定量检测S100A8和ZMYND8基因特异性位点甲基化水平的引物及应用的制作方法

本发明涉及一种肝癌相关基因，具体是涉及S100A8和ZMYND8基因启动子区特异性位点甲基化水平检测的引物及在肝癌研究中的应用。

背景技术：

肝癌是全世界范围内常见的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中其死亡率高居第三。目前对肝癌的治疗主要以手术、放化疗为主，同时结合免疫治疗、中医等其他治疗方法；但由于对于肝癌的发病机制尚不明确及缺乏有效的治疗靶点，中后期的病人治疗效果不佳，生存率低。研究表明，肝癌发生发展是一个表观遗传学调控的过程。近年来表观遗传学机制在肝癌发生、发展中的作用已成为研究的重点内容，它是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介导下，以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，将甲基基团转移到DNA某些碱基上的过程。DNA的异常甲基化修饰作为一种导致抑癌基因表达沉默的遗传学调控机制，一直是肿瘤研究中的热点。研究肝癌相关基因特异性位点甲基化的改变，有助于了解肝癌的发病机理，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。

S100A8(S100 calcium binding protein A8，人S100钙结合蛋白A8)基因与大多数S100家族其他成员一样，定位在人类的1号染色体长臂2区1带上。S100A8蛋白是四种主要表达在髓系细胞的成员(S100A6、S100A8、S100A9、S100A12)之一，尤其常见于淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。因S100A8蛋白主要表达在髓系细胞，其又被称之为髓细胞相关蛋白8(MRP8)。在胃癌、乳腺癌、肺癌的相关研究中，均发现了S100A8基因的高表达；而在食管癌的相关研究中，发现了S100A8基因的低表达。有关S100A8在原发性肝细胞癌的的表达及临床意义研究，目前国内尚未报道，关于S100A8的DNA甲基化与原发性肝细胞癌的相关性的研究，国内外均未见相关报道。

ZMYND8(zinc finger，MYND-type containing 8，MYND型锌指含8)基因编码的蛋白质是激活蛋白激酶C受体的蛋白质，位于染色体20q13.12区段。编码的蛋白可以结合体外激活蛋白激酶Cβ，同时，其也是一种皮肤T细胞淋巴瘤相关抗原。ZMYND8包含一个结构域和两个锌指结构，被称为转录调节器。国内外还没有公开肝细胞癌中用于检测此基因启动子区甲基化程度地方试剂盒的相关研究报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种焦磷酸测序法定量检测S100A8和ZMYND8基因特异性位点的甲基化水平的引物，利用该引物可以准确检测人原发性肝细胞癌组织中特异性DNA位点的甲基化水平。

本发明是通过以下技术方案实现的：

焦磷酸测序法定量检测S100A8和ZMYND8基因特异性位点甲基化水平的引物，包括PCR(聚合酶链式反应)引物和甲基化测序引物。其中，所述S100A8基因的PCR上游引物序列为：biotin-5′-GGAAGGTGTTGGAGGATATT-3′，下游引物序列为：5′-CCTCTCAACCCTACATATCTCTTATCA-3′，甲基化测序引物序列为：5′-ATCTCTTATCAACTATCTTTCA-3′；ZMYND8基因的PCR上游引物序列为：5′-TGTTTTGGGGGTGAGTGT-3′，下游引物序列为：biotin-5′-TCTTTTTTCCCCCTCCCTCT-3′，甲基化测序引物序列为：5′-GGTTAGTTATAGAGAAATTATATTG-3′。

本发明利用Illumina infinium humanmethylation27 beadchip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，S100A8(cg20070090)和ZMYND8(cg13699808)基因启动子区存在低甲基化现象。

为了避免甲基化芯片的筛测结果偏差，及保证筛测结果的准确性，本发明采用焦磷酸测序对两位点(g20070090、cg13699808)的甲基化水平进行检测。检测方法包括如下步骤：

1.分别提取原发性肝细胞癌组织及癌旁组织的基因组DNA，分别对所有样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；

2.以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，针对位点(g20070090、cg13699808)的上下游序列设计所述的PCR引物和测序引物。

3.以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，利用所述的PCR引物和测序引物进行焦磷酸测序，分析(g20070090、cg13699808)位点的甲基化水平。

经检测，原发性肝细胞癌组中g20070090、cg13699808位点的甲基化水平显著低于同一标本来源的癌旁组织，与甲基化芯片的筛测结果一致。验证了二者分别是S100A8和ZMYND8基因的特异性低甲基化位点。

与已有技术相比，本发明的有益效果为：本发明发现了与原发性肝细胞癌人群相关基因的特异性DNA甲基化位点，并针对该特异性位点设计焦磷酸测序PCR引物和测序引物，通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化进行快速准确的定量检测。

附图说明

图1为S100A8基因PCR产物电泳图。

图2为S100A8基因焦磷酸测序结果图，其中框线内柱状部分指示甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

图3为ZMYND8基因PCR产物电泳图。

图4为ZMYND8基因焦磷酸测序结果图，其中框线内柱状部分指示甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

1.特异性位点分析

用Infinium HumanMethylation27BeadChip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，S100A8(cg20070090)和ZMYND8(cg13699808)基因启动子区存在低甲基化现象。

S100A8基因特异性位点所在的序列为：

TCTCCTCTCTCAGGAAGGCTGCTCCACTTCCCTGACCCTCCCCAAGAGAAGCCCAAAGTG[CG]GGGCCAACCCAGACAGTCCCACTTACCAGGTCTTCTGAAAGACAGCTGACAAGAGACATG

ZMYND8基因特异性位点所在的序列为：

TTAACATAAGTGCTCTGGGGGTGAGTGTGGCACGGCCAGCCACAGAGAAATCACACTGCT[CG]CCCACAATTCGGATGTCTCAGAGGGAGGGGGAAAAAAGATGGTTAAAAAGTCGAGCTTAC

为检测该筛查结果的准确性，设计相关特异性引物，利用焦磷酸测序法对该特异性位点的特异性进行验证。

2.人基因组DNA提取

1)采集42例原发性肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，提取每个样本的基因组DNA，操作按照德国QIAGEN QIAamp DNA mini kit(Cat.No.51304)说明书进行。

2)对获取的基因组DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳分析。

3)重亚硫酸盐转化

使用德国QIAGEN公司转化试剂盒Epitect Bisulfite Kit(Cat.No.59104)进行重亚硫酸盐转化，步骤按照该试剂盒说明书进行。

4.引物设计

以经重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，使用QIAGEN公司PyroMark Assay Design2.0软件设计焦磷酸测序PCR引物及测序引物，并由上海生工生物工程有限公司合成。

5.焦磷酸测序

1)PCR扩增

以重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，利用下列条件进行PCR反应，体系如下：

反应条件：94℃2min；

94℃30sec，60℃1min，68℃1min(50个循环)；

68℃10min.

反应完成后对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，验证产物的特异性与准确性，见图1、3。

2)焦磷酸测序

在德国QIAGEN PyroMark Q96ID平台上，进行焦磷酸测序，具体步骤按仪器说明书进行。

3)DNA甲基化检测结果

甲基化结果显示：S100A8(cg20070090)位点癌组的甲基化水平显著低于癌旁组，该位点癌组甲基化平均水平为32.93％±14.82％，癌旁组甲基化平均水平为64.91％±4.65％(p＜0.01)；ZMYND8(cg13699808)位点癌组的甲基化水平明显低于癌旁组，该位点癌组甲基化平均水平为34.12％±19.54％，癌旁组甲基化平均水平为62.89％±8.85％(p＜0.01)。测序图分别见图2、4。

4)结论：研究结果发现原发性肝细胞癌中，S100A8基因cg20070090位点、ZMYND8基因cg13699808位点的甲基化水平都显著低于癌旁组。本发明针对位点cg20070090和cg13699808设计的焦磷酸测序PCR上下游引物和测序引物可用于原发性肝细胞癌中两位点的甲基化水平进行定量检测。