低聚果糖保存工艺的制作方法

本发明涉及低聚果糖保存工艺，具体涉及保健食品工艺领域。

背景技术：

低聚果糖又称蔗果低聚糖，是由1～3个果糖基通过β(2—1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。100克干重菊芋中约有60—70克菊粉，菊粉是通过线性的β—2，1—糖苷链连接的果聚糖，其末端为一蔗糖基。故以菊芋粉为原料用菊糖内切酶水解作用，经精制最终可得低聚果糖浆。低聚果糖是指2～5个果糖基为链节，以一个葡萄糖基为链的端基，以果糖基→果糖连接键为主体骨架连结形成的碳水化合物。即是指1～4个果糖基以β-2，1键连接在蔗糖的D-果糖基上而形成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）和蔗果六糖（GF5）的混合物。商品低聚果糖一般还含有少量蔗糖、果糖、葡萄糖。（参考目前正在制定中的国家标准中的定义）。低聚果糖是一种天然活性物质。甜度为蔗糖的0.3-0.6倍。既保持了蔗糖的纯正甜味性质，又比蔗糖甜味清爽。是具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂——促生物质；在法国被称为原生素（PPE），已在乳制品、乳酸菌饮料、固体饮料、糖果、饼干、面包、果冻、冷饮等多种食品中应用。低聚果糖是一种水溶性膳食纤维，长期服用可以降低血清胆固醇，改善脂质代谢，经动物和人体实验证实。低聚果糖具有如下生理功能：为双歧杆菌等有益菌所利用，即只增殖10～100倍，时双歧杆菌（致病菌），具有双向调节之功效。人体摄入低聚果糖后，体内有益菌群双歧杆菌数量可抑制外源致病菌和肠内固有腐败细菌如沙门氏菌等生长繁殖，减少肠内腐败物质的生长和积累，促进肠道蠕动，防止便秘和腹泻。低聚果糖是一种优良的水溶性膳食纤维，能有效降低血清胆固醇、甘油三脂、游离脂肪酸的数量，对于因血脂高而引起的高血压、动脉硬化等一系列心血管疾病有较好的改善作用。低聚果糖在大肠内被细菌发酵生成L－乳酸，可以溶解钙、镁、铁等矿物质，促进 人体对矿物质的吸收。

实验证实，低聚果糖促进钙的吸收率达70.8%。因此，低聚果糖可以促进生长发育和防止骨质疏松症。同时还可促进维生素B1、B2、B3、B6、B12及叶酸的自然形成，从而提高人体新陈代谢水平，提高免疫力和抗病力。预防及改善由于体内毒而引起的皮肤性疾病，可防止面疮、黑斑、雀斑，青春痘、老人斑，使皮肤亮丽、老化减缓。双歧杆菌吸收低聚果糖后，迅速增殖，抑制大肠杆菌、沙门氏菌和梭状芽胞杆菌等腐败菌发生作用，减少毒性代谢物（如吲哚、亚硝基氨）的生成，同时迅速将毒性代谢物排出体外，减轻肝脏负担，起到保护肝脏的作用，预防各种慢性病、癌症等作用明显，低聚果糖极少会被消化道中的胃酸和酶分解，极难被人体吸收。据测定，低聚果糖的热值为1.5Kcal/g以下,而蔗糖热值为4.6Kcal/g,因此摄入低聚果糖后,不会引起肥胖,是理想的,低热值的功能性甜味剂.低聚果糖不能被突变链球菌利用生成不溶性葡聚糖而提供口腔微生物沉积\产酸和腐蚀的场所(牙垢),因此可以防止龋齿。

目前对于重组人成纤维细胞生长因子低聚果糖的研究主要集中在其生物功能特性上，而对于重组人成纤维细胞生长因子21(低聚果糖)在不同保存条件下的稳定性，特别是温度、pH值、缓冲溶液及反复冻融因素对21（低聚果糖）稳定性的影响作用方面鲜有人涉及，需要针对不同理化因素对于重组人成纤维细胞生长因子的保存工艺作进一步研究。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供低聚果糖保存工艺，其方法简单可行，便于人为控制，高效低成本。

本发明采取的技术方案为：

低聚果糖保存工艺，其步骤是：（1）确定低聚果糖所处的不同温度为-20℃、4℃、25℃，确定低聚果糖所处的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠，其酸碱度为pH4.0和pH5.0、柠檬酸-柠檬酸钠，其酸碱度为pH5.0和pH6.0、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，其酸碱度为pH6.0、pH6.5和pH7.0、Tris-HCl缓冲液，其酸碱度为pH7.5和pH8.0。

（2）将待提纯的低聚果糖放于缓冲液中反复冻融条件下进行分别保存，检测低聚果糖纯度，同时观察外观性状。

本发明所取得的有益效果：

低聚果糖于低温和pH 6.5～pH 8.0接近中性条件下呈现出较好的稳定性，而高温、偏酸性及偏碱性条件对低聚果糖的稳定性不利，磷酸盐缓冲液对低聚果糖稳定性呈现出较好的作用，反复冻融处理对低聚果糖稳定性具有明显的影响，上述实验结果将对低聚果糖保存工艺的研究、对低聚果糖的质量标准的制定及蛋白质药物制剂的开发提供依据。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

附图说明

图1为低聚果糖原液HPLC色谱图。

色谱柱为C18柱(250×4.6 mm)；流动相：A相为0.1%三氟乙酸-注射用水；B相为A甲醇，C相和D相均为水；流速0.5mL/min；检测波长280nm；平衡用100%A泵液体至基线稳定，洗脱采用不同浓度梯度A泵逐级洗脱，进样量10μL。

图2为温度对低聚果糖纯度影响趋势图。

25℃时，低聚果糖存放14d纯度较0h(100.00%)下降至(15.20±0.14)%，差异显著（P﹤0.05）；4℃时，低聚果糖存放35d纯度下降至(89.30±0.39)%，与对照组比较差异显著（P﹤0.05）；-20℃时，存放6个月纯度下降至（99.1±0.39）%，与对照组比较差异不显著（P> 0.05）；低聚果糖存放12个月纯度下降至(95.30±0.39)%，与对照组比较差异有显著性（P﹤0.05）。

图3为缓冲体系及pH值对低聚果糖纯度影响分布图。

A：25℃时，低聚果糖存放14天纯度变化；B：℃时，低聚果糖存放35天纯度变化；C：20℃时，低聚果糖存放6个月纯度变化；D：20℃时，低聚果糖存放12个月纯度变化。25℃条件下低聚果糖在各不同pH值的缓冲体系中保存7天后，pH为4.0和pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液出现浑浊，低聚果糖纯度分别下降至(30.6±0.12) %、(45.6± 0.30) %；pH为5.0和pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液出现浑浊，纯度降至(55.9±0.90) %、(65.9±0.82) %；pH为6.0、pH6.5和pH7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液中pH为6.0缓冲液浑浊纯度为(71.1±0.65)%，pH 6.5和pH7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液澄清透明纯度(75.1±0.45)%、(80.5± 0.02)% ；pH 7.5和pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中pH7.5缓冲液澄清透明，纯度(81.5± 0.22) %,(78.4± 0.37) %。

图4为反复冻融对低聚果糖纯度影响趋势图。

A：pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液；B：pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液；C：pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；D：pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；E、F和G：分别为pH 6.0、pH6.5和pH 7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液；H：pH7.5的Tris-HCl缓冲液；I：pH8.0的Tris-HCl缓冲液。

2.4反复冻融对低聚果糖纯度的影响

低聚果糖原液反复冻融后，因时间关系肉眼观察的结果也一样，0-3天瓶内液体仍澄清，没有不溶物出现，其纯度变化无差异显著性（P>0.05）；到6-12天时，发现肉眼可见的不溶物，其纯度变化差异有显著性（P﹤0.05），低聚果糖反复冻融0、6、9和12天后纯度分别为(100± 0.02)%、(90.8± 0.01)%、(82.5± 0.02)%和(70.6± 0.02)%，其纯度变化与对照组（0h）比较差异有显著性(P﹤0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

1 材料与方法

1.1主要仪器和试剂

高效液相色谱仪；三氟乙酸，乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；低聚果糖原液，由吉林医药学院王会岩博士提供，纯度>99%。

1.2温度对低聚果糖纯度的影响

将一定数量的样品放置25℃、4℃、-20℃下保存，对4℃和25℃样品每周提取样品若干支进行外观形状观察和HPLC法检测低聚果糖纯度，-20℃样品保存12个月，每6个月取样品3支进行检测，同时观察外观性状。

1.3不同缓冲体系及pH值对低聚果糖纯度的影响

缓冲体系终浓度为20 mmol/L，蛋白含量为0.5 mg/mL，醋酸-醋酸钠缓冲液pH 4.0和pH 5.0、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH 5.0和pH 6.0、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0及Tris-HCl缓冲液pH 7.5和pH 8.0，分别于每 7 d 取3支观察低聚果糖原液的外观性状变化并对其纯度进行测定。

1.4反复冻融处理对低聚果糖纯度的影响

将一定数量低聚果糖原液于- 20°C下冻存，每日固定时间将其融化，然后置于-20°C下冻存，如此重复持续 12 d，每3d观察低聚果糖原液外观性状的变化并对其纯度进行测定。

低聚果糖保存工艺，其步骤是：（1）确定低聚果糖所处的不同温度为-20℃、4℃、25℃，确定低聚果糖所处的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠，其酸碱度为pH4.0和pH5.0、柠檬酸-柠檬酸钠，其酸碱度为pH5.0和pH6.0、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，其酸碱度为pH6.0、pH6.5和pH7.0，Tris-HCl缓冲液，其酸碱度为pH7.5和pH8.0。

（2）将待提纯的低聚果糖放于缓冲液中反复冻融条件下进行分别保存，检测低聚果糖纯度，同时观察外观性状。

结果：20℃、4℃分别保存时，低聚果糖的各项性质在观察期内都无明显变化；25℃时，低聚果糖存放14d纯度较0h100%下降至(15.20±0.14)%（P﹤0.01）；在pH为4.0～5.0缓冲液中25℃条件下保存7天，溶液出现浑浊；在pH5.0～pH6.0缓冲液中25℃条件下保存7天，溶液出现浑浊；在pH6.5～pH8.0磷酸盐和Tris-HCl缓冲液中，溶液澄清透明；低聚果糖原液反复冻融后其纯度变化差异有显著性（P﹤0.05）。结论：低聚果糖在低温和pH6.5 0-8.0磷酸盐和Tris-HCl缓冲液中溶液较稳定，同时反复冻融处理对低聚果糖稳定性也具有明显的影响。