可用于检测RALGDS和VAV1基因特异甲基化位点的试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及一种辅助诊断原发性肝细胞癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测肝癌相关RALGDS和VAV1基因启动子区特异性位点甲基化水平的试剂盒及其应用。

背景技术：

肝癌是全球范围内致死率排名第三的恶性肿瘤，也是我国位居第二的癌症“杀手”。目前对肝癌的治疗主要以手术、放化疗为主，同时结合免疫治疗、中医等其他治疗方法；但由于对于肝癌的发病机制尚不明确及缺乏有效的治疗靶点，中后期的病人治疗效果不佳，生存率低。研究表明，肝癌发生发展是一个表观遗传学调控的过程。DNA甲基化是目前表观遗传学研究的热点之一，它是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介导下，以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，将甲基基团转移到DNA某些碱基上的过程。DNA甲基化异常被认为是发生肿瘤的一个重要原因。研究肝癌相关基因特异性位点甲基化的改变，有助于了解肝癌的发病机理，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。

RALGDS(ral guanine nucleotide dissociation stimulator，Ral鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子)是Ras的一个下游效应蛋白，也是Ras相关GTP酶效应器，已知参与多种细胞过程。RalGDS通过与Ras相互作用靠近膜上而激活Ral，使得Ral与下游的效应蛋白(如Sec5，Filamin，RalBPl，ZONAB)作用调节细胞的内吞、外排、骨架的分布以及控制基因的表达，对细胞的增殖和生理的发育有非常重要的影响。RALGDS蛋白作为肿瘤驱动因子，调节转录剪切体改变KIRC蛋白表达，RalA信号通路亦可作为肝细胞癌的治疗靶点。国内外尚未有用于检测该基因启动子区甲基化水平用于肝癌辅助诊断的试剂盒。

VAV 1(vav 1 guanine nucleotide exchange factor，鸟嘌呤核苷酸交换因子1)蛋白是VAV家族中的一员，作为支架蛋白和造血系统的信号转换器，参与细胞内转导级联，调控Rho蛋白信号转导。其编码蛋白已被鉴定为HIV-1中Nef蛋白的特异结合配体，它们通过细胞骨架重排和JNK/SAPK信号通路，引发细胞的形态学变化，从而提高病毒的复制和转录水平。VAV1蛋白几乎在所有侵袭性肿瘤细胞的胞核中特异性表达，并有报道称其通过调控肿瘤微环境中的生长因子分泌促进肺癌的生长。国内外尚未有用于检测该基因启动子区甲基化水平用于肝癌辅助诊断的试剂盒。

技术实现要素：

本发明提供了一种焦磷酸测序法定量检测肝癌相关RALGDS和VAV基因特异性位点的甲基化水平的试剂盒，该法检测方便、针对性强、检测准确性高，利用该试剂盒可以准确检测人原发性肝细胞癌组织中特异性DNA位点的甲基化水平，以辅助诊断原发性肝细胞癌。

焦磷酸测序法定量检测RALGDS和VAV基因特异性位点甲基化水平的引物，包括PCR(聚合酶链式反应)引物和甲基化测序引物。

其中，所述RALGDS基因的PCR上游引物序列如SEQ ID NO.1所示：5′-TGGGTAGTGAAAATGATTTTTTTAAATAGT-3′；下游引物序列如SEQ ID NO.2所示：biotin-5′-CTAAACACATAATCAACCTCTCCAAACTC-3′；甲基化测序引物序列如SEQ ID NO.3所示：5′-AGTTGAGGGGAGGATG-3′。

所述VAV1基因cg13470920位点的PCR上游引物序列如SEQ ID NO.4所示：5′-GTTTTGGGTAGGAGGTAGTTATGGAG-3′；下游引物序列如SEQ ID NO.5所示：biotin-5′-ACACCCCACACTAAATAAACCAATAAATAC-3′；甲基化测序引物序列如SEQ ID NO.6所示：5′-GGTAGTTATGGAGTTGT-3′。

VAV1基因cg26571739位点的PCR上游引物序列如SEQ ID NO.7所示：biotin-5′-AGTGGGAGGAAGAAAGAGATGTTAGAT-3′；下游引物序列如SEQ ID NO.8所示：5′-TACCACTTCCTCTTCTTTACCTATAAC-3′；甲基化测序引物序列如SEQ ID NO.9所示：5′-CCTCTTCTTTACCTATAACT-3′。

本发明利用Illumina infinium humanmethylation27beadchip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，RALGDS基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为cg16872071)的甲基化水平明显低于癌旁组；而VAV1基因启动子区两个位点(cg13470920、cg26571739)的甲基化水平明显低于癌旁组。

为了避免甲基化芯片的筛测结果偏差，及保证筛测结果的准确性，本发明采用焦磷酸测序对三位点(cg16872071、cg13470920、cg26571739)的甲基化水平进行检测。检测方法包括如下步骤：

1.分别提取原发性肝细胞癌组织及癌旁组织的基因组DNA，分别对所有样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；

2.以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，针对位点(cg16872071、cg13470920、cg26571739)的上下游序列设计所述的PCR引物和测序引物。

3.以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，利用所述的PCR引物和测序引物进行焦磷酸测序，分析(cg16872071、cg13470920、cg26571739)平。

经检测，原发性肝细胞癌组中三个位点的甲基化水平明显低于同一标本来源的癌旁组织，与甲基化芯片的筛测结果一致。表明cg16872071、cg13470920、cg26571739位点分别是RALGDS和VAV基因中的特异性位点。

与已有技术相比，本发明的有益效果为：本发明发现了与原发性肝细胞癌人群相关基因的特异性DNA甲基化位点，并针对该特异性位点设计焦磷酸测序PCR引物和测序引物，通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化进行快速准确的定量检测。

附图说明

图1为RALGDS焦磷酸测序结果图，其中蓝色框内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

图2为VAV1基因cg13470920位点焦磷酸测序结果图，其中蓝色框内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

图3为VAV1基因cg26571739位点焦磷酸测序结果图，其中蓝色框内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

1.特异性位点分析

用Infinium HumanMethylation27BeadChip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，RALGDS基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为cg16872071)的甲基化水平明显低于癌旁组，而VAV1基因启动子区两个位点(cg13470920、cg26571739)的甲基化水平明显低于癌旁组。

RALGDS基因特异性位点cg16872071所在的序列为：

TCTGGAAAATCTGGGTAGTGAAAATGACTTCCTCAAACAGTTGCGGGGAGGATGACATTA[CG]TAATGGACATGAAGCACTCAGCACTGAGCACCTGCACCTGACTACAGGCTCAGGCGGAGT

VAV1基因特异性位点cg13470920所在的序列为：

CAGGTCACGCGGTGGCTGGGCGGCAGCACCCGGCACTGGATGAGCCAGTGGGTGCATTGG[CG]CCACAGCTCCATGGCTACCGCCTGCCCAGGGCCGGCCGTGCACCCTCGCAGCCTCCACCA

VAV1基因特异性位点cg26571739所在的序列为：

CCTGCTCGCCTGTGGAGCGACAGCTAGTGCTACCACTTCCTCTTCTTTGCCTGTAACTGT[CG]CCCTGAGAGGGGGTGGAGGAGGAGGAGCCATGGGGCGGGGGGGAGCTGGGGGAGCACCTG

特异性位点的特异性进行验证。

2.人基因组DNA提取

1)采集42例原发性肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，提取每个样本的基因组DNA，操作按照德国QIAGEN QIAamp DNA mini kit(Cat.No.51304)说明书进行。

2)对获取的基因组DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳分析。

3)重亚硫酸盐转化

使用德国QIAGEN公司转化试剂盒Epitect Bisulfite Kit(Cat.No.59104)进行重亚硫酸盐转化，步骤按照该试剂盒说明书进行。

4.引物设计

以经重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，使用QIAGEN公司PyroMark Assay Design2.0软件设计焦磷酸测序PCR引物及测序引物，并由上海生工生物工程有限公司合成。

5.焦磷酸测序

1)PCR扩增

以重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，利用下列条件进行PCR反应，体系如下：

反应条件：94℃ 2min；94℃ 30sec，60℃ 1min(VAV1)/54℃(RALGDS)，68℃ 1min(50个循环)；68℃ 10min.

反应完成后对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，验证产物的特异性与准确性。

2)焦磷酸测序

在德国QIAGEN PyroMark Q96ID平台上，进行焦磷酸测序，具体步骤按仪器说明书进行。

3)DNA甲基化检测结果

甲基化结果显示：cg16872071位点癌旁组的甲基化水平明显高于癌组，该位点癌旁组甲基化平均水平为28.56％±7.50％，癌组甲基化平均水平为52.76％±6.95％(p＜0.01)；cg13470920位点癌旁组的甲基化水平明显高于癌组，该位点癌旁组甲基化平均水平为49.91％±8.87％，癌组甲基化平均水平为29.99％±21.24％(p＜0.01)；cg26571739位点癌旁组的甲基化水平明显高于癌组，该位点癌旁组甲基化平均水平为27.93％±7.06％，癌组甲基化平均水平为9.73％±7.92％(p＜0.01)；。测序图分别见图1、2、3。

4)结论：研究结果发现原发性肝细胞癌中，RALGDS基因cg16872071位点的甲基化水平明显低于癌旁组，VAV1基因cg13470920、cg26571739位点的甲基化水平明显高于癌旁组。因此，本发明针对位点cg16872071、cg13470920、cg26571739设计的焦磷酸测序PCR引物和测序引物可用于原发性肝细胞癌中两位点的甲基化水平进行定量检测。