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1～1:40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊。
本发明中，半乳糖基海藻酸盐/聚阳离子微胶囊粒径在100-1000微米；所用海藻酸盐分子量为10kDa-10000kDa，海藻酸盐接枝含氨基基团的半乳糖基衍生物的接枝率为1％-199％。氨基基团的半乳糖基衍生物中，以乳糖胺(monoamine terminated lactobionic lactone)为例，其反应过程如下：
其中，alginate代表海藻酸盐；M代表金属离子(例如：钠，钾)；CN-alginate代表经CNBr活化羟基后的海藻酸盐分子；L-NH2代表乳糖胺(monoamine terminated lactobionic lactone)分子；L-NH2-alginate代表半乳糖接枝改性后的海藻酸盐；X所代表的基团为：
含半乳糖基团的L-NH2由乳糖酸(LA)在二甲基亚砜溶剂(DMSO)中与乙二胺(NH2CH2CH2NH2)共热制备，反应式如下：
微胶囊中半乳糖基海藻酸盐凝胶为二价金属钙，钡或锌的半乳糖基海藻酸水凝胶，半乳糖基海藻酸盐溶液为半乳糖基海藻酸的钠盐或钾盐溶液。
上述的微胶囊可直接由半乳糖基海藻酸盐经螯合制备得到包埋型水凝胶微球载体，再与聚阳离子反应形成聚阳离子薄膜形成微胶囊，产品的具体制备步骤为：
1、半乳糖基海藻酸的合成
1)乳糖酸与乙二胺在二甲基亚砜溶液中共热制备L-NH2。
2)制备海藻酸溶液，将海藻酸溶于水中制备成1-10g/L的海藻酸溶液。其中，海藻酸分子量为10KDa-10000kDa。
3)过滤海藻酸溶液除去杂质，NaOH溶液调节海藻酸溶液pH至碱性。
4)称取一定质量的CNBr固体，用少量有机溶剂溶解，滴加于海藻酸溶液中并控制pH值不变。
5)清洗活化后的溶液，直至去除未反应的CNBr小分子。
6)在清洗后的溶液中加入一定质量的L-NH2，室温搅拌反应2天。
7)清洗反应后的溶液，直至去除未反应的L-NH2。
8)冷冻干燥清洗后的溶液，得到半乳糖基海藻酸。
2、半乳糖基海藻酸盐/聚阳离子微胶囊制备
1)称取半乳糖基海藻酸固体，溶于生理盐水中形成浓度为5-50g/L的溶液。
2)制备海藻酸盐包埋型水凝胶微球载体，通过锐孔挤出法、静电液滴法、乳化法、旋转盘法等制备成半乳糖基海藻酸盐水凝胶微球。
3)将步骤2)中的包埋型凝胶微球浸入聚阳离子溶液中，包埋型凝胶微球与聚阳离子溶液体积比为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到半乳糖基海藻酸盐/聚阳离子微胶囊。
聚阳离子溶液的配制方法是：
壳聚糖溶于pH为5.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.1-15g/L；
α-聚赖氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，α-聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L；
ε-聚赖氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，ε-聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L；
聚精氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚精氨酸浓度为0.01-10g/L；
聚鸟氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鸟氨酸浓度为0.01-10g/L；
聚组氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚组氨酸浓度为0.01-10g/L。
上述包埋型水凝胶微球载体可用于活细胞的包埋，细胞含量为105-2*107个/mL，活性保持80％以上。所述活细胞为人或动物来源的离体的肝细胞，干细胞，干细胞分化的具有肝细胞功能的细胞，肝细胞系细胞，转分化的具有肝细胞功能的细胞，内皮细胞，肝枯否氏细胞，肝星形细胞，成纤维细胞，骨髓间充质干细胞中一种或二种以上。
本发明的有益效果
1、与传统的海藻酸接枝改性相比，本发明方法的反应基团被限定在海藻酸羟基基团上，不会因羧基反应位点被占据而影响海藻酸的成胶性能。
2、与传统的半乳糖基海藻酸盐/聚阳离子微胶囊制备方法相比，该方法能够保证形成微胶囊机械强度不因海藻酸接枝改性受影响。
3、该方法制备的半乳糖基海藻酸盐/聚阳离子微胶囊，可以通过反应物投料比的变化调整微胶囊内部半乳糖基团的含量，较已经公开的在海藻酸盐羧基上接枝半乳糖的方法相比，在羟基上的接枝取代度最高可达199％，而不影响海藻酸盐凝胶微球性能。
4、本发明方法的接枝改性反应过程条件温和，有利于肝细胞的活性保持和功能提高。
5、本发明方法制备的微胶囊保持优良生物相容性，能保证作为组织细胞移植、细胞培养应用过程中微胶囊保持完整性。
6、本发明产品的微胶囊免疫隔离性能不受接枝改性的影响，用于异种组织细胞移植时，能保持免疫隔离性能，即微胶囊内包埋的细胞不能出微胶囊，微胶囊外的抗体分子、补体分子、免疫细胞不能进入微胶囊内杀死细胞，同时又保持了微胶囊本身应有的通透性，即细胞代谢分泌的活性成分、微胶囊外的营养小分子能自由进出微胶囊。
具体实施方式
制备半乳糖基海藻酸盐/聚阳离子微胶囊的方法为静电液滴法(参考文献：In Vivo Culture of Encapsulated Endostatin-Secreting Chinese Hamster Ovary Cells for Systemic Tumor Inhibition,Human Gene Therapy.2007,18:474-481)。
实施例1
1)制备海藻酸溶液：海藻酸溶于水中制备成1g/L的海藻酸溶液，体积为500mL。其中，海藻酸分子量为350kDa。
2)过滤1)溶液除杂质，用质量浓度240g/L NaOH溶液调节海藻酸溶液pH到10。
3)将0.06gCNBr固体用0.5mL乙腈溶解后滴加入步骤2)的海藻酸溶液中，并控制pH值不变。
4)清洗步骤3)制备的活化后溶液，直至去除未反应的CNBr小分子。
5)在清洗后的溶液中加入0.4g乳糖胺固体，室温搅拌反应2天。
6)清洗步骤5)反应后的溶液，直至去除未反应的乳糖胺分子。
7)将步骤6)清洗后的溶液冷冻干燥，得到半乳糖基海藻酸，接枝度30％。
8)将7)制得的半乳糖基海藻酸溶于生理盐水中制备成15g/L的半乳糖基海藻酸钠溶液。
9)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
10)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液。
11)制备半乳糖基海藻酸钙水凝胶微球：将步骤8)制备的半乳糖基海藻酸钠溶液在高压静电场下形成射流，液滴落入步骤10)配制的氯化钙凝胶浴溶液中，固化30分钟，即获得半乳糖基海藻酸钙水凝胶微球。
12)制备半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将该半乳糖基海藻酸钙水凝胶微球浸入步骤9)配制的α-聚赖氨酸溶液中，水凝胶微球与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，显微镜下观察，微囊粒径450μm，球形度好，膜厚度10微米。
13)将步骤12)制得的半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，按微胶囊：IgG＝1：20体积比放入FITC标记的IgG(γ-免疫球蛋白)溶液中，振荡孵育24小时，激光共聚焦显微镜下观察，微囊内没有荧光信号，表明微胶囊保持良好的免疫隔离性能。
14)将步骤12)制得的半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊与玛瑙球、生理盐水共同放置于三角瓶内，在37度，170r/min条件下震荡球磨24小时，微胶囊的完整率保持在95％以上，表明微胶囊具有良好的机械强度。
比较例1
1)制备海藻酸溶液：海藻酸溶于生理盐水中制备成15g/L的海藻酸钠溶液，其中，海藻酸分子量为350kDa。
2)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
3)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液。
4)制备海藻酸钙水凝胶微球：将步骤1)制备的海藻酸钠溶液在高压静电场下形成射流，液滴落入步骤3)配制的氯化钙凝胶浴溶液中，固化30分钟，即获得海藻酸钙水凝胶微球。
5)制备海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将该海藻酸钙水凝胶微球浸入步骤2)配制的α-聚赖氨酸溶液中，水凝胶微球与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，显微镜下观察，微囊粒径450μm，球形度好，膜厚度10微米。
6)将步骤5)制得的海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，按微胶囊：IgG＝1：20体积比放入FITC标记的IgG溶液中，振荡孵育24小时，激光共聚焦显微镜下观察，微囊内没有荧光信号，表明微胶囊具有良好的免疫隔离性能。
7)将步骤5)制得的海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊与玛瑙球、生理盐水共同放置于三角瓶内，在37度，170r/min条件下震荡球磨24小时，微胶囊的完整率保持在95％以上，表明微胶囊具有良好的机械强度。
比较例2
1)制备海藻酸溶液：海藻酸溶于水中制备成1g/L的海藻酸溶液，体积为500mL。其中，海藻酸分子量为350kDa。
2)过滤1)溶液除杂质，在溶液中加入TEMED(N＇，N＇，N＇-tetramethylethylenediamine)、氯化钠、EDC(1-ethyl-(dimethylaminopropyl)carbodiimide)、sulfo-NHS(N-hydroxy-sulfosuccinimide)，室温反应24h。
3)清洗步骤2)反应后的溶液。
4)将步骤3)清洗后的溶液冷冻干燥，得到羧基接枝半乳糖基海藻酸，接枝率30％。
5)将4)制得的羧基接枝半乳糖基海藻酸溶于生理盐水中制备成15g/L的羧基接枝半乳糖基海藻酸钠溶液。
6)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
7)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液。
8)制备羧基接枝半乳糖基海藻酸钙水凝胶微球：将步骤5)制备的羧基接枝半乳糖基海藻酸钠溶液在高压静电场下形成射流，液滴落入步骤7)配制的氯化钙凝胶浴溶液中，固化30分钟，即获得羧基接枝半乳糖基海藻酸钙水凝胶微球。
9)制备羧基接枝半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将该羧基接枝半乳糖基海藻酸钙水凝胶微球浸入α-聚赖氨酸溶液中，水凝胶微球与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成羧基接枝半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，显微镜下观察，微囊粒径450μm，球形度好，膜厚度10微米。
10)将步骤9)制得的羧基接枝半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，按1：20体积比放入FITC标记的IgG溶液中，振荡孵育24小时，激光共聚焦显微镜下观察，微囊内荧光信号达到微囊外荧光信号强度的10％，表明微胶囊的免疫隔离性能被破坏。
11)将步骤9)制得的羧基接枝半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊与玛瑙球、生理盐水共同放置于三角瓶内，在37度，170r/min条件下震荡球磨24小时，微胶囊的完整率低于80％，表明羧基接枝半乳糖基海藻酸微胶囊机械强度较弱。
实施例2
1)制备半乳糖基海藻酸钠溶液：半乳糖基海藻酸溶于生理盐水中制备成15g/L的半乳糖基海藻酸钠溶液，其中，半乳糖基海藻酸分子量为350kDa。
2)制备壳聚糖溶液：壳聚糖溶于pH为6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖 浓度为5g/L。其中，壳聚糖分子量30kDa，脱乙酰度90％。
3)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液。
4)制备半乳糖基海藻酸钙/壳聚糖微胶囊：高压静电法制备半乳糖基海藻酸钙包埋型水凝胶微球，将该包埋型水凝胶微球浸入壳聚糖溶液中，包埋型水凝胶微球与壳聚糖溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成半乳糖基海藻酸钙/壳聚糖微胶囊。
5)显微镜下观察包埋型水凝胶微球以及半乳糖基海藻酸钙/壳聚糖微胶囊，二者的球形度均良好，成膜反应10分钟，膜厚度大于10微米。
实施例3
1)制备半乳糖基海藻酸钠溶液：半乳糖基海藻酸溶于生理盐水中制备成15g/L的半乳糖基海藻酸钠溶液，无菌过滤。其中，半乳糖基海藻酸分子量为350kDa。
2)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液，无菌过滤。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
3)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液，过滤除菌。
4)制备包裹肝细胞的半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸包埋型水凝胶微球载体：取3mL半乳糖基海藻酸钠溶液，加入6*10^6个大鼠原代肝细胞，混合均匀后，使用静电液滴法制备包埋有原代大鼠肝细胞的半乳糖基海藻酸钙包埋型水凝胶微球。
5)制备包裹肝细胞的半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将包埋有原代大鼠肝细胞的半乳糖基海藻酸钙包埋型水凝胶微球浸入步骤2)制备的α-聚赖氨酸溶液中，包埋型水凝胶微球与α-聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成半乳糖基海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊。
6)对该微胶囊内的原代大鼠肝细胞进行培养和肝细胞功能表征，一周后，微胶囊保持完整形态，球形度良好；微胶囊内细胞活性保持初始活性的75％，肝细胞白蛋白分泌量为2.24±0.68μg/10^6个细胞，尿素合成量为388±11μg/10^6个细胞。
比较例3
1)制备海藻酸钠溶液：海藻酸溶于生理盐水中制备成15g/L的海藻酸钠溶液，无菌过滤。其中，海藻酸分子量为350kDa。
2)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液，无菌过滤。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
3)配制凝胶浴溶液，无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液，过滤除菌。
4)制备包裹肝细胞的海藻酸钙/α-聚赖氨酸包埋型水凝胶微球载体：取3mL海藻酸钠溶液，加入6*10^6个大鼠原代肝细胞，混合均匀后，使用静电液滴法制备包埋有原代大鼠肝细胞的海藻酸钙包埋型水凝胶微球。
5)制备包裹肝细胞的海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将包埋有原代大鼠肝细胞的海藻酸钙包埋型水凝胶微球浸入步骤2)制备的α-聚赖氨酸溶液中，包埋型水凝胶微球与α-聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊。
6)对该微胶囊内的原代大鼠肝细胞进行培养和肝细胞功能表征，一周后，微胶囊保持完整形态，球形度良好；微胶囊内细胞活性保持初始活性的44％，肝细胞白蛋白分泌量为0.46±0.05μg/10^6个细胞，尿素合成量为231±29μg/10^6个细胞。