可用于检测TM4SF1和NPY基因特异甲基化位点的试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及一种辅助诊断原发性肝细胞癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测肝癌相关基因TM4SF1和NPY基因启动子区特异性位点甲基化水平的试剂盒及其应用。

背景技术：

肝癌是全球范围内致死率排名第三的恶性肿瘤，也是我国位居第二的癌症“杀手”。目前对肝癌的治疗主要以手术、放化疗为主，同时结合免疫治疗、中医等其他治疗方法；但由于对于肝癌的发病机制尚不明确及缺乏有效的治疗靶点，中后期的病人治疗效果不佳，生存率低。研究表明，肝癌发生发展是一个表观遗传学调控的过程。DNA甲基化是目前表观遗传学研究的热点之一，它是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介导下，以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，将甲基基团转移到DNA某些碱基上的过程。DNA甲基化异常被认为是发生肿瘤的一个重要原因。研究肝癌相关基因特异性位点甲基化的改变，有助于了解肝癌的发病机理，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。

TM4SF1(transmembrane 4L six family member 1，四跨膜蛋白超家族成员1)基因位于3号染色体长臂，是细胞膜上的糖蛋白，调节细胞的发育、活化、增殖和运动。它是内皮细胞的重要功能蛋白和肿瘤血管生成的关键蛋白，在肿瘤血管内皮细胞中高度表达，作为潜在的癌细胞表面抗原而受到广泛关注。同时TM4SF1也在结肠癌、前列腺癌细胞侵袭转移中发挥重要作用。有研究者利用cDNA芯片对HBV感染的原发性肝癌患者进行全基因组分析，该基因表达水平在癌与癌旁样品中具有显著性差异。目前，该基因启动子区甲基化异常与肝癌的关系未见报道。

NPY(neuropeptide Y，神经肽Y)基因位于7号染色体长臂1区5带，其编码蛋白广泛存在于中枢神经系统，影响许多生理过程，包括大脑皮质的兴奋性、应激反应、昼夜节律、心血管功能等。NPY通过G蛋白偶联受体抑制腺苷酸环化酶，激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，调节细胞内钙含量，并激活钾通道。该基因的异常甲基化在乳腺癌、口腔癌细胞株、结直肠癌中均有报道。此外，DeMorrow S等通过体内外研究，证实NPY可抑制胆管癌细胞的生长和侵袭。国内外还没有公开肝细胞癌中用于检测此基因启动子区甲基化程度地方试剂盒的相关研究报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种焦磷酸测序法定量检测肝癌相关TM4SF1和NPY基因特异性位点的甲基化水平的试剂盒，该法检测方便、针对性强、检测准确性高，利用该试剂盒可以准确检测人原发性肝细胞癌组织中特异性DNA位点的甲基化水平，以辅助诊断原发性肝细胞癌。

焦磷酸测序法定量检测TM4SF1和NPY基因特异性位点甲基化水平的引物，包括PCR(聚合酶链式反应)引物和甲基化测序引物。

其中，所述TM4SF1基因的PCR上游引物序列如SEQ ID NO.1所示：5′-GAGAAGGTTGTTGGGAAAATTATAGA-3′；下游引物序列如SEQ ID NO.2所示：biotin-5′-CCAACCTTTCTAAACCCTTTATATTAACT-3；甲基化测序引物序列如SEQ ID NO.3所示：5′-TGTTTATAGTAAGTTTTGTAGG-3′。

所述NPY基因的PCR上游引物序列如SEQ ID NO.4所示：5′-AGGGTAGATATTTGGGTTTTGG-3′；下游引物序列如SEQ ID NO.5所示：biotin-5′-AACCCTCCCCCCCCAAACACTA-3′；甲基化测序引物序列如SEQ ID NO.6所示：5′-ATATTTGGGTTTTGGTG-3′。

本发明利用Illumina infinium humanmethylation27beadchip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，TM4SF1基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为cg06800962)的甲基化水平明显低于癌旁组；而NPY基因启动子区一个位点(cg05158615)的甲基化水平明显高于癌旁组。

为了避免甲基化芯片的筛测结果偏差，及保证筛测结果的准确性，本发明采用焦磷酸测序对两位点(cg06800962、cg05158615)的甲基化水平进行检测。检测方法包括如下步骤：

1.分别提取原发性肝细胞癌组织及癌旁组织的基因组DNA，分别对所有样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；

2.以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，针对位点(cg06800962、cg05158615)的上下游序列设计所述的PCR引物和测序引物。

3.以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，利用所述的PCR引物和测序引物进行焦磷酸测序，分析(cg06800962、cg05158615)位点的甲基化水平。

经检测，原发性肝细胞癌组中cg06800962位点的甲基化水平明显低于同一标本来源的癌旁组织，cg05158615位点的甲基化水平明显高于同一标本来源的癌旁组织，与甲基化芯片的筛测结果一致。表明cg06800962和cg05158615位点分别是TM4SF1和NPY基因中的特异性位点。

与已有技术相比，本发明的有益效果为：本发明发现了与原发性肝细胞癌人群相关基因的特异性DNA甲基化位点，并针对该特异性位点设计焦磷酸测序PCR引物和测序引物，通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化进行快速准确的定量检测。

附图说明

图1为TM4SF1焦磷酸测序结果图，其中蓝色框内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

图2为NPY基因焦磷酸测序结果图，其中蓝色框内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

1.特异性位点分析

用Infinium HumanMethylation27BeadChip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，TM4SF1基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为cg06800962)的甲基化水平明显低于癌旁组，NPY基因启动子区一个位点(cg05158615)的甲基化水平明显低于癌旁组。

TM4SF1基因特异性位点所在的序列为：

TGTTGACTGATGCCACCTCTGTTGTGGTGCAGATTTGTTTTAGAGGCAGATGTCCAGGGA[CG]CTGAACACTGAAATCCATCCTGCAGAGCTTGCTGTAGGCAGAGTAAAGAAGTTTGCTCTG

NPY基因特异性位点所在的序列为：

AAGGAAAGCAGGGATCGGGCACTGCCCGAGGGCAGATACTTGGGCTTTGGTGTTGTCCAG[CG]CGCTCGGAGTGCGCTGCCTCGCTCACGCGGTCCCAGGCCCCGCTTCTTCAGGCAGTGCCT

为检测该筛查结果的准确性，设计相关特异性引物，利用焦磷酸测序法对该特异性位点的特异性进行验证。

2.人基因组DNA提取

1)采集42例原发性肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，提取每个样本的基因组DNA，操作按照德国QIAGEN QIAamp DNA mini kit(Cat.No.51304)说明书进行。

2)对获取的基因组DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳分析。

3)重亚硫酸盐转化

使用德国QIAGEN公司转化试剂盒Epitect Bisulfite Kit(Cat.No.59104)进行重亚硫酸盐转化，步骤按照该试剂盒说明书进行。

4.引物设计

以经重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，使用QIAGEN公司PyroMark Assay Design2.0软件设计焦磷酸测序PCR引物及测序引物，并由上海生工生物工程有限公司合成。

5.焦磷酸测序

1)PCR扩增

以重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，利用下列条件进行PCR反应，体系如下：

反应条件：94℃ 2min；

94℃ 30sec，54℃ 1min，68℃ 1min(50个循环)；

68℃ 10min.

反应完成后对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，验证产物的特异性与准确性。

2)焦磷酸测序

在德国QIAGEN PyroMark Q96ID平台上，进行焦磷酸测序，具体步骤按仪器说明书进行。

3)DNA甲基化检测结果

甲基化结果显示：cg06800962位点癌旁组的甲基化水平明显高于癌组，该位点癌旁组甲基化平均水平为25.38％±17.32％，癌组甲基化平均水平为12.33％±8.48％(p＜0.01)；cg05158615位点癌旁组的甲基化水平明显低于癌组，该位点癌旁组甲基化平均水平为10.41％±2.49％，癌组甲基化平均水平为43.37％±19.98％(p＜0.01)。测序图分别见图1、2。

4)结论：研究结果发现原发性肝细胞癌中，TM4SF1基因cg06800962位点的甲基化水平明显低于癌旁组，NPY基因cg05158615位点的甲基化水平明显高于癌旁组。因此，本发明针对位点cg06800962和cg05158615设计的焦磷酸测序PCR引物和测序引物可用于原发性肝细胞癌中两位点的甲基化水平进行定量检测。