江西虫草菌CordycepsjiangxiensisJXPJ0109菌株及其应用的制作方法

本发明涉及制药领域，特别是一种江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis JXPJ0109菌株及其应用。

背景技术：

虫草菌是一类特殊类型真菌资源。在长期的进化过程中，为克服入侵时寄主的天然屏障，以及逃避侵入后寄主的免疫监控，达成与寄主的生活史同步化，最终完成自身细胞增殖、分化和整个生活史。在这个过程，生成了与细胞信号传导、应激保护相关的，具有化学结构多样、生物功能多样和作用多靶点等特点的活性次生代谢产物，展示出巨大创制新药的潜力。现有的研究结果提示，在虫草菌中已发现丰富多样的抗肿瘤活性次生代谢产物(Recent Patents on Biotechnology,1(2):123-137,2007；Advance in Biochemical Engineering&Biotechnology,113:79-150,2009)。

江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis为虫草菌一个新种，在民间俗称“草木王”，是治疗毒蛇咬伤的良药(Mycosystema,20:306-309,2003)。我们在虫草菌抗肿瘤药物筛选过程，从江西虫草菌发酵菌丝体中筛选到一种新骨架化合物，命名为jiangxienone(江西烯酮脂)。该化合物对人源性肺癌、胃癌、白血病、肝癌、结肠癌等不同来源的肿瘤细胞株呈不同程度的细胞毒效应，尤其是对胃癌细胞株显著的细胞毒作用，是临床一线抗癌药物顺铂的6倍，但对人源性正常细胞和小鼠骨髓基质细胞克隆无影响(ZL 201010159145.8；Chemistry&Biodiversity,9(7):1349-1355,2012；Process Biochemistry,49(4):697-705,2014)。进一步研究结果提示，其抑制肿瘤细胞生长的作用机制涉及DNA损伤响应途径，jiangxienone可嵌入肿瘤细胞DNA分子并引起其双链断裂，从而发挥抗肿瘤生长的细胞毒效应(Process Biochemistry,49(4):697-705,2014)。因此，jiangxienone具有成为抗肿瘤新药先导化合物的潜力，亟待进一步对其展开成药性及临床前的研究。而这些研发工作的开展亟需大量的jiangxienone样品。正常条件下，真菌等微生物代谢合成的次生代谢产物产量甚微，jiangxienone在江西虫草中的含量仅为1.0μg/g干菌丝体，使得对其后续药理、药学方面的研究工作难以为继。因此，亟需提高江西虫草菌代谢合成jiangxienone产量，为后续研发提供物质保障。

自上世纪40年代，采用液体深层发酵让产黄青霉生产青霉素以来，真菌液体深层发酵技术日臻成熟。但具体到生产菌株，影响其代谢合成目标产物的因素及其复杂。通常可归为两大类，一是通过发酵策略来提升目标产物的产量；二是基于目标产物的生源途径，采用分子工程手段改造菌株，提高产量。改变发酵策略是最常见，也是最有效的方法，其涉及面广，从菌种目标产物发酵生产所要求的培养基成分(碳源、氮源、无机盐、生长因子)、前体物、消泡剂、温度、酸碱度、溶氧、接种量等环境因子到发酵物理参数调控，包括剪切力(搅拌转速)、补料培养(碳源、氮源或前体)、两阶段培养等。

细胞代谢活动过程异常复杂，这个过程也是成百上千种酶在内外源信号干预下稳定有序进行调节反应。金属离子在这个过程中常扮演重要角色，是酶的辅基或激活剂。有些金属离子是酶蛋白活性中心的重要组成部分或必要构件；有些酶需要金属离子激活；有些过渡态金属通过自身化合价的变化传递电子，参与体内的氧化还原过程。因此，在真菌发酵过程中添加金属离子有可能影响细胞的代谢状态，进而有利于目标产物代谢合成。已有文献报道，通过添加某些金属离子或金属盐，对真菌次生代谢产物的合成途径进行调节，从而使其发酵产量提高。譬如，Jia等添加镁离子提高了抗癌药物安丝菌素P-3的产量(Bioresource Technology,102(21):10147-10150,2011)；Xu等研究发现，钙离子和钠离子能有效提高灵芝菌代谢合成灵芝酸(Biotechnology Advances,30(6):1301-1308,2011；Biotechnology and Bioengineering 110(7):1913-1923,2013)。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis JXPJ0109菌株及其应用，它够有效提高江西虫草菌发酵代谢合成jiangxienone效率。

本发明是这样实现的：江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis JXPJ0109菌株，其保藏编号为CGMCC NO.9720。

菌株的生物学形态特征：该菌在察氏培养基(Sabouraud Dextrose Agar)(葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，初始pH为7)上生长缓慢，25℃下培养7天，菌落白色，呈不规则突起或皱纹，质地絮状，直径10mm左右，未见分生孢子结构。菌落底部反面呈红黄色，无可溶性色素。菌落形态见附图1。

采用江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis JXPJ0109菌株高效代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone的方法，包括如下步骤：

1)将江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis JXPJ0109菌株接种于斜面，在24-28℃下培养7-15天，在4℃下保存备用；斜面种子培养基的组成按质量百分比计算，包括葡萄糖1-4％、麦麸0.1-1％、蛋白胨0.1-1％、酵母粉0.1-1％、磷酸二氢钾0.05-0.15％、七水硫酸镁0.01-0.05％及琼脂1.8％，总量满足100％，初始pH为7；

2)用接种针挑取0.5-1cm²斜面菌种块接种于摇瓶中，在温度为24-28℃，转速为120-200rpm的条件下，摇床培养4-7天；摇床中的液体种子培养基的装液量体积百分比为30-60％，液体种子培养基的组成按质量百分比计算：包括葡萄糖1-4％、蛋白胨0.1-1％、酵母粉0.1-1％、七水硫酸镁0.01-0.05％及磷酸二氢钾0.05-0.15％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，总量满足100％，初始pH为7；

3)另取一个新的摇瓶，在新的摇瓶中加入发酵培养基，装液量体积百分比为40-70％，再将步骤2)中培养获得的种子培养液，按体积百分比为3-5％的接种量接种于发酵培养基中，在转速为120-200rpm，温度为25-30℃的条件下，避光培养7-21天，获得成品；培养过程中添加经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的亚铁离子(培养 的整个过程都可以添加亚铁离子，但添加时间不同其促进jiangxienone产量增加的效果不同，实验证明发酵第8天添加亚铁离子促进jiangxienone产量增加的效果最为明显，优于配制培养基时添加)，添加后亚铁离子的浓度为0.1-100mM；发酵培养基的组成按质量百分比计算，包括蔗糖1-4％、硝酸钠0.1-0.5％、磷酸氢二钾0.05-0.15％，七水硫酸镁0.01-0.05％，氯化钾0.01-0.05％，初始pH为7。

为了验证本发明的技术效果进行如下实验：

一、菌丝体干重、发酵样品处理及jiangxienone含量分析方法：

菌丝体干重：发酵15天结束后，将整瓶细胞培养液小心倒入事先已称重的滤纸上，过滤得到菌丝体，用足量的去离子水清洗至少3遍，然后置于45℃烘箱，烘干至恒重，称重并计算菌丝体干重(DW/Biomass)；取样时，同一培养条件下每次各取三个平行样，最终结果以“平均值±标准偏差”表示。

发酵样品处理方法：取发酵15天后的新鲜菌丝体细胞，用布氏漏斗抽去大量水分，置于45℃烘箱内烘干，约24h后达恒重。烘干的菌丝体细胞用研钵磨碎，之后过60目筛，用塑料袋分装密封，4℃保藏备用。精密称取发酵所得江西虫草菌丝体干粉0.2g(准确至1mg)，置于10mL离心管中，加入水饱和正丁醇混匀，超声提取60min，控制水温不高于45℃，超声提取2次，提取完成后将上清置于45℃真空干燥箱烘干，然后将干燥后的残渣用色谱级甲醇溶解，经0.22μm有机微孔滤膜过滤，并用乙腈：水(1:1,v/v)稀释，用于高效液相色谱定量分析jiangxienone含量。

jiangxienone标准曲线制作：精密称取5mg jiangxienone粉末，定量溶解于10mL甲醇中，得到0.5mg/mL的jiangxienone标准溶液，然后以此标准溶液为母液，进一步稀释为6.25，12.5，25，50，100，200g/mL等系列浓度。按照上述jiangxienone的分析方法记录各标准溶液的峰面积。以jiangxienone浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准直线方程和R²。标准曲线见附图2。

jiangxienone含量分析：jiangxienone的含量采用高效液相色谱(HPLC)仪进行分析。HPLC系统使用Agilent 1200型高效液相色谱分析仪，配备一个光二极管阵列(DAD)检测器以及chemoffice色谱工作站，同时还配有一个四元泵，在线脱气机和手动进样阀；色谱柱采用Shim pack PREP-ODS(Ⅱ)ODS25μm RP18(4.6×250mm,粒径5μm)。分析条件为：流速1.0mL/min；柱温40℃；紫外检测波长219nm；流动相为水和甲醇的梯度溶液，具体梯度见附表1。

表1为高效液相梯度洗脱程序

二、不同金属离子添加对江西虫草菌生长和jiangxienone产量的影响：

为了筛选出最佳的金属离子诱导剂，江西虫草菌液体深层发酵起始，分别添加六种常用的金属离子：钠离子(氯化钠)、钙离子(氯化钙)、亚铁离子(硫酸亚铁)、锰离子(氯化锰)、锌离子(氯化锌)、镁离子(氯化镁)，并考察其对江西虫草菌生长及jiangxienone代谢合成的影响。初始发酵培养基121℃灭菌20min冷却后，将金属离子经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后加入待用。各金属离子添加浓度为：钠离子、钙离子、锰离子和镁离子分别添加1mM、10mM、100mM；锌离子添加1mM和10mM；亚铁离子添加1.6mM和4.8mM。发酵培养方法如实施例，避光培养15天后测定发酵样品的菌丝体干重及jiangxienone的产量。同一培养条件下每次各取三个平行样，最终结果以“平均值±标准偏差”表示。

结果如附图3(A)和3(B)所示，4.8mM亚铁离子提高jiangxienone产量最为明显，其值为221.26±6.79μg/g；与此同时，菌丝体干重几乎不变。100mM镁离子对江西虫草菌菌丝细胞的生长有一定的促进作用，但是明显降低了jiangxienone的产量。其他金属离子对江西虫草菌生长影响不明显，但对jiangxienone产量的提高都 显著低于4.8mM亚铁离子组。

上述实验说明，添加的六种金属离子中，亚铁离子能够显著促进jiangxienone的代谢合成，提高其产量，且不影响江西虫草菌的生长。三、亚铁离子添加时间对jiangxienone产量的影响：

考察4.8mM(终浓度)亚铁离子不同时间点添加对jiangxienone产量的影响。亚铁离子经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后加入发酵培养基，添加时间点分别是第0天(发酵起始)、5天(指数期)和8天(指数期后期)；另外，第0天加入等体积无菌水作为对照。发酵培养方法如实施例1，避光培养15天后测定发酵样品jiangxienone的产量。同一培养条件下每次各取三个平行样，最终结果以“平均值±标准偏差”表示。

结果如附图4所示，第8天(指数期后期)添加亚铁离子促进jiangxienone代谢合成的效果最好，与对照组相比其产量增加了近2.9倍，且差异显著。第0天和第5天添加亚铁离子对jiangxienone代谢合成也有促进作用，其产量与对照相比提高了约1.78～2.48倍。以上实施例说明，三个时间点添加亚铁离子均可促进jiangxienone的代谢合成，第8天添加促进效果最为明显，其产量最高。

四、亚铁离子添加浓度对jiangxienone产量的影响：

亚铁离子经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后于发酵第8天加入，添加浓度分别是3.2mM、4.0mM、4.8mM、5.6mM和6.4mM，并加入等体积无菌水作为对照。发酵培养方法如实施例1，避光培养15天后测定发酵样品jiangxienone的产量。同一培养条件下每次各取三个平行样，最终结果以“平均值±标准偏差”表示。

结果如附图5所示，除8.0mM添加组，其余亚铁离子添加组均提高了jiangxienone的产量，其中作用效果最显著的为4.8mM添加组，其jiangxienone产量达到了376.92±15.33g/L，与对照组相比提高了约2.4倍；而1.6mM和3.2mM添加组与对照组相比分别提高了2.23和1.83倍。以上实施例说明，亚铁离子的最佳添加浓度为4.8mM。通过以上实施例可确定江西虫草菌液体深层发酵生产 jiangxienone过程中，亚铁离子的最优添加条件：添加时间为发酵培养第8天，添加浓度为4.8mM。该条件下jiangxienone的产量为376.92±15.33μg/L，与对照组相比提高了约2.4倍。

本发明的江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis JXPJ0109菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编:100101)，其保藏编号是CGMCC NO.9720，保藏日期为2014年10月14日，分类命名为江西虫草，拉丁文学名为Cordyceps jiangxiensis。

本发明发现江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis JXPJ0109菌株对合成抗肿瘤化合物jiangxienone具有良好效果，并通过添加亚铁离子来调控该虫草菌高效发酵代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone，这样的方式能够有效提高该江西虫草菌发酵代谢合成jiangxienone的效率，产量由1.0μg/g干菌丝体提高到221.26±6.79g/g干菌丝体，极大提高了其产量。且该方法简单，易于操作，极其适合虫草菌液体深层发酵生产jiangxienone，对规模化生产jiangxienone及其成药性研究，都具有重要的理论意义和应用价值。本发明具有材料来源广泛，成本低廉，效果理想等优点。

附图说明

附图1为江西虫草菌在沙氏培养基上的菌落形态

附图2为jiangxienone纯品的标准曲线；

附图3为不同金属离子添加对江西虫草菌生长和jiangxienone产量的影响；

A：不同金属离子对江西虫草菌生长的影响；B：不同金属离子对jiangxienone产量的影响；*P<0.05,**P<0.01vs对照组；

附图4为为亚铁离子添加时间对jiangxienone产量的影响；

*P<0.05vs对照组；

附图5为为亚铁离子添加浓度对jiangxienone产量的影响；

*P<0.05vs对照组。

具体实施方式

本发明的实施例：促虫草菌高效代谢合成抗肿瘤化合物jiangxienone的方法，包括如下步骤：

1)取江西虫草菌，菌种为江西虫草菌Cordyceps jiangxiensis JXPJ0109菌株，其保藏编号为CGMCC No.9720，菌种长期保藏用20％甘油管(菌体培养液：甘油＝8.0/2.0v/v)，置于-74℃冰箱中低温保藏；斜面种子培养基的制备：葡萄糖30g、蛋白胨5g、酵母粉5g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、麦麸5g及琼脂18g，定容至1L，初始pH 7.0；麦麸处理：将5g麦麸，加入去离子水0.5L，用电饭锅煮沸30min，用八层纱布过滤，取滤液；

将江西虫草菌接种于斜面，在25℃下培养7天，置于4℃的冰箱中保存备用；

2)液体种子培养基的制备：葡萄糖30g，蛋白胨5g，酵母粉5g，七水硫酸镁0.5g及磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，定容至1L(灭菌前调pH 7)：在250ml的摇瓶中加入100mL新配制的液体种子培养基，用接种针挑取1cm²斜面菌种块接种于摇瓶中，在温度为25℃，转速为150rpm的条件下，摇床培养5天；

3)；发酵培养基的制备：蔗糖30g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.5g及氯化钾0.5g，定容至1L(灭菌前调pH 7)；另取一个250ml的新摇瓶，在新的摇瓶中加入96ml发酵培养基，再将步骤2)中培养获得的种子培养液，接种4ml于发酵培养基中，在转速为160rpm，温度为25℃的条件下，避光培养15天，在培养至第8天时添加经0.22μm无菌滤膜过滤除菌的亚铁离子，添加后亚铁离子的加浓度为10mM。

上述所有培养基于121℃下灭菌20min备用。