用于结合人源β‑微球蛋白的核酸适体的制作方法

本发明总体涉及核酸适体，并且更具体的涉及与人源Beta2-微球蛋白结合的核酸适体及其筛选方法。

背景技术：

Beta2-微球蛋白广泛存在于血液、脊椎液、唾液和尿液中，是细胞表面主要组织相容性抗原MHC--I的主要成份，MHC-I分子几乎存在于除红细胞外所有细胞的表面^[1，2]。测定血清或血浆中的beta2-微球蛋白含量有助于临床上确定细胞免疫系统的生物活性和肿瘤标志物的活性.

beta-微球蛋白分子量为12,000D，它由多个beta-片层的结构域构成的球状结构，本身不具有过膜的结构域，是构成MHC-I型分子的四个亚基之一，起着维持MHC-I分子表面与多肽结合部位结构的作用，但本身不参与结合。

微球蛋白在人体免疫过程中起着极其重要的作用，它由淋巴系统合成，同时它也是细胞表达MHC-I的必须条件。beta-微球蛋白缺失的突变小鼠，在细胞表面几乎检测不到MHC-I分子，而没有了MHC-I的参与，CD8细胞就不能分化成熟，没有CD8亚型的T细胞，人体就不可能获得对入侵抗原的免疫性，因此它涉及了体内重要的免疫过程。

除了可构成MHC-1类表面分子外，beta2微球蛋白还可参与形成其它I型的分子，如CD1和Qa分子.此外，它还可与HFE蛋白一起，参与调节铁进入小肠的胞饮作用，这一功能的缺省可导致铁的过量和血色病。

在临床诊断中，长期血透的病人，其beta2-微球蛋白可在关节腔聚集成淀粉样纤维，可引起透析相关性淀粉样病变。

尿液中的beta2-微球蛋白含量，由肾小球和肾小管重吸收，因此尿液中的beta2-微球蛋白含量指示了肾性过滤的紊乱。血尿中beta2-微球蛋白的含量在临床诊断中可以揭示多种疾病^[3]。在正常人血清中beta2微球蛋白的浓度低于2.5mg/L，老年人则低于3.5mg/L；尿液中的含量在0-0.3mg/L.而在(1)恶性肿瘤中，如肝癌、胰腺癌、胆癌、肺癌、胃癌、卵巢爱、宫体腺癌、结(直)肠癌、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤及百血病等血清和尿中的beta2-微球蛋白水平均有明显升高，可作为恶性肿瘤病情监测的一项指标。其它可引起beta2-微球 蛋白水平升高的还有(2)肾疾病、急慢性肾盂肾炎高^[4]、狼性肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭的血、尿中beta2-微球蛋白水平均升高；(3)系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、白癜风、荨麻疹、带状疱诊、艾滋病血中beta2-微球蛋白水平均升高；(4)肾性排斥反应尿中beta2-微球蛋白水平升高；(5)其他疾病，如糖尿病肾病、妊高症、急慢性肝炎、流行性出血热等血中beta2-微球蛋白水平升高^[3]；淋巴管疾病，(6)外周血管疾病^[5]。因此，测定血液或尿液中微球蛋白的含量，可以帮助诊断这些疾病的进程。

核酸适体是由Gold实验室在1990年发明的，他们通过一个现在称为SELEX的过程，得到了可与T4 DNA聚合酶结合的RNA分子，这是最早发现的适体分子.两年后，绍斯塔克实验室和Gilead Sciences公司，用类似的方法得到了可与有机染料分子和人凝血酶结合的单链DNA适体。目前DNA或RNA核酸适体已经广泛用于制备不同的生物活性物质^[6][7][8]，其中包括溶菌酶^[9]，凝血酶^[10]，人艾滋病毒反式作用原件(HIV TAR)^[11]，血红素^[12]，干扰素^[13]，血管内皮生长因子(VEGF)^[14]，多巴胺^[15]。随着核酸适体制备技术的不断改进，Gold领导的SomaLogic公司已经将单一适体的研发时间从六个星期缩减到三天的时间。

核酸适体的制备过程简单而言，就是从人为设计、合成的单链DNA/RNA文库中筛选得到的一系列具有高亲和力和高特异性的寡核苷酸。这些合成的寡核苷酸分子在特定的缓冲体系下，可以借助氢键、范德华力、疏水作用等分子内作用力形成不同的三维空间结构，如发夹结构(Hairpin)、假结(pseudoknot)、G-四分体(G-quartet)，然后与标靶分子识别并结合，剔除未结合序列，保留结合序列，并通过聚合酶链式反应指数级放大结合核酸适体的数量，并通过反筛竞争法除去不结合的适配体分子，经过几轮或者十几轮的筛选，获得高亲和力和高特异性的核酸适体配体。这一过程现在被称之为核酸适体的SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Expotential Enrichment)指数富集的配体系统进化筛选过程，其基本原理是利用人工合成的寡核苷酸库与标靶分子孵育的结合能力强弱，达到强者富集的结果。

与抗体相比，核酸适体具有诸多不可替代的优点：靶分子范围更广泛，从小的金属离子到剧毒分子、甚至完整的细胞等都可以作为筛选的标靶；高亲和力和高特异性；通过化学方法合成，易保存，不易受生物污染或降解；无免疫原性；组织渗透性强；容易进行化学修饰等。核酸适体的药用价值也正在被发现.2004年最早由美国食品和药物管理局(FDA)批准用于OSI制药公司的治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的核酸适体药物Macugen上市。此外，其它用于治疗急性病和慢性病的适体药物也正处于临床试验中，如用于治疗急性冠脉综合征(ACS)一类新药的血管性血友病因子(vWF)拮抗剂(ARC1779)在2007年年底开始二期临床试验。

在临床诊断领域，更多的适体正在不断地开发出来，如埃林顿实验室和科罗拉多 SomaLogic公司正在开发为用于血浆蛋白分析诊断的适体组，他们称之为适体的血浆蛋白质组学。这项技术用适体芯片，一次分析多个血浆的蛋白组分的含量变化，用于区别、诊断患者的疾病与健康状态.

[1]″Entrez Gene：Beta-2-microglobulin″.

[2]Güssow D.，et al.，(1987)The human beta 2-microglobulin gene.Primary structure and definition of the transcriptional unit″.J.Immunol.139(9)：3132-8.

[3]马爱群、吕毅(2008)检验科手册，科学出版社PP：505。

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技术实现要素：

1.本发明的第一目的在于提供具有高亲和力的beta2-微球蛋白的核酸适体。

2.所述的beta2-微球蛋白核酸适体的核心序列如下：

YZMG004：GGGCGACGGACCGTGTGTGTGGGGT

3.还可将上述核酸适体进行修饰和改造，所得的核酸适体衍生物具有相同功能的核酸适体衍生物可为：

a)将所述核酸适体删除部分或增减部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体相同功能的核酸适体衍生物，如G-＞C，A-＞T等。

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

c)将所述的核酸适体骨架改造，如硫代磷酸酯骨架等，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。

4.所筛选的方法步骤具体如下：

①建立随机的DNA文库，ss DNA的长度为25个碱基，文库的两端可包含任意的核酸序列。

②所述的起始文库与beta2-微球蛋白偶联的Sepharose activated expoxy 6B进行孵育，去除非结合的序列，得到与beta2-微球蛋白结合的核酸序列。

③将上述得到的核酸适体序列与牛血清蛋白BSA偶联的Sepharose activated expoxy 6B孵育，去除结合的核酸序列，得到不与Sepharose activated expoxy 6B结合的核酸序列。

④「经过反复的循环后，得到与beta2-微球蛋白特异性结合的核酸适体。

附图说明

图1为：得到的核酸适体与β-微球蛋白结合的毛细管电泳图谱

具体实施方式

1.beta2-微球蛋白与Expoxy-activated Sepharose 6B偶联：

(a)200ug beta2-微球蛋白溶于200ul水中。

(b)取0.08g Expoxy-activated Sepharose，加入1ml水，反复颠倒，使其充分溶胀，约5min后，待其分布均匀后，低速离心，去上清。反复清洗几次，以去除附加物.

(c)取步骤(a)的beta2-微球蛋白，加入最后一次离心后的Expoxy-activated Sepharose中，再加入1M的NaHCO₃。(20℃，150rpm，16h)

2.封闭未结合的beta2-微球蛋白的活性基团：

(1)低速离心，反复用0.1M的NaHCO₃清洗三次。

(2)将偶联后的Expoxy-activated Sepharose置于1M的乙醇胺中(40℃，4h)

(3)用0.1M的Na AC(PH＝4.0，0.5M Na Cl)和0.1M Tris-HCL(含0.5M Na Cl)，交替清洗三遍。

(4)最后用10％乙醇洗两遍，保存在10％的乙醇中。

3.SELEX过程

(1)取80ul 10％乙醇中的Expoxy-activated Sepharose，用1X binding buffer清洗两次，离心去上清。

(2)Expoxy-activated Sepharose beads与10x binding buffer(PH＝7.5，50mM Hepes，120mM Na Cl，5mM KCL，2mM CaCL₂)，2mM MgCL₂)，再与核酸混合。(20℃，160rpm，1h孵化)

(3)离心，弃上清。(上清液中是不结合的DNA)

(4)用1X binding buffer清洗Expoxy-activated Sepharose，离心去上清液.(上清液中是不结合的DNA)

(5)用50ul(8M)尿素清洗Expoxy-activated Sepharose，20℃，160rpm，10分钟。离心，收集上清液(上清液中是结合的DNA)。重复两次

(6)用水清洗Expoxy-activated Sepharose，离心收集上清液(上清夜中是结合的DNA)。

(7)将收集的上清液(含有结合DNA)，在3KD的超滤离心管中离心。

(8)用收集的核酸作为模板，进行PCR，制备单链DNA.

(9)重复上述步骤，进行十次筛选。

(10)进行4个循环以后，要进行反筛，将核酸序列和与牛血清蛋白BSA相偶联的 Expoxy-activated Sepharose进行孵育，以去除非特异性结合的核酸.

4.双链DNA的制备。

5.将克隆化的PCR产物连入T载体.(pMD 18-T simple vector，购自TAKARA生物公司)

6.转化感受态细胞。(Ecoli DH5 a compliment Cells，购自TAKARA生物公司)

7.菌落PCR后，随机挑斑进行测序。

8.得到与β-微球蛋白结合的核酸适体序列

9.利用毛细管电泳检测beta2-微球蛋白与所得到的核酸适体的结合情况。(见附图)