一种新型的黑曲霉菌株及应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域。具体而言，涉及到一种同时产淀粉酶与糖化酶的新型黑曲霉菌株QY-002，所得发酵液具有淀粉酶与糖化酶双酶活性，在淀粉制糖领域具有重要用途。

背景技术：

我国是农业大国，粮食种植面积广，产量大，淀粉含量也很高，但价格低廉。为提高粮食的经济附加值，达到经济效益的最大化，多数需要进行精深加工。其中，淀粉制糖是粮食深加工的主要途径之一。

淀粉糖是蔗糖的最佳替代品，主要包括麦芽糖、葡萄糖、果糖等，广泛应用于食品、生物医药、化工和发酵行业等领域。目前，我国淀粉糖产量居世界第二（仅次美国），2013年产量超过1225万吨，市场份额占制糖业的三分之一。淀粉糖的生产工艺常用双酶法，即通过淀粉酶和糖化酶分别进行淀粉的液化与糖化。但由于这两种酶作用的最适pH值和最适温度都不同，故而生产操作时须分步进行，同时调节温度和调节pH值以满足两种酶的最优作用条件。而且在某些粮食如玉米淀粉制备结晶葡萄糖生产中，一般液化时间需要2～3小时，糖化时间则需要 70～80 小时，导致生产周期较长，操作过程繁琐，生产工艺复杂，耗能较大，严重制约了由淀粉制糖的生产能力。

为了解决淀粉制糖生产的这一瓶颈问题，近年来国内外有关的淀粉制糖的研究工作主要集中在进一步筛选淀粉酶或糖化酶分泌量高的新菌株、筛选耐热糖化酶生产菌株、对已有菌种的诱变或用基因工程的方法进行淀粉酶或糖化酶基因的表达等，但都收效甚微。此外，最近也有试图将淀粉酶基因和糖化酶基因放在同一个宿主菌中进行同时表达的研究报道，但也未能成功地用于生产实践。在我们国内，目前淀粉制糖生产的主要企业，如西王糖业、鲁洲生物科技和保龄宝生物股份等大型玉米深加工企业，其淀粉糖产量约占国内产量的80%，也都使用双酶法生产。国内外目前未见使用一步法进行淀粉糖制备的报道。

黑曲霉（Aspergillus niger）属半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属黑曲霉。黑曲霉是广泛存在于自然界中的一种腐生真菌，也是重要的工业发酵菌种之一，在工业酶制剂、柠檬酸发酵方面有着广泛的应用。本专利涉及的新型黑曲霉（Aspergillus niger）QY-002，是我们首次筛选发现的能分泌同时具有淀粉酶和糖化酶双活性的酶蛋白的特殊黑曲霉菌。利用黑曲霉QY-002发酵所得淀粉酶与糖化酶发酵液水解淀粉制糖，仅需一步添加，在同一温度和同一pH值条件下即可完成淀粉糖化过程，且酶活性高，糖化时间缩短为10～20小时。大大简化了淀粉制糖工艺，缩短了反应时间与生产周期，提高了产品品质，减少了人力、物力、能耗。该菌种应用于淀粉制糖工业将会引起淀粉糖化工艺的里程碑性变革，具有较强的产业化优势和广阔的市场发展前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种同时产淀粉酶与糖化酶的新型黑曲霉菌株，发酵所得组合酶液具有双酶活性，能应用于淀粉制糖工艺，能在同一反应条件下相互协同作用，高效率地催化底物淀粉完全水解为葡萄糖，具有良好的工业应用前景。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术措施：

本发明所提供的菌株为新型黑曲霉(Aspergillus niger) QY-002，筛选于海拔1500～2000米的山间腐殖质土壤中，经初筛培养基初筛、产酶培养基复筛、遗传稳定实验后，得到了一种高产淀粉酶与糖化酶的菌株，经过形态学和分子生物学两种方法鉴定为黑曲霉。已于2015年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC No.10650。

该黑曲霉菌株QY-002的形态特征：

在特制麦芽汁培养基上蔓延迅速，24小时出现菌落，初为白色，后变成黄绿色直至黑色，呈丝绒状，中心略凸起，菌落反面略带黄白色（详见附图1）。72小时后，孢子丰富，在显微镜下孢子整体形状似扫把，分生孢子梗长短不一，分生孢子为圆球形呈黑色。（详见附图2及附图3）该菌株产孢子能力强，具有很好的工业化生产性能。

本发明黑曲霉（Aspergillus niger）菌株QY-002 的培养方法或繁殖方法：

1) 麦芽汁斜面培养基：大麦芽粉碎后称取100～400g加600～900ml水经两次糖化得到波美度在7～12的麦芽汁，然后加入2%的琼脂，灭菌备用。

2) 种子复壮培养基：每1L培养基（pH=5.5～5.8）：硝酸钠1.0～9.5g、磷酸二氢钾0.5～5.0g、七水硫酸镁0.2～5.0g、氯化钾0.2～5.0g、七水硫酸亚铁0.0001～1.0g、普通玉米淀粉10～70g、大麦芽5～35g。

3) 液体产酶培养基：每1L培养基（pH=5.5～5.8）：硝酸钠1.0～9.5g、磷酸二氢钾0.5～5.0g、七水硫酸镁0.2～5.0g、氯化钾0.2～5.0g、七水硫酸亚铁0.0001～1.0g、普通玉米淀粉10～70g、大麦芽5～35g。

本发明提供了黑曲霉QY-002发酵所得组合酶液中淀粉酶、糖化酶两种酶的酶学性质与活性参数，包括：最适作用温度为68℃，最适pH为4.5，在4～80℃时酶的热稳定较好，pH值在4.0～7.0之间酶的稳定性较好，Mg^­2+和Ca^{­­­­­­2+}对该酶有促进作用，Cu^­2+、Mn^­2+有抑制作用。具有双酶活性的发酵液在温度60～70℃，pH值4.5～5.5条件下，可以将30%的淀粉转化为葡萄糖，转化率高达98%以上。

本发明还提供了黑曲霉QY-002发酵所得组合酶液中淀粉酶、糖化酶酶活性的定义及测定方法。

1) 淀粉酶活性单位定义：1ml酶液在40℃条件下，1min消耗1μg淀粉定义为一个酶活单位u。

2) 糖化酶活性单位定义：1ml酶液在40℃条件下1min水解淀粉生成1μmol葡萄糖定义为一个酶活单位u。

与现有技术相比，本发明黑曲霉QY-002菌株有以下优点：

1) 黑曲霉QY-002菌株独特。

2)黑曲霉菌株QY-002生长速度快，产孢子能力强，具有很好的工业化生产性能。

3)黑曲霉QY-002分泌的酶能同时具有淀粉酶与糖化酶双酶活性且两种酶互相配合能让淀粉转化为葡萄糖更加高效。

4) 该黑曲霉菌株QY-002生产的双活性淀粉酶组合物能够变淀粉糖化工业上的双步添加法为单步法，大大简化原有的淀粉制糖工艺。

附图说明

图1 黑曲霉QY-002在麦芽汁培养基上的菌落形态。

图2 黑曲霉QY-002在100倍显微镜下的形态示意图。

图3 黑曲霉QY-002在400倍显微镜下的形态示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更加清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围以内。

实施例1新型黑曲霉菌株QY-002的筛选和分离。

本发明中所述的新型黑曲霉菌株QY-002是来自海拔1500-2000米的山间腐殖质土壤中，经过初筛培养基初筛和产酶培养基复筛，从中获得一株生长性能优良的菌种，能够利用淀粉，同时产生淀粉酶和糖化酶，且两种酶酶活性高，保存至麦芽汁斜面培养基上。

麦芽汁斜面培养基制备方法：大麦芽粉碎后称取300g加700ml水，经两次糖化得到波美度在7-12的麦芽汁，然后加入2%的琼脂，灭菌备用。

实施例2新型黑曲霉QY-002的菌株鉴定。

1)微生物学特性：在特制麦芽汁培养基上蔓延迅速，24小时出现菌落，初为白色，后变成黄绿色直至黑色，呈丝绒状，中心略凸起，菌落反面略带黄白色。72小时后，孢子丰富，分生孢子整体形状似扫把，分生孢子梗长短不一，分生孢子为圆球形呈黑色。

2)分子生物学特性：该菌株经18S rRNA序列鉴定为黑曲霉菌株（Aspergillus niger），序列表如SEQ ID NO.1所示。

实施例3新型黑曲霉QY-002的复壮及液体发酵制备淀粉酶和糖化酶酶液。

1)复壮：将菌株接种于麦芽汁斜面培养基28～34℃培养7天。

麦芽汁培养基制备方法：大麦芽粉碎后称取400g加600ml水，经两次糖化得到波美度在7～12的麦芽汁，然后加入2%的琼脂，灭菌备用。

2)液体培养：麦芽汁斜面接种至摇瓶液体培养基中。

培养条件：温度28～32℃，转速160～200rpm，培养时间68～78小时。四层纱布过滤，取滤液备用。滤液中淀粉酶活性可以达到1.8 u/ml、糖化酶活性可达40 u/ml。

培养基配方：每1L培养基（pH=5.5～5.8）：硝酸钠7.28g、磷酸二氢钾0.8g、七水硫酸镁0.4g、氯化钾0.4g、七水硫酸亚铁0.0015g、普通玉米淀粉48g、大麦芽20g。

实施例4淀粉酶与糖化酶活力的测定。

本发明所述的新型黑曲霉QY-002能够同时产淀粉酶及糖化酶，由于这两种酶的生物学特性不同于普通的淀粉酶与糖化酶的特性，所以在此提供了专一对应双酶活性的酶活定义及其测定方法。

淀粉酶活性测定方法。

1)淀粉酶活性单位定义：1ml酶液在40℃条件下，1min消耗1μg淀粉定义为一个酶活单位u。

2)测定试剂的配制：

1%的淀粉溶液：称取1g的可溶性淀粉溶于0.05M的醋酸缓冲溶液中。

原碘液：称取0.5g碘和5g碘化钾溶于水中，加水定容到200ml。

显色液：量取2ml原碘液于100ml 0.1M的稀盐酸溶液中，混匀。

3)测定步骤：

准确量取1%的淀粉溶液10ml于试管中，加4ml蒸馏水混匀，置于40℃水浴锅中预热5min， 加入1ml待测酶液（空白对照用灭活的酶液），计时、反应10min结束。吸取0.2ml反应液加入10ml显色液中显色，于650nm可见光分光光度计比色，记录吸光度。

4)酶活性（A）计算公式：

A=

C=

其中：D1—空白样的吸光度

D2—加入待测酶液反应后测得的吸光度

n—加酶体积（ml）。

糖化酶活性测定方法。

1)糖化酶活性单位定义：1ml酶液在40℃条件下1min水解淀粉生成1μmol葡萄糖定义为一个酶活单位u。

2)测定方法：

将上述测定淀粉酶活性中反应10min结束的反应液置于100℃沸水浴中灭活3-5min，终止反应。反应液降温至室温后，用生物传感分析仪检测反应液中葡萄糖的含量，根据葡萄糖含量的测定值a来计算糖化酶活性。

3)酶活性（A）计算公式：

A=

其中：a—葡萄糖含量（mg/ml）

b—稀释倍数

n—加酶体积（ml）

t—反应时间（min）。

实施例5：新型黑曲霉QY-002液体发酵所得组合酶制剂在淀粉制糖上的应用。

本发明所述黑曲霉QY-002能够同时高产淀粉酶及糖化酶，由于两种酶来源相同，因而可以在同一反应条件下，协同作用，能完全、高效地水解淀粉为葡萄糖。

本发明利用黑曲霉QY-002发酵所得具有双酶活性的酶液，对95℃糊化5分钟的30%的玉米淀粉溶液进行水解实验。按照1g淀粉2～5u的加酶量（以淀粉酶酶活计），以pH 4.0～4.8的醋酸缓冲液预调淀粉溶液的pH值，置于60～70℃水浴摇床中水解淀粉，在8～12小时就达到水解终点，淀粉水解为葡萄糖的转化率可达至99%以上，无需将液化与糖化过程分开，也无需更换温度及pH值。该应用简化了淀粉制糖的工艺，节约了能源和成本，提高了生产效率，具有较强的产业化优势和广阔的市场发展前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 烟台启元微生物技术研究院有限公司

<120> 一种新型的黑曲霉菌株及应用

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