一种用于悬浮组织细胞的培养装置的制作方法

本发明涉及组织细胞培养装置，特别是一种利于悬浮细胞在培养环境下，能够在培养液中自由正常生长的组织细胞培养装置。

背景技术：

细胞培养是指从体内组织取出细胞，模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其在体外生长繁殖、并维持其结构、功能、及生理特性的一种培养技术。细胞培养根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长的特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，一般可用纤维、微载体、多孔材料等作为培养体，细胞在培养体上贴附培养，而对悬浮型组织细胞，由于其不贴附在支持物生长，它在培养时，一般不需培养体，直接在培养液中培养，该种细胞的培养装置主要有培养皿（瓶）、搅拌装置。如专利CN 201224734Y公开了“双搅拌棒悬浮细胞培养瓶”， 一种双搅拌棒悬浮细胞培养瓶，包括瓶体、瓶盖和搅拌装置，搅拌装置的一端与瓶盖内侧连接，搅拌装置的另一端伸入瓶体内并接近瓶体底端。所述的搅拌装置由固定杆、上连接软管、轴杆、叉形旋转件、下连接软管和磁棒构成，固定杆的上端与所述的瓶盖内侧中心固定连接，固定杆的下端通过上连接软管与轴杆的上端连接；在每一分叉的下端各通过软管与磁棒连接。它可用于细菌、真菌、植物等细胞的悬浮培养，尤其适合哺乳动物细胞和昆虫细胞的悬浮培养。CN 201762335U公开了“高密度悬浮细胞培养装置”，它包括培养瓶、放置于瓶内底部的磁力搅拌子、低速调控磁力搅拌器；其中，培养瓶的顶端、培养瓶的上端两侧均设有开口；培养瓶放置于低速调控磁力搅拌器之上。通过磁力搅拌器控制置于培养瓶内底部的磁力搅拌子进行旋转，从而进行细胞悬浮培养。而用上述现有技术培养细胞时，随着细胞密度的增大，难以做到细胞均匀分布，会形成局部细胞密集区，影响培养液的传送，培养液浓度不均匀，不利于细胞正常生长，细胞密度大也会减缓细胞生长速度，上述现有技术的搅拌方式具有较大剪切力，从而对细胞造成损伤，不利于细胞的培养。

技术实现要素：

本发明目的是为了克服现有技术中的不足，而提供一种有利于细胞在培养液中自由正常生长、均匀分布、使细胞正常生长的组织细胞培养装置。

发明人认为如果提供一种细胞培养装置，该装置通过一系列均布网格空间使细胞均匀分布，同时还能使在细胞生长繁殖过程中，随着细胞数量逐渐增多致使细胞较为密集时，有仍能提供营养液或新陈代谢物自由流动的动力源，来保证细胞的正常生长条件，并通过液体流动、网格保护来减少对细胞的剪切力则能克服现有技术的不足。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种用于悬浮组织细胞的培养装置，其特征在于：所述培养装置内包括一组织细胞培养体，该组织细胞培养体为一多孔材料；该多孔材料是以材料孔径大小进行分级的孔腔及围绕形成孔腔的腔壁构成，且围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置下级小孔腔；各级孔腔均各自相互贯通且各级孔腔相互间也彼此贯通；所述培养装置内还包括一旋流装置，能使培养装置内的培养液产生旋转涡流。

上述组织细胞培养装置中，作为组织细胞培养体的多孔材料以材料孔径大小进行分级的孔腔至少分为两级以上。其中围绕构成上一级大孔腔的腔壁上设置下一级小孔腔；或者围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置有下级各级小孔腔；或者围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置有下级各级小孔腔的任意组合。

当该多孔材料的孔腔分为三级时，围绕构成上一级大孔腔的腔壁上设置下一级小孔腔；或者围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置有下级两级小孔腔。当然，下级小孔腔的腔壁都是由更下级的小孔腔围绕构成的。以此类推，分为更多级的多孔材料的孔腔，每一级的大孔腔的腔壁上都可以是只设置下一级的小孔腔，也可以是围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置有下级的各级小孔腔或围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置有下级各级小孔腔的任意组合。发明人认为，当多孔材料的孔腔分为三级时为最佳，也认为当多孔材料的孔腔分为三级时，其中围绕构成上一级大孔腔的腔壁上设置下一级小孔腔的结构为最佳。

进一步说，该多孔材料较小级的孔腔的孔径为纳米级，其他级孔腔的孔径至少大于培养细胞的平均直径。

进一步说，当该多孔材料的孔腔分为三级时，围绕构成上一级大孔腔的腔壁上设置下一级小孔腔；最小级孔腔的孔径为纳米级，比最小级孔腔的孔径大一级的孔腔的孔径至少大于培养细胞的平均直径的两倍，比最小级小孔腔的孔径大二级的孔腔的孔径至少大于培养细胞的平均直径的四倍为佳。

本发明作为组织细胞培养体的多孔材料，可采用如下制备方法制得：

（1）材料准备

将原料粉和用于制备最小一级孔的造孔剂混合，并配制成浆料；

将所述浆料均匀填充入高分子材料支架，形成坯体并干燥、破碎得到含有原料、造孔剂与高分子材料支架材料的混合颗粒；

（2）将前述得到的混合颗粒与用于制备比最小一级孔大的上级孔的造孔剂均匀混合，制成致密坯体；

（3）将致密坯体真空烧结；烧结后的坯体按照原料工艺进行常规后续处理得到多孔材料。

更具体地说，所述的多孔材料的制备方法，在制备致密坯体前，先将混合颗粒与用于制备比最小一级孔大一级的孔的造孔剂均匀混合，均匀地灌入高分子材料支架中，该高分子材料支架孔径大于混合颗粒粒径及所述造孔剂粒径，棱作为比最小一级孔大二级的孔的造孔剂，这样，经真空烧结后，就可制备出具有三级孔的多级孔材料，依次类推，可制备出更多级孔的多孔材料。

更具体地说，所述的多孔材料制备方法，孔径大于混合颗粒粒径及造孔剂孔径的高分子材料支架的孔隙是三维贯通的，从而制备出的孔也是三维贯通的。

进一步，上述悬浮组织细胞培养装置，它还包括放置组织细胞培养体的培养皿，所述组织细胞培养体固定于所述培养皿中；所述的旋流装置设置于所述组织细胞培养体下方。

上述旋流装置包括多组由支座支撑的输气管，多组输气管上均设置有出气管和进气管；所述进气管与所述培养皿外的控制阀连接，控制阀还连接有主进气管。

上述输气管呈环状，环状的输气管上设置的出气管的轴线在水平面上投影与环状的输气管的轴线在水平面上投影相切。

上述多组输气管以偶数组为佳，比如两组、四组、六组或更多。而且在水平面投影上，如果一组出气管的指向与输气管轴线顺时针切向相同，则另一组出气管的指向则与输气管轴线反时针切向相同，反之亦然。

进一步，各组出气管与水平面的夹角为小于或等于45°。

进一步，上述出气管的出口设置有丝网或带小孔的膜片。

本发明的有益效果：

1、本发明提供了有利于悬浮组织细胞三维空间自由正常生长的组织细胞培养装置，将多孔材料作为细胞培养体，特别是该多孔材料以材料孔径大小进行分级的孔腔及围绕形成孔腔的腔壁进行合理设计，将培养空间分割为一系列三维均布网格空间，其最小孔用于营养液及新陈代谢物的传输，大孔用于细胞生长空间，对任一个孔腔，由于其尺寸的局限，避免了细胞的过分密集，当达到一定密集度时，细胞再向其他孔腔迁移，由于各级孔腔均各自相互贯通且各级孔腔相互间也彼此贯通，使得细胞可在大孔间自由移动，给细胞随意穿行其中提供条件，这样结构的细胞培养体在细胞培养过程中不易形成细胞过分密集区或者是营养物质富集区，使细胞分布均匀，便于细胞正常生长。

2、本发明所述的组织细胞培养装置，各级孔腔均各自相互贯通且各级孔腔相互间也彼此贯通及纳米级孔的存在，可以使营养液或新陈代谢物在其中随意通过，即使细胞增多，孔腔变小或堵塞也不阻碍营养液或新陈代谢物在细胞培养体内的任意浸润或称渗透，从而保障细胞的顺利正常生长。

3、本发明所述的组织细胞培养装置，对多孔材料的孔腔进行分级设置，而且合理设计各级孔腔的级数及在各级孔腔腔壁上的布置，以满足各类组织细胞的各种生长环境条件。特别是孔为三级时，第三级小孔腔的孔径为纳米级孔，第二级孔腔的孔径至少大于培养细胞的平均直径的两倍，第一级孔腔的孔径至少大于培养细胞的平均直径的四倍，特别有利于细胞生长，保证了细胞在第二级孔腔内生长，在第一级孔腔内自由迁移，该最小一级孔腔孔径是纳米级孔，孔小会产生毛细力，会加速培养液、新陈代谢物的流动，能将细胞吸入细胞培养体内，并促进其在组织细胞培养体中的迁移，而且毛细力还会通过培养液作用于细胞，从而加快细胞的生长，实现细胞的高效批量培养，因而，本发明相对现有悬浮细胞培养技术具有显著的优势。

4、本发明提供的作为组织细胞培养体的多孔材料制备方法，能有效地控制孔径大小、孔的布置、贯通性，孔的分布均匀性，简便、易于实现，参数易于调整控制。

5、通过多组进气管、输气管、出气管，结合阀体控制，可使进气在培养液中形成顺时针、反时针转向的回转流动，实现培养液的高效搅拌，避免培养液不均匀，通过液体流动及细胞培养体的保护，减少了对细胞的剪切力；出气管与水平面有夹角会使培养液对上面的细胞培养体的作用更明显。

6、出气管出口装有丝网或带小孔的膜片可减小气泡，避免大气泡破碎损伤细胞。

附图说明

下面将结合附图与实施例对本发明作进一步阐述。

图1为本发明组织细胞培养装置示意图。

图2为图1中A-A截面图。

图3为图1中组织细胞培养体结构局部放大图。

图4为图3中组织细胞培养体腔壁局部放大图。

图5为图4中B-B截面图。

图6为图2中C向局部视图。

图7为图6中D向局部放大视图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作说明，实施方式以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施方式。

在附图中，1为培养皿，2为细胞培养体，3为主进气管，4为支撑输气管的支座，5为控制阀，6为进气管①，7为进气管②，8为输气管②，9为输气管①，10为出气管②，11为出气管①，12为组织细胞培养体的孔腔，13为孔腔的腔壁，14为腔壁13上的孔腔，15为孔腔14的腔壁，16为出气管①或②出口处安装的丝网或带小孔的膜片。

以下详细给出本发明的实施例：

实施例1：

参见附图，一种用于悬浮组织细胞的培养装置，所述培养装置内包括一组织细胞培养体2，该组织细胞培养体2为一多孔钽材料；该多孔钽材料是以材料孔径大小进行分级的孔腔及围绕形成孔腔的腔壁构成，且围绕构成上级大孔腔的腔壁上设置下级小孔腔；各级孔腔均各自相互贯通且各级孔腔相互间也彼此贯通。所述培养装置内还包括置于其中的旋流装置。

具体到本例，该多孔钽材料，它具有三级孔腔，其中，均匀分布、相互贯通的上二级大孔腔12（以下称第一级孔腔）的腔壁13上有均匀分布、相互贯通的上一级大孔腔14（以下称第二级孔腔），第二级孔腔14的腔壁15上有均匀分布、相互贯通的下级小孔腔（以下称第三级孔腔）；且各级孔腔相互间也彼此贯通。第一级孔腔12孔径为160µm-650µm，第二级孔腔14孔径为60µm-90µm，第三级孔腔孔径为400nm-700nm。

该多孔钽材料的制备方法是：

（1）材料准备

采用粒径为1µm-10µm的钽粉为原料，粒径为450nm-780nm 的尿素做为最小一级孔造孔剂，用粒径为450nm-780nm的聚苯乙烯作为粘合剂，按照钽粉：尿素：聚苯乙烯：蒸馏水按体积比1：2：1：7.5配制成浆料。

采用孔径为100µm-200µm的聚酯泡沫，将所述浆料用泡沫浸渍法均匀填充其中，形成坯体并干燥，然后破碎得到颗粒为65µm-100µm的含有原料、造孔剂与聚酯泡沫的混合颗粒。

（2）将混合颗粒、粒径为65µm-100µm的乙基纤维素按体积比2：1均匀混合后均匀地灌入棱直径为200µm-720µm、孔径为400µm-600µm的三维贯通的聚酯泡沫中，然后将聚酯泡沫放入密闭模具压制成致密坯体。

（3）将致密坯体真空烧结；烧结后的坯体按照钽材工艺进行常规后续热处理得到级数为三级的多孔钽。

进一步参见附图，可以看出本例的组织细胞培养装置，它还包括放置组织细胞培养体的培养皿1，所述组织细胞培养体2固定于所述培养皿1中；所述的旋流装置设置于所述组织细胞培养体下方。

该旋流装置包括两组由支座4支撑的输气管，该输气管呈环状，即图中的输气管①9与输气管②8，都是由支座4支撑；在输气管①9与输气管②8上分别均匀布置与自身连通的出气管①11与出气管②12，出气管①11与出气管②12轴线在水平面上投影分别与输气管①9与输气管②8的轴线在水平面上投影相切；分别与输气管①9与输气管②8连通的进气管①6与进气管②7穿出培养皿1与控制阀5连接，主进气管3与控制阀5连接，控制阀5可控制气体同一时刻仅通过进气管①6或进气管②7。在水平面上投影上，出气管①11指向与输气管环①9轴线顺时针切向相同，则出气管②12指向与输气管环②8轴线反时针切向相同。

出气管①11、出气管②12与水平面的夹角θ1、θ2为30°。

出气管①11、出气管②12出口装有丝网16，丝网16的平均孔径为0.5mm。

在细胞培养过程中，采用DMEM培养液，将培养细胞S180肉瘤细胞放入组织细胞培养体2内，再将组织细胞培养体2放入培养皿1中，进气管①6与进气管②7分别交替进气，每次3分钟。

培养结果表明，培养的细胞胞体丰满，生长状态良好。

实施例2：

本实施例的组织细胞培养装置的细胞培养体2采用多孔二氧化硅材料，具有两级孔腔，均匀分布、相互贯通的上级大孔腔12的腔壁13上有均匀分布、相互贯通的下级小孔腔14，且两级孔腔相互间也彼此贯通。上级大孔腔12孔径为20µm-80µm，下级小孔腔14的孔径为100nm-300nm。出气管①11、出气管②12与水平面的夹角θ1、θ2为15°，出气管①11、出气管②12出口装有带孔膜片16，其平均孔径为0.3mm。

该种多孔二氧化硅材料的制备方法是：

（1）材料准备

采用1µm-10µm的二氧化硅粉和粒径为130nm-350nm的尿素作为最小级孔造孔剂，将其均匀混合，并用130nm-350nm的淀粉作为粘合剂，按照二氧化硅粉：尿素：淀粉：蒸馏水按体积比1：1.5：1：7配制成浆料。

将所述浆料用泡沫浸渍法均匀填充入棱直径为25µm-90µm的聚酯泡沫中，形成坯体并干燥，然后破碎得到颗粒为25µm-90µm的含有二氧化硅粉、造孔剂与聚酯泡沫的混合颗粒。

（2）将混合颗粒、粒径为25µm-90µm的甲基纤维素按体积比2：1均匀混合放入密闭模具压制成致密坯体。

（3）将致密坯体真空烧结；烧结后的坯体按照二氧化硅的常规工艺进行后续处理得到级数为二级的多孔二氧化硅。

其他同实施例1。

在细胞培养过程中，采用BME培养液，将培养细胞淋巴细胞放入组织细胞培养体2内，再将组织细胞培养体2放入培养皿1中，进气管①6与进气管②7分别交替进气，每次5分钟。

培养结果表明，培养的细胞胞体丰满，生长状态良好。

实施例3：

本实施例的组织细胞培养装置的细胞培养体2采用多孔钛材料，具有三级孔腔，其中，均匀分布、相互贯通的上二级大孔腔12（以下称第一级孔腔）的腔壁13上有均匀分布、相互贯通的上一级大孔腔14（以下称第二级孔腔），上一级大孔腔的腔壁15上有均匀分布、相互贯通的下级小孔腔（以下称第三级孔腔）；且各级孔腔相互间也彼此贯通。第一级孔腔12孔径为300µm-700µm，第二级孔腔14孔径为60µm-95µm，第三级孔腔孔径为400nm-700nm，出气管①11、出气管②12与水平面的夹角θ1、θ2为45°，出气管①11、出气管②12出口装有带孔膜片16，其平均孔径为0.7mm。

该多孔钛材料的制备方法是：

（1）材料准备

采用粒径为1µm-10µm的钛粉为原料，粒径为430nm-750nm 的尿素做为最小一级孔造孔剂，用粒径为430nm-750nm的聚苯乙烯作为粘合剂，按照钛粉：尿素：聚苯乙烯：蒸馏水按体积比1：2：1：7.5配制成浆料。

采用孔径为100µm-200µm的聚酯泡沫，将所述浆料用泡沫浸渍法均匀填充其中，形成坯体并干燥，然后破碎得到颗粒为65µm-105µm的含有原料、造孔剂与聚酯泡沫的混合颗粒。

（2）将混合颗粒、粒径为65µm-105µm的乙基纤维素按体积比2：1均匀混合后均匀地灌入棱直径为350µm-780µm、孔径为400µm-600µm的三维贯通的聚酯泡沫中，然后将聚酯泡沫放入密闭模具压制成致密坯体。

（3）将致密坯体真空烧结；烧结后的坯体按照钛材工艺进行常规后续热处理得到级数为三级的多孔钛。

其他同实施例1。

在细胞培养过程中，采用MEM培养液，将培养细胞K562放入组织细胞培养体2内，再将组织细胞培养体2放入培养皿1中，进气管①6与进气管②7分别交替进气，每次4分钟。

培养结果表明，培养的细胞胞体丰满，生长状态良好。