本发明涉及农业高新技术领域，具体地说是一种鉴定周期短、可靠性高的玉米抗粗缩病鉴定方法。
背景技术：
玉米属于禾本科玉蜀黍族玉蜀黍属，它的驯化起源可以追溯到距今7000-10000年以前，是目前世界第一大作物。我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国，近年来玉米也成为我国第一大作物，是重要的口粮、饲料粮、工业原料和能源原料，在生产中有着举足轻重的地位。近年来，随着产业结构的调整和人口不断增加，对于玉米的产量、品质的需求也越来越高，玉米种植面积也逐年增加。
玉米粗缩病是一种在世界范围内严重危害玉米生产的病毒病。该病于1949年首次在意大利发现，随后在其它欧洲国家和南美洲国家也相继发现。我国于1954年在新疆南部和甘肃西部首先发现，随后蔓延全国。自上世纪70年代以来玉米粗缩病在我国华北、西北和东北的部分地区引发大面积毁种或绝产，成为威胁玉米生产的重要病害。据不完全统计，1996年我国玉米粗缩病发病田高达233万公顷，其中绝产超过4万公顷。2004年后，玉米粗缩病又在江苏、安徽、江苏、浙江、上海等地区暴发。2007年仅在山东全省发生面积就达340万亩，2008年在山东进一步扩展到1110多万亩，其中造成绝产25万亩，安徽、河南、河北等省的玉米粗缩病也比较严重。从2008年到2014年，玉米粗缩病在我国每年的发病面积都超过300万公顷，一般病株率在2%至10%之间，严重的田块可达80%以上，有的甚至绝收，该病的爆发和流行严重影响和制约了我国的玉米生产，并造成了巨大的经济损失。近几年，随着气候的变化和种植结构的调整，玉米粗缩病的发生在我国又开始呈上升趋势，尤其在河北、山西、山东、江苏、浙江、上海等地区发生更为严重，控制玉米粗缩病的危害对保证玉米的高产稳产具有十分重要的意义。
玉米粗缩病的初期症状是在幼叶中脉两侧的细脉间有透明虚线小点，以后透明小点逐渐增多，叶背面的叶脉上产生粗细不一的蜡白色突起，手摸有明显的粗糙感。病株植株矮缩，节间缩短；叶色浓绿；叶片短宽肥厚，僵直挺立，常有皱褶；雌雄穗发育不良，严重者不能结实。
MRDV、MRCV和RBSDV是迄今报道的能引起玉米粗缩病的三种病原，其中MRDV和MRCV分别是欧洲和南美洲玉米粗缩病的病原，我国玉米粗缩病的病原为RBSDV。这三种病毒都属于呼肠孤病毒科斐济病毒属的第二组，三者在病毒粒子形态、寄主范围、传播介体、血清学和基因组电泳和序列等方面都非常相似。
中国玉米粗缩病病毒RBSDV主要存在于病叶隆起的细胞及保毒昆虫的脂肪体、唾液腺、消化道、肌肉、气管等细胞内。在玉米植株，病毒粒子大多集中在细胞壁处形成病毒质体，玉米粗缩病毒仅限于韧皮部及其附近细胞。只能由昆虫传播，传毒昆虫主要为灰飞風，灰飞虱一旦获毒，终身带毒，蜕皮后仍在体内繁殖，属持久性传毒。
灰飞虱是传播玉米粗缩病病毒最主要的传播介体，无毒虫在感染了RBSDV的植株上吸汁获毒，获毒时间一般为24-48h，最短lh，无毒虫一经带毒后能终身传毒，不经卵传染，毒虫多数为短期间歇传毒。在“小麦-玉米”种植区，小麦上发生的第1代灰飞虱带毒虫是造成玉米粗缩病流行的主要侵染源。春天第一代灰飞虱成虫在越冬寄主上取食得毒后向玉米上迁移，在小麦收获期形成迁飞高峰，迁移高峰后约21天出现玉米粗缩病发病高峰。第2、3、4代灰飞虱迁飞到麦田和田边杂草传毒并越夏。秋季冬小麦出苗后，灰飞虱迁飞到麦田和杂草上传毒越冬，继而形成全年病害循环。
化学农药防治和调整播种期等防治措施，可以在一定程度上控制玉米粗缩病的发生和传播，但是费时费力，带来农药污染环境问题，效果并不一定明显，种植抗病的玉米品种是防治粗缩病最有效的方法。培育和鉴定优良的抗病玉米是选育抗病品种的首要问题。对当地主栽品种以及我国主要玉米品种进行粗缩病抗性鉴定与评价，筛选高抗品种和种质，是开展抗玉米粗缩病种质改良和育种研究的最直接的依据和指导。
目前对于玉米粗缩病的研究主要还是依靠田间自然发病的方法，鉴定耗费周期长，鉴定结果波动大、重复性差，这为鉴定玉米植株的粗缩病抗性和遗传分析带来了困难。因此，建立一个稳定有效的粗缩病抗病性鉴定方法对于鉴定抗病种质资源、研究植株的抗病机制、鉴定并克隆抗病基因以及抗病育种都有很重要的意义。因此，完善玉米粗缩病鉴定技术是一项十分必要的工作，准确可靠的粗缩病抗性鉴定技术可保证玉米粗缩病的病原及抗病性鉴定工作的连续性和重复性。
我们研究发现对玉米植株接种RBSDV，不管是抗病还是感病玉米植株体内，均检测到RBSDV病毒，但是玉米植株苗期感染了RBSDV病毒之后，症状不凸显，不能确定其抗病性，需要进一步大田栽培至显症后才能调查其抗病性。令人振奋的是，我们研究发现玉米接种RBSDV病毒后早期幼苗体内的RBSDV增殖速度与玉米品种抗性直接相关，通过调查接种后病毒粒子的增殖速度能够直观反映玉米种质对粗缩病的抗性水平。我们的研究发现给玉米粗缩病抗病性的鉴定提供了新思路，本发明正是据此利用荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后早期玉米幼苗体内RBSDV进行检测，通过制作RBSDV增殖趋势图实现了接毒后早期玉米幼苗内RBSDV病毒增殖速度的准确测量，从而快速且准确地鉴定玉米对粗缩病的抗性水平和抗性等级。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前玉米抗粗缩病鉴定方法具有鉴定周期长、鉴定结果不准确等缺点，提供了一种鉴定周期短、可靠性高的玉米抗粗缩病鉴定方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种玉米抗粗缩病鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：
1）选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对玉米粗缩病表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应玉米品种作为鉴定标尺；
2）低氧诱导待测玉米和鉴定标尺的胚芽鞘：每个品种取10-16粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘；
3）胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h，将传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
4）荧光定量PCR获得各玉米品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）：按照周期时间点采集待测玉米和鉴定标尺特定位置的胚芽鞘40-60g，每个品种每个取材时间点取材2-3重复，-70℃保存，提取RNA并纯化，取1μL上述病毒RNA提取液，加入荧光定量PCR反应体系，利用引物RBSDV-F：5’-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3’和RBSDV-R：5’-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3’按照荧光定量PCR扩增程序扩增RBSDV病毒S7片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）；
5）绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx；
6）根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平和抗性等级：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测玉米品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低，待测品种k值小于等于高抗标尺的为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺的为感病品种，待测品种k值大于感病标尺的为超感品种。
所述步骤1）和6）中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地玉米品种资源中排名为9%-11%；中抗鉴定标尺排名为23%-27%；感病鉴定标尺排名为46%-54%。
所述步骤2）中的适宜浓度的IAA溶液浓度为2.0-3.0μmol/L；所述的低氧诱导方法为种子置于液面下5-10cm处培养。
所述步骤3）中的带毒灰飞虱的获取步骤为：
3.1）RBSDV毒源获取：从玉米粗缩病重病区田间采集表现为玉米粗缩病症状的玉米幼嫩病株，-70℃保存；
3.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用玉米幼苗饲养并传代；
3.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出玉米粗缩病病株，常温放置2-3h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的灰飞虱转入保鲜盒内的RBSDV毒源玉米上，25℃饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到玉米幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱。
所述步骤3）中的适宜浓度的ABA溶液浓度控制为35-45μmol/L；所述步骤3）中的定量接种带毒灰飞虱控制为10-15虫/个胚芽鞘。
所述步骤4）中的周期取样时间点为RBSDV传毒后4-18天内每隔2.5-3.5天均匀分布的3-4个时间点；特定位置的胚芽鞘为胚芽鞘全长的正中间部位。
所述步骤4）中的提取RNA的方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中。
所述步骤4）中的纯化RNA的方法为：a）直接添加一体积（95%-100%）酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管中），然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中。
所述步骤4）中的荧光定量反应体系每20μL中含：10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10µM引物RBSDV-R和RP；实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s。
所述步骤3.3）中的RBSDV毒源玉米来源于步骤3.1）中的表现为玉米粗缩病症状的玉米幼嫩病株。
附图说明
附图为对实施例所选择的鉴定标尺胚芽鞘传毒后周期取材点取材检测RBSDV浓度变化所获得RBSDV增殖指数趋势图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种玉米粗缩病的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：
1）选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对玉米粗缩病表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应玉米品种做为鉴定标尺，其中，高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地玉米品种资源中排名为9%-11%，中抗鉴定标尺排名为23%-27%，感病鉴定标尺排名为46%-54%；
2）低氧诱导待测玉米和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取10-16粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下2.0-3.0μmol/L的IAA溶液液面下5-10cm处低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘；
3）胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养：
3.1）RBSDV毒源获取：从玉米粗缩病重病区田间采集表现为玉米粗缩病症状的玉米幼嫩病株，-70℃保存；
3.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用玉米幼苗饲养并传代；
3.3）介体饲毒：饲毒时从-70℃冰箱中取出玉米粗缩病病株，常温放置2-3h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的1.5-2.5龄灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源玉米上，该RBSDV毒源玉米即3.1）中的表现为玉米粗缩病症状的分蘖盛期玉米病株，25℃饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到玉米幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱；
3.4）胚芽鞘接种带毒灰飞虱：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，按照10-15虫/个胚芽鞘的比例定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h；
3.5）胚芽鞘接毒后暗培养：将胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了35-45μmol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培养；
4）荧光定量PCR获得各玉米品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）：灰飞虱传毒结束后4-18天内在每隔2.5-3.0天均匀分布的3-4个时间点采集待测玉米和鉴定标尺胚芽鞘长度的正中间部位40-60g，每个品种每个取材时间点取材2-3重复，-70℃保存，提取RNA并纯化，（RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中；RNA纯化方法为：a）直接添加一体积（95%-100%）酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管中），然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25-37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase-Free Water 到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70℃超低温冰箱中。）取1μL上述病毒RNA提取液，加入荧光定量PCR反应体系，利用引物RBSDV-F：5’-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3’和RBSDV-R：5’-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3’按照荧光定量PCR扩增程序扩增RBSDV病毒S7片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）；
5）绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx；
6）根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平和抗性等级：
6.1）待测品种抗性水平评价：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测玉米品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低；
6.2）待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗性等级，即待测品种k值小于等于高抗标尺为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品种，待测品种k值大于感病标尺为超感品种。
实施例
2014年，利用该发明的鉴定方法对征集得到的部分玉米品种资源进行了粗缩病抗性鉴定，分别设置丹340、珠甜1号、济单7号三个玉米品种做为高抗、中抗、感病鉴定标尺，其中，丹340在2012-2013年室内接毒鉴定中抗病表现在68个玉米品种资源群体中排名第7，珠甜1号排名17，济单7号排名34；处理的IAA溶液浓度选择为2.5μmol/L；ABA溶液浓度选择为40μmol/L；种子置于液面下8cm处培养诱导胚芽鞘；定量接种带毒灰飞虱控制为12虫/个胚芽鞘；胚芽鞘采集时间点设置为接毒完成后第5、8、11、14天四个时间点。
实时荧光定量PCR获得每个品种周期取样时间点的RQ值，如表1所示：
然后绘制RBSDV增殖指数趋势线：以RQ值均值为纵坐标，饲毒后取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线，如附图所示。
根据RBSDV增殖指数趋势图各品种k值的差异来评价待测玉米品种的粗缩病抗性水平和抗性等级。在本实验中，高抗标尺丹340 k值计算为0.6368；中抗标尺珠甜1号k值计算为1.4271；感病标尺济单7号k值计算为1.9715，如附图所示。待测品种k值与鉴定标尺比较获得相应的抗性等级，我们对以下8个玉米品种采用本发明的鉴定方法鉴定种质粗缩病抗性，结果如表2。
通过将表2的鉴定结果与田间多年多点粗缩病发病结果的比较，我们发现该鉴定结果与大田发病表现非常吻合，而且本发明在传毒介体接毒玉米胚芽鞘后短时间内就能对种质粗缩病抗性进行准确的检测，从而大大缩短了鉴定时间。
通过实施例可以发现，本发明的鉴定新方法与利用发病病症评价抗感性的方法相比，通过接毒玉米胚芽鞘后调查胚芽鞘内病毒增殖速度来评价玉米粗缩病品种抗性，大大缩短了鉴定周期；而且通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度从分子水平上确定玉米种质对玉米粗缩病的抗性水平和抗性等级，可靠性更高，因而本发明具有较大的育种应用价值。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。