miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用。

背景技术：

MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的单链小RNA，其长度约为20～25nt，在物种进化中非常保守，它们在特定发育阶段或特定组织中表达。miR-34c是mir-34家族的一员，miR-34家族有3个成员(miR-34a，miR-34b，miR-34c)。其中，miR-34a由一个单独的初级转录产物转录生成，而miR-34b和miR-34c共用一个初级转录产物。在人类基因组中，miR-34a位于1号染色体上，miR-34b和miR-34c位于11号染色体上。60％以上的人类编码蛋白的基因都有miRNA的保守靶位点，因此，miRNA有多种多样的生物学功能，包括信号转导、组织分化、机体的发育等。

骨骼肌由中胚层的间充质干细胞发育而来，是胚胎发育过程中最早形成的组织之一。骨骼肌的发育受到一系列调控因子的精确调控，其中肌肉生成调控因子(MRFs)发挥了核心作用，此外，Wnt、Notch、TGF-β等信号通路也起到了主要的作用。除了上述调控因子外，miRNA在骨骼肌的损伤修复、卫星细胞的增殖与分化、成肌细胞的增殖与分化等骨骼肌的发育进程中发挥了重要的作用。

自1993年发现第一个miRNA后，随后20年中已有10000多个miRNA被陆续发现。它们在细胞增殖、分化、凋亡等生物学进程中发挥了关键的作用。MiRNA调控的多样性，使它们与很多人类疾病相关。因此了解miRNA在肌肉发育过程的作用，对预防和治疗骨骼肌相关的疾病具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种新的促骨骼肌分化因子—miR-34c。

本发明还提供miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用，其是利用脂质体(例如脂质体2000)在成肌细胞中瞬时转染miR-34c mimics，待细胞汇合度达到85％-95％(优选90％)时，将细胞用分化培养基培养，诱导细胞分化。

本发明中涉及的miR-34c mimics是指miR-34c拟似物，购自上海吉玛制药技术有限公司。所述miR-34c mimics的序列为：

正义链：5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’(SEQ ID No.1)

反义链：5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’(SEQ ID No.2)

本发明中涉及的成肌细胞为小鼠成肌细胞C2C12。

所述分化培养基培养为含有2％马血清和1％青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基。

用分化培养基培养的条件为：37℃，5％CO₂。

在细胞分化第3天时，提取蛋白质，用Western blot技术检测肌球蛋白重链(MYHC)的表达，发现转染miR-34c mimics的细胞MYHC的表达量高于转染Negative Control(NC)mimics(SEQ ID No.3和4)的细胞；另外，在细胞分化第3天时，取细胞样品，进行细胞免疫荧光染色，发现转染miR-34c mimics的细胞中MYHC阳性细胞数多于转染NC mimics的细胞。以上结果说明过表达miR-34c能促进C2C12细胞的分化。

本发明还提供含有miR-34c mimics的转基因细胞系、工程菌。

本发明首次发现一种新的促骨骼肌细胞分化因子—miR-34c，通过Western blot和免疫荧光染色技术检测miR-34c对成肌细胞(C2C12 细胞)分化的影响，从而确定miR-34c在骨骼肌发育中的作用，对预防和治疗骨骼肌相关疾病具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中Western blot检测miR-34c对C2C12细胞分化的影响。

图2为本发明实施例1中免疫荧光检测miR-34c对C2C12细胞分化的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中涉及的miR-34c mimics的序列为：

正义链：5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’

反义链：5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’

NC mimics的序列为：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’

实施例1 miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用

待C2C12细胞的汇合度为60％-70％时，利用脂质体2000(11668-019，Invitrogen)在C2C12细胞中瞬时转染miR-34c mimics，待细胞汇合度达到90％时，将细胞用分化培养基培养，诱导细胞分化。

所述分化培养基为含有2％马血清和1％青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基。

用分化培养基培养的条件为：37℃，5％CO₂。

1、Western blot检测miR-34c对C2C12分化的影响

蛋白样品收集：将转染miR-34c mimics或NC mimics并分化3天的C2C12细胞倒掉培养基后，用PBS洗3遍细胞，弃去PBS，加 入含有1％PMSF的IP裂解液，冰上放置5min，用细胞刮刀将样品刮至1.5ml EP管中，12000g，4℃，离心5min，取上清，按照BCA蛋白定量试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)说明书对提取的蛋白进行定量。

Western blot检测：

1)将蛋白样品与5×蛋白上样缓冲液混合，于99℃变性10min，每个样品上样50ug。

2)电泳：浓缩胶时电压恒定在60V左右，电泳45min。当进入分离胶时，电压恒定在100V左右电泳1-2h，直到25KD marker跑至凝胶底部时，停止电泳；

3)转膜：350mA恒流，4℃转膜，蛋白MYHC(肌球蛋白重链)转1小时40分钟，蛋白GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，内参蛋白)转膜1小时。

4)封闭：将膜放入5％脱脂奶粉中，室温封闭1小时。

5)一抗：GAPDH(1：10000，购自CST公司，货号2118L)；MYHC(1：3000,购自Sigma公司，货号M4276)，4℃，过夜。

6)洗一抗：TBST在摇床上洗3次，每次10分钟。

7)二抗：山羊抗小鼠(货号ZB-2305)和(货号ZB-2301)山羊抗兔，1:10000(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温1小时。

8)洗二抗：TBST在摇床上洗3次，每次10分钟。

9)显影：将曝光过的胶片马上放入显影液中，显影时间根据观察而定。

10)停影：将显影过的胶片放入水中停影。

11)定影：停影后的胶片放入定影液中定影至少5min。

图1结果显示，转染miR-34c mimics的细胞MYHC的表达量明显高于转染NC mimics的细胞。

2、细胞免疫荧光检测miR-34c对C2C12分化的影响

1)细胞固定：将转染miR-34c mimics或NC mimics并分化3天的C2C12细胞倒掉培养基后，用PBS洗3遍细胞，弃去PBS，加入 4％多聚甲醛，室温固定30分钟。

2)细胞通透：倒掉固定液，PBS洗3遍，加入0.1％TritonX-100，室温10分钟。

3)细胞封闭：倒掉通透液，PBS洗3遍，加入免疫荧光封闭液(购自碧云天生物技术研究所)，室温封闭1小时。

4)一抗：倒掉封闭液，加入MYHC一抗(1:500，Sigma公司)，4℃过夜。

5)洗一抗：PBS洗3次，每次10分钟。

6)二抗：Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594(1:400，A-11034，购自Life公司)，室温1小时，避光。

7)染DAPI：倒掉二抗，PBS洗一次，加入浓度为1μg/ml的DAPI，室温避光染核5分钟。

8)洗DAPI：PBS洗3次，每次10分钟。

9)封片：加少量抗荧光淬灭机，放上盖玻片，封片，镜检。

图2结果显示，转染miR-34c mimics的细胞中MYHC阳性细胞数多于转染NC mimics的细胞。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。