本发明涉及从单克隆抗体中分离制备N-连接糖肽组分的提取分离制备，具体的说是从单克隆抗体中酶解分离制备得到有9个氨基酸肽段的N-连接糖肽组分，该组分中的聚糖为5－15个甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖或唾液酸组成，分子量在2000－4000。
背景技术：
蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，在真核生物，尤其是哺乳动物中约有一半以上的蛋白质是被糖基化的，膜蛋白则几乎100％是以糖基化的形式而存在(Apweiler R,Hermjakob H,Sharon N,On the frequency of protein glycosylation,as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.Biochim Biophys Acta-Gen Subj,1999,1473,4-8)。糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响，如蛋白质的折叠、运输以及定位等。糖蛋白的糖链在细胞间的识别、黏附、通信联络以及免疫应答等方面均起着重要作用，除此之外，蛋白质糖基化的异常与肿瘤、发育、免疫异常以及感染等疾病的发生发展和诊断治疗也有密切关系。目前，已知肿瘤、类风湿等疾病会引起糖链结构的异常改变，因此，糖链被认为是一种潜在的疾病标志物和新疫苗的靶点(Ohtsubo K,Marth JD,Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.Cell 2006,126,855-867；Kim EH,Misek DE,Glycoproteomics based identification of cancer biomarkers.International journal of Proteomics,2011,2011,1-10)。由于糖肽仅占所有酶解后肽段的小部分(2-5％)，其质谱响应很容易被高丰度非糖肽抑制。同时，由于糖链的微观不均一性，一个糖基化位点上的糖链类型可能多达几十种，进一步降低了糖链的相对量而使得它们很难被检测到，这些使得糖蛋白糖肽的分离制备变得异常艰难。尽管糖链不容易得到，但是去除了蛋白质中非糖肽、磷酸化肽及其它肽段的影响，在高纯度糖肽基础上，研究糖链的结构信息，发现一些潜在的诊断标志物和治疗靶点将会变得更加简便、直接，更容易获得准确的结果，因此对于糖肽的分离制备，迫切需求一种高效、高通量的分离制备方法。为了得到结构单一的糖肽标准品，将糖肽混合物从酶解液中富集分离出来是首要步骤。
二维液相色谱技术是一门新兴技术，是用两根性质相同或不同的色谱柱对复杂样品进行分离。作为一种分析复杂样品的理想工具，它已被广泛应用于医药卫生、食品科学、环境和农业科学等各个领域。 近年来，随着二维液相色谱理论及应用的发展，二维制备液相色谱也逐渐发展起来。与单维制备液相色谱相比，二维制备液相色谱不但具有更高的峰容量，而且两维具有不同的选择性。
酶法释放糖蛋白糖链因方法简单、条件温和、能够提供有关糖链残基组成、排列顺序和糖苷键的构型等信息，目前应用较广，其中胰蛋白酶(Trypsin)应用更为广泛。到目前为止，虽然对血清中免疫球蛋白、单克隆抗体的Trypsin酶解糖链释放、结构表征的研究很多，但大多数研究仍集中在用质谱方法检测酶解液中的糖肽。同时，随着对糖肽结构的不断认识，对其功能的研究越来越引起人们的兴趣，这使得对于糖肽样品的获取迫在眉睫。然而，到目前为止，从单克隆抗体酶解液中将糖肽富集分离出来，并通过二维液相色谱分离制备得到纯度较高的糖肽组分，还未见报道。
技术实现要素：
为了深入研究糖蛋白、糖肽的结构及功能，糖肽样品的获取是最基础也是最重要的。但是，从蛋白质中去除占有量为95％－98％的非糖肽，从而获得糖肽样品是非常困难的。到目前为止，未见采用色谱方法从单克隆抗体酶解液中将糖肽富集分离出来的报导。本发明提供了一种利用二维色谱分离技术，从单克隆抗体中制备N-连接糖肽组分的高效分离制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
1)蛋白变性：单克隆抗体样品中加入尿素的缓冲溶液进行反应，反应产物中加入二硫苏糖醇进行反应，产物中加入碘代乙酸，避光反应得到变性蛋白溶液；
2)酶解：向步骤(1)得到的变性蛋白溶液中加入酶，进行酶解反应得到酶解反应产物；
3)对步骤(2)得到的酶解反应产物进行二维液相色谱分离制备，收集的组分干燥后即为N-连接糖肽组分。
步骤(1)中单克隆抗体样品在尿素的缓冲溶液中进行反应的条件为20－30℃温育，缓冲溶液pH值为7－9，反应时间为1－5小时；加入二硫苏糖醇后反应条件为35－40℃温育，反应时间为1－5小时；加入碘代乙酸后的反应条件为避光20－30℃温育，反应时间为10－60分钟。
步骤(1)缓冲溶液中尿素的浓度为4－10M；所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30－80mM；缓冲溶液中加入的单克隆抗体与尿素的质量比为1:1－1:40。
所述二硫苏糖醇，加入后其在体系中的终浓度为30－100mM，初始单克隆抗体质量与二硫苏糖醇的质量比为14:1－140:1；
所述碘代乙酸，加入后其在体系中的终浓度为30－100mM，初 始单克隆抗体质量与碘代乙酸的质量比为18:1－180:1。
步骤(2)酶解反应之前，变性蛋白溶液用碳酸氢铵缓冲溶液稀释5－10倍后再加入酶，上述碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30－80mM；酶解反应pH值为7－9，温度为35－40℃，反应时间为10－24小时；酶解后得到的酶解液在沸水中煮5－10分钟使酶失活得到酶解反应产物。
在步骤(2)中所述酶是胰蛋白酶；酶和初始单克隆抗体的质量比为1:10－1:50。
步骤(3)以硅胶为基质的键合材料为色谱柱填料，Unitary C18或XAqua(华谱新创有限公司)为一维反相填料，XAmide或XIon(华谱新创有限公司)为二维亲水填料。
步骤(3)所述的二维液相色谱分离制备中一维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为2－20微米，一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈中的一种或二种与水混合，其中甲醇或乙腈为有机相，不含或含有0.1v％甲酸，水相中不含或含有0.1v％甲酸；洗脱条件按照有机相体积分数5－30％等度或5－50分钟有机相体积分数由5％提高到40％梯度进行；柱温为25－40℃，洗脱液总流速为0.2－1.0mL/min，收集保留时间为10－30min的组分；二维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为2－20微米，采用的流动相为乙腈作为有机相与水作为水相混合，洗脱条件按水相体积分数10－50％等度或经5－30分钟水相体积分数由10－15％提高到30－60％梯度进行，柱温为25－40℃，洗脱液总流速为0.2－1.0mL/min，收集保留时间为10－30的组分。
所述一维制备，最佳流动相为含有或不含有0.1v％甲酸的乙腈与含有或不含有0.1v％甲酸的水混合，采用等度方式，乙腈体积比例为8％－15％；二维制备最佳流动相为含有或不含有0.1v％甲酸的乙腈与含有或不含有0.1v％甲酸的水混合，采用梯度条件，含有或不含有0.1v％甲酸的水体积浓度为15％，保持5分钟，再经15－20分钟增加到35％－45％。
按照上述方法制备的N-连接糖肽其主要成分是9个氨基酸肽段的N-连接糖肽组分，其肽段序列为EEQYNSTYRN，N-连接聚糖是以两个N-乙酰葡萄糖胺和3个甘露糖组成的五糖核心基础上，再连接总数为0－10个的甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖或唾液酸中的一种或二种以上，N-连接糖肽分子量为2000－4000。
本发明的优点
1.采用二维液相色谱分离技术，通过选用合适的色谱柱和色谱分离制备条件，去除了杂质蛋白、多肽、非糖肽，从单克隆抗体中得到了N-连接糖肽组分。
2.得到的N-连接糖肽组分纯度高，可以达到80％以上。
3.本发明所涉及的从单克隆抗体中制备高纯度N-连接糖肽的方法，仪器自动化程度高，操作方便、简单，常温常压下就可进行，适合大规模制备的需要。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1：
称取单克隆抗体蛋白(Sigma-Aldrich,货号527858)1mg，加入167μL的4M尿素的30mM碳酸氢铵缓冲溶液中，20℃温育1小时，缓冲溶液的pH为7。变性后的单克隆抗体蛋白加入15μL的30mM二硫苏糖醇水溶液，35℃温育1小时，还原变性后单克隆抗体蛋白的二硫键，然后加入10μL的30mM的碘代乙酸水溶液，避光条件下30℃温育10分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。
将变性后的单克隆抗体蛋白加入960μL浓度为0.1M的碳酸氢铵缓冲溶液；加入0.1mg的Trypsin，酶解缓冲溶液的pH值为7，酶解反应温度为35℃，酶解时间为10小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。LabConco离心浓缩仪上将酶解液离心浓缩3倍(程序温度15℃)，得到酶解浓缩液。用粒径2微米的Unitary(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径3mm，柱长250mm，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用5％有机相等度洗脱，柱温25℃，流动相流速为0.2mL/min，280nm紫外检测，收集20－30分钟的洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩5倍，得到一维组分。用粒径2微米的XAmide(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径3mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相采用乙腈(含0.1v％甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用10％水相等度洗脱，柱温35℃，流动相流速为0.2mL/min，280nm紫外检测，收集20－30分钟洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩至干，即为含9个氨基酸的N-连接糖肽组分，经质谱分析鉴定，糖肽个数为6条，纯度85％。实施例2：
称取单克隆抗体(Sigma-Aldrich,货号527858)10mg，加入100μL的8M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，30℃温育5小时，缓冲溶液的pH为9。变性后的单克隆抗体加入15μL的30mM二硫苏糖醇水溶液，40℃温育5小时，还原变性后单克隆抗体的二硫键，然后加入6μL的50mM的碘代乙酸水溶液，避光条件下20℃温育60分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。
将变性后的单克隆抗体加入1210μL的碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为0.5M，加入0.2mg的Trypsin，酶解缓冲溶液的pH值为9，酶解 反应温度为40℃，酶解时间为24小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮10分钟使酶失活。LabConco离心浓缩仪上将酶解液离心浓缩5倍(程序温度15℃)，得到酶解浓缩液。
用粒径20微米的XAqua(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径4.6mm，柱长150mm，流动相选择甲醇(含0.1％v甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用梯度洗脱方式：有机相体积浓度由5％经50分钟提高到40％，柱温40℃，流动相流速为1.0mL/min，280nm紫外检测，收集15-20分钟的洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩5倍，得到一维组分。用粒径20微米的XAmide(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径4.6mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈(含0.1％v甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用50％有机相等度洗脱，柱温40℃，流动相流速为0.7mL/min，280nm紫外检测，收集10-15分钟洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩至干，即为含9个氨基酸的N-连接糖肽组分，经质谱分析鉴定，糖肽个数为6条，纯度70％。
实施例3：
称取单克隆抗体(Sigma-Aldrich,货号527858)30mg，加入100μL的10M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，25℃温育2小时，缓冲溶液的pH为7。变性后的单克隆抗体加入10μL的100mM二硫苏糖醇水溶液，37℃温育5小时，还原变性后单克隆抗体的二硫键，然后加入25μL的100mM的碘代乙酸水溶液，避光条件下30℃温育20分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。
将变性后的单克隆抗体加入1500μL的碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为5M，加入1mg的Trypsin，酶解缓冲溶液的pH值为8，酶解反应温度为37℃，酶解时间为24小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。LabConco离心浓缩仪上将酶解液离心浓缩7倍(程序温度15℃)，得到酶解浓缩液。
用粒径5微米的XAqua(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径4.6mm，柱长250mm，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用30％有机相等度洗脱，柱温25℃，流动相流速为0.8mL/min，280nm紫外检测，收集10-15分钟的洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩5倍，得到一维组分。用粒径5微米的XIon(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径4.6mm，柱长250mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用梯度洗脱方式：水相浓度由10％经30分钟提高到60％，柱温30℃，流动相流速为1.0mL/min，280nm紫外检测，收集15-20分钟洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩至干，即含9个氨基酸的N-连接糖肽组分，经质谱分析鉴定，糖肽个数为10条，纯度90％。
实施例4：
称取单克隆抗体(Sigma-Aldrich,货号527858)10mg，加入200μL的8M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，25℃温育2小时，缓冲溶液的pH为8。变性后的单克隆抗体加入40μL的400mM二硫苏糖醇50mM碳酸氢铵缓冲溶液，35℃温育1小时，还原变性后单克隆抗体的二硫键，然后加入10μL的100mM的碘代乙酸50mM碳酸氢铵缓冲溶液，避光条件下25℃温浴10分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。
将变性后的单克隆抗体加入9000μL的碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为0.05M，加入0.25mg的Trypsin，酶解缓冲溶液的pH值为8，酶解反应温度为37℃，酶解时间为20小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。LabConco离心浓缩仪上将酶解液离心浓缩10倍(程序温度15℃)，得到酶解浓缩液。
用粒径5微米的Unitary(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径3.0mm，柱长150mm，流动相选择乙腈(含0.1％v甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用10％有机相等度洗脱，柱温30℃，流动相流速为0.4mL/min，280nm紫外检测，收集12-15分钟的洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩5倍，得到一维组分。用粒径3微米的Xion(华谱新创有限公司)填料装柱，柱径2.1mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈(含0.1％v甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用梯度洗脱方式：水相浓度由15％经30分钟提高到40％，柱温30℃，流动相流速为0.2mL/min，280nm紫外检测，收集17-24分钟洗脱组分，按上述离心浓缩条件离心浓缩至干，即含9个氨基酸的N-连接糖肽组分，经质谱分析鉴定，糖肽个数为8条，纯度95％。