本发明属于化学药物领域，具体涉及5-(硫醚基)嘧啶类化合物及其药用组合物和应用。
背景技术：
据报道，目前人类恶肿瘤引起的死亡率已经超越所有其他疾病位于疾病死亡率的首位，中国每年死于癌症的总人口接近200万人。据卫生部2013年统计年鉴数据显示，恶性肿瘤在我国2012年城市和农村主要死亡疾病中均占据第一位，在疾病死因构成中分别达到26.81％和22.96％。
目前，临床实践中针对肿瘤患者的主要治疗药物分为两大类，其中，一类为传统的化疗药物，包括烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素、植物类激素等，它们对肿瘤细胞有很强的杀伤作用，统称为细胞毒类药物；近年来，肿瘤的靶向药物治疗是肿瘤治疗的主要方向，其主要利用肿瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差异(包括基因，酶，信号转导等)，选择性地抑制肿瘤细胞的生长，最终导致其死亡；相对于传统的细胞毒类药物，靶向抗肿瘤药具备特异性高、选择性强、毒副作用较轻等优点，联合使用时，显现出可增强传统化疗、放疗的疗效，及减少术后复发的效果，目前，靶向抗肿瘤药物以伊马替尼甲磺酸盐(STI571)(Novartis，2001)、吉非替尼(ZD1839)(AstraZeneca,2003)、厄罗替尼(OSI774)(Genetechand OSIP，2004)、索拉非尼对甲苯磺酸盐(Bay 43-9006)(Bayer and Onyx，2005)、舒尼替尼苹果酸盐(SU11248)(Pfizer,2006)以及达沙替尼(BMS-354825)(Bristol-Myers Squibb，2006)为代表。
在分子靶向药物的研发中，酪氨酸激酶家族是研究最为深入的领域之一。它包含90多个家族成员，分为受体型和非受体型。它们通过对靶蛋白酪氨酸位点的磷酸化参与到细胞内各种信号通路的调控，如细胞转移、细胞周期、增殖、凋亡和分化。激酶活性的异常直接导致不同信号通路的失调，在肿瘤发展中起着重要的作用。
EGFR属于受体酪氨酸激酶家族ErbB(又名EGFR家族)的一员，它与ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)同属该家族。EGFR主要位于细胞膜表面，与配体结合后构象改变，受体发生同源或异源二聚化，进一步通过别构激活效应，其胞内区发生自磷 酸化，激活其激酶活性，进而激活多条下游信号通路，比如Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路、PI3K/PDK1/Akt(PKB)通路、PLC-γ通路、JAK/STAT通路等。阻断EGFR的活化已被临床验证为主导的方法来靶向治疗肿瘤。
EGFR作为抗肿瘤的重要靶点，目前已经有多种药物应用于临床，其中包括6种酪氨酸激酶小分子抑制剂(Gefitinib,Erlotinib,Lapatinib,Vandetanib,Icotinib，Afatinib)和2种针对胞外结构域的单克隆抗体(Cetuximab,Panitumumab)。
吉非替尼与厄罗替尼分别于2003、2004年被批准用于临床。早期的Ⅱ期临床研究表明吉非替尼和厄罗替尼作为一线治疗用于未经选择的病人，其最好疗效仅为症状适度缓解，响应率(response rate，RR)仅为4-23％，无进展生存期(progress free survival，PFS)为1.6-3.5个月，总生存期为5-13个月，与安慰剂组相比其疗效微弱。但是随后针对取得较好疗效的亚群进行回顾性分析，发现该类人群响应率达到13-43％，无进展生存期达到4-5.6个月，相比其他患者疗效有显著性提高。该类人群主要包括东亚地区不吸烟的女性非小细胞患者。分子水平的分析表明，对吉非替尼和厄罗替尼获益最多的患者存在EGFR敏感突变，其中最常见的是19号外显子的缺失突变E746-750(19del)与21号外显子的点突变L858R，它们占到已报道所有突变的85％。EGFR激酶结构域的突变高度激活激酶，使得肿瘤细胞的生存对突变激酶具有依赖性。随后临床研究表明，发生EGFR敏感突变的患者对EGFR-TKI的反应率显著高于EGFR野生型NSCLC患者，无进展生存期和总生存期也显著延长。尽管吉非替尼和厄罗替尼治疗EGFR敏感突变的NSCLC患者效果明显，但是大部分患者的PFS不超过12-14个月，即对TKI发生了耐药。耐药问题成为制约该类抑制剂临床应用最严重的威胁。
有研究显示，EGFR的耐药机制主要为原发性耐药和获得性耐药，原发性耐药并非由使用EGFR抑制剂诱发的耐药，包括EGFR原发性耐药突变，KRAS突变，PI3K/AKT信号通路的活化，胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)高表达及NF-κB信号通路异常活化；获得性耐药是指长时间使用EGFR抑制剂而诱导的耐药，如EGFR耐药突变，肝细胞生长因子受体(MET)扩增，与肝细胞生长因子(HGF)高表达，细胞形态学转变，IGF1R与血管内皮生长因子(VEGF)高表达等，而60％的TKI获得性耐药的患者其EGFR存在耐药突变如T790M、L747S、D761Y、T854A，其中T790M占绝大多数，达总耐药人数的50％。
有研究发现T790M突变可以使EGFR对ATP的亲和力明显增加，使得第一代的TKI竞争不过ATP而失效；为了克服该缺陷，能与靶标形成共价结合的二代抑制剂被研发， 它们相对于一代抑制剂，能与靶标形成不可逆结合，从而有效克服EGFR T790M突变后对ATP亲和力增加带来的影响，同时作用更持久。目前处于临床研究阶段的EGFR二代抑制剂如表1所示。
表1.EGFR二代抑制剂
Disc.:discontinued；MBC:Metastatic breast cancer
Afatinib与2013年被美国FDA批准上市，但是临床使用情况表明，该类抑制剂不仅能不可逆的结合在发生T790M突变的EGFR上，也能作用于野生型的EGFR。由于人表皮和胃黏膜分布大量野生型的EGFR，没有选择性的不可逆持续抑制会带来严重的皮疹腹泻等3-4级不良反应。目前该药仅用于含EGFR敏感突变的NSCLC的治疗，其中的没有选择性成为制约该类抑制剂发展的瓶颈因素。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供具有高选择性的新一代的TKI，以解决二代抑制剂的选择性问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，基于EGFR抑制剂的临床应用现状，提供一种5-(硫醚基)嘧啶类化合物，尤其涉及式(Ⅰ)结构的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子：
其中，
m表示0,1,2；
n表示0,1,2，m和n不同时为0；
X表示N或者CH，
L表示共价键或者C1-3烷基，NH，O，S，-C(O)-或-SO2-；
R1表示C1-4烷基或-L1-R5，
L1表示-(C1-4烷基)-，
R5表示3-7元环烷基，苯基或5-6元杂芳基；
所述C1-4烷基部分，环烷基，苯基，杂芳基可以进一步被1-4个Q1取代，
Q1表示氢原子，卤素原子，-CN，-CF3，-NH2，-NH(C1-3烷基)，-OH,-O(C1-3烷基)，-C(0)-(C1-3烷基)，-S(C1-3烷基)或-SO2(C1-3烷基)，其中Q1可以相同或者不同；
所述环烷基上的碳原子可以被1-4个相同或者不同的N,NH,N(C1-3烷基),O,C(O)或SO2替换；
R2表示氢，卤素或-O(C1-4烷基),
所述C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟原子取代；
R3表示-C(O)-C1-4烷基，-SO2-C1-4烷基,-C(O)NH2，-SO2NH2，-C(O)-C1-4烷基-OH，-SO2-C1-4烷基-OH或NH2，
其中，C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟取代；
R4表示氢，卤素，氨基，羟基，氰基，硝基，C1-4烷基，C3-7环烷基，芳基，或者选自以下结构：
W表示CH2，CH2CH2，O，S，NH或NR7；R7表示烷基或者芳基；
R6表示氢，卤素，C1-4烷基，C3-7环烷基或芳基。
在本发明的一些实施例中，所述的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子，其具有式(Ⅱ)结构：
R1,R2,R3,L,X如权利要求1所述；
R8,R9,R10表示氢，CH3，CH2CH3；
在本发明的一些实施例中，所述的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子，其具有式(Ⅲ)结构：
m表示0,1,2；
n表示0,1,2，m和n不同时为0；
X表示N或者CH；
L表示共价键或者C1-3烷基，NH，O，S，-C(O)-，-SO2-；
R2表示氢，卤素，-O(C1-4烷基),
所述C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟原子取代；
R3表示-C(O)-C1-4烷基,-SO2-C1-4烷基,-C(O)NH2，-SO2NH2，-C(O)-C1-4烷基-OH，-SO2-C1-4烷基-OH或NH2，
其中，C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟取代；
R8,R9,R10表示氢，CH3，CH2CH3；
在本发明的一些实施例中，所述的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受 的盐或立体异构体或其前药分子，其具有式(Ⅳ)结构：
m表示0,1,2；
n表示0,1,2，m和n不同时为0；
X表示N或者CH；
L表示共价键或者C1-3烷基，NH，O，S，-C(O)-，-SO2-；
R2表示氢，卤素，-O(C1-4烷基),
所述C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟原子取代；
R3表示-C(O)-C1-4烷基，-SO2-C1-4烷基,-C(O)NH2，-SO2NH2，-C(O)-C1-4烷基-OH,-SO2-C1-4烷基-OH或NH2。
其中，C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟取代。
在本发明的一些实施例中，所述的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子，其具有式(Ⅴ)结构：
R2表示氢，卤素，-O(C1-4烷基),
所述C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟原子取代。
R3表示-C(O)-C1-4烷基，-SO2-C1-4烷基,-C(O)NH2，-SO2NH2，-C(O)-C1-4烷基-OH，-SO2-C1-4烷基-OH或NH2。
其中，C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟取代。
在本发明的一些实施例中，所述的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子，其具有式(Ⅵ)结构：
R2表示氢，卤素，-O(C1-4烷基),
所述C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟原子取代。
R3表示-C(O)-C1-4烷基，-SO2-C1-4烷基，-C(O)NH2，-SO2NH2，-C(O)-C1-4烷基-OH，-SO2-C1-4烷基-OH或NH2。
其中，C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟取代。
在本发明的一些实施例中，所述的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子，其具有式(Ⅶ)结构：
R2表示氢，卤素，-O(C1-4烷基),
所述C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟原子取代。
R3表示-C(O)-C1-4烷基，-SO2-C1-4烷基,-C(O)NH2，-SO2NH2，-C(O)-C1-4烷基-OH，-SO2-C1-4烷基-OH或NH2。
其中，C1-4烷基部分可以进一步被1-4个氟取代。
在本发明的一些实施例中，所述的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子，所述化合物选自下列分子：
在本发明的一些实施例中，所述的5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子，所述化合物选自下列分子：
本发明的进一步目的是提供一种治疗肿瘤的药用组合物。
该治疗肿瘤的药用组合物，其由所述5-(硫醚基)嘧啶类化合物或者其药学上可接受的盐或立体异构体或其前药分子与药学上可接受的载体组成。
本发明的进一步目的是提供所述5-(硫醚基)嘧啶类化合物的在制药中的用途；尤其是所述5-(硫醚基)嘧啶类化合物及其药学上可接受的盐或者立体异构体或其前药分子在制备治疗肿瘤的药物中的用途；
本发明中，所述肿瘤为非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞癌，胰腺癌，乳腺癌，前列腺癌，肝癌，皮肤癌，上皮细胞癌，胃肠间质瘤，白血病，组织细胞性淋巴癌，鼻咽癌中的任一种。
本发明经行了细胞试验，结果显示，所述的通式(Ⅰ)结构的5-(硫醚基)嘧啶类化合物，能抑制多种肿瘤细胞，尤其能选择性作用于EGFR L858R/T790M以及EGFR E745A750/T790M肺癌细胞；相对于野生型癌细胞，该类化合物的IC50要高十倍甚至几十倍的差别，进一步的，该类化合物可用于制备新的能够克服现有EGFR-TKI耐药的并具有选择性的蛋白激酶抑制剂。
本发明所述的化合物及其药学上可接受的盐，可以有效抑制多种肿瘤细胞的生长，并对EGFR,Her家族其他蛋白酶产生抑制作用；进一步的，可用于制备抗肿瘤药物，并克服现有药物吉非替尼，厄罗替尼等诱发的耐药。如本领域技术人员所理解的，本申请所述的化合物及其药学上可接受的盐可用于制备治疗人类及其它哺乳动物的肿瘤等过度增值性疾病。
本发明所述化合物中，当任何变量(例如R1，R等)在任何组分中出现超过一次，则其每次出现的定义独立于其它每次出现的定义。同样，允许取代基及其变量的组合，只要这种组合是化合物稳定。要理解本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代形式而提供化学上稳定的并可通过本领域技术和下列提出的让发自可容易获得的原料容易的合成的化合物。如果取代基自身超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子上，只要使结构稳定。
本发明中，所用术语“烷基”意指包括具有特定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如，“C1-4烷基”中“C1-4”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3或4个碳原子的基团。例如，“C1-4烷基”具体包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。术语“环烷基”指具有特定碳原子数目的单环饱和脂肪烃基。例如“环烷基”包括环丙基，甲基-环丙基，2,2-二甲基-环丁基，2-乙基-环戊基，环己基等。
本发明中，所用术语“杂芳基”代表环中多达6个原子的稳定的单环或每个环中多达6个原子双环碳环，其中至少一个环为芳香环且含有1-4个选自O、N和S的杂原子。本定义范围内的杂芳基包括但不限于：咪唑基，三唑基，吡唑基，呋喃基，噻吩基，恶唑基，异恶唑基，吡嗪基，哒嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡咯基。对于下列杂芳基的定义，“杂芳基”也理解为包括任何含有氮的杂芳基的N-氧化物衍生物。在杂芳基取代基是双环 的且有一个环为非芳香性或不含有杂原子的例子中，应理解各自经芳香环或经含杂原子环连接。
正如本领域技术人员所理解的，本发明中所用“卤素”或“卤素”意指包括氟，氯，溴和碘。
本发明包括式Ⅰ-Ⅶ化合物以及XQ-1～XQ-9化合物的游离形式，也包括其药学上可接受的盐及立体异构体。本发明中一些特定的示例性化合物为胺类化合物的质子化了的盐。术语“游离形式”指以非盐形式的胺类化合物，包括在内的药学上可接受盐包括所有式Ⅰ-Ⅶ化合物以及XQ-1～XQ-9化合物的游离形式的典型的药学上可接受的盐。可使用本领域已知技术分离所述化合物特定盐的游离形式，例如，可通过适当的碱稀水溶液例如氢氧化钠稀水溶液，碳酸钾稀水溶液，稀氨水及碳酸氢钠稀水溶液处理该盐使游离形式再生；游离形式在某些物理性质例如在极性溶剂中溶解度上与其各自盐形式多少有些区别，但是为了发明的目的这种酸盐以及碱盐在其它药学方面与其各自游离形式相当。
可通过常规化学方法自含有碱性部分或酸性部分的本发明化合物合成本发明的药学上可接受的盐。通常，通过例子交换色谱或通过游离碱和化学计算量或过量的所需盐形式的无机或有机酸在适当溶剂或多种溶剂的组合中反应制备碱性化合物的盐，类似的，通过和适当的无机或有机碱反应形成酸性化合物的盐。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括通过本发明的碱性化合物和有机或无机酸反应形成的本发明化合物的常规无毒盐，例如，常规的无毒盐包括自无机酸例如盐酸，氢溴酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸，硝酸等的盐，也包括自有机酸例如乙酸，丙酸，琥珀酸，乙醇酸，硬脂酸，没乳酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗败血酸，扑酸，马来酸，羟基马来酸，苯乙酸，谷氨酸，苯甲酸，水杨酸，对氨基苯磺酸，2-乙酰氧基-苯甲酸，富马酸，甲苯磺酸，甲磺酸，乙烷二磺酸，草酸，羟乙基磺酸，三氟乙酸等制备的盐。
如果本发明化合物为酸性的，则适当的“药学上可接受的盐”指通过药学上可接受的无毒碱包括无机碱及有机碱制备的盐，得自无机碱的盐包括铝盐，铵盐，钙盐，铜盐，铁盐，亚铁盐，锂盐，镁盐，钠盐，锌盐等。特别优选铵盐，钙盐，镁盐，钾盐和钠盐。得自药学上可接受的有机无毒碱的盐，所述碱包括伯胺，仲胺，叔胺的盐，取代的胺包括天然存在的取代胺，环状胺及碱性离子交换树脂例如精氨酸，甜菜碱，咖啡因，胆碱，N,N-二苄基乙二胺，二乙胺，2-二甲基氨基乙醇，氨基乙醇，乙醇胺，乙二胺，N-乙基吗啉，N-乙酰哌啶，葡萄糖胺，氨基葡萄糖，组氨酸，羟钴胺，异丙基胺，赖氨酸，甲 基葡萄糖胺，吗啉，哌嗪，哌啶，呱咤，多胺树脂，普鲁卡因，嘌呤，可可碱，三乙胺，三甲胺，三丙胺，氨基丁三醇等。
Berg等，“Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.1997:66:1-19更详细描述了上文中所述药学上可接受的盐及其它典型的药学上可接受的盐的制备，在此将其内容引入本发明中。
由于在生理条件下化合物脱质子化的酸性部分例如羧基可为阴离子的，而这种带有电荷然后可被内部带有阳离子的质子化了的或烷基化了的碱性部分例如四价氮原子平衡抵消，所以应注意本发明化合物时潜在的内盐或两性离子。
除在文献中已知的或在实验程序中例证的标准方法外，可采用如下列实施方案中显示的反应制备本发明化合物。因此，下列说明性实施方案是为说明目的而不是局限于所列化合物或任何特定的取代基。实施方案中显示的取代基数目并不必需符合权利要求中所用的数目，且为清楚起见，显示单取代基连接到在上文式Ⅰ的定义下允许有多取代基的化合物上。
具体实施方式
如发明所述式Ⅰ-Ⅶ化合物以及XQ-1～XQ-9化合物，本领域的技术人员可以根据现有技术和所具备的常识，可以由2,4-二氯-5-(甲硫基)嘧啶为起始原料通过几步反应合成(具体合成步骤见实施例1)。
在一个实施方案中，本申请提供了一种利用具有式Ⅰ-Ⅶ化合物以及XQ-1～XQ-9化合物，及其药学上可接受的盐治疗人或其它哺乳动物肿瘤等过度增殖性疾病或症状的应用。
在一个实施方案中，本申请所涉及的化合物及其药学上可接受的盐可以用于治疗或者控制非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞癌，胰腺癌，乳腺癌，前列腺癌，肝癌，皮肤癌，上皮细胞癌，胃肠间质瘤，白血病，组织细胞性淋巴癌，鼻咽癌等过度增殖性疾病。
本申请所涉及的化合物及其药学上可接受的盐的代谢产物，以及可以在体内转变为本申请所涉及的化合物及其药学上可接受的盐的结构的前药，也包含在本申请的权利要求中。
以下实施例对本发明做进一步的描述，仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于 本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
N-(3-((2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-1)
步骤1 叔丁基(3-((2-氯-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1)
在50mL底部预先装有磁力搅拌器的圆底烧瓶中，加入叔丁基(3-羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.88g，9.0mmol)和异丙醇(18.0mL)。反应混合物冷却至0℃。2,4-二氯-5-(甲硫基)嘧啶(1.75g，9.0mmol)在0℃下滴加到上述反应混合物中。再将DIPEA(1.9mL，10.8mmol)逐滴加入到上述反应混合物中，将反应混合物在90℃油浴中搅拌4小时。通过TLC监测反应完成后。将固体沉淀滤出并用异丙醇(6mL)洗涤滤饼。所得白色固体在40℃减压下干燥1小时。(1.3g，产率：40％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.22(s,1H),7.44(brs.,1H),7.32(t,J＝8.1Hz,1H),7.10(d,J＝7.9Hz,1H),6.84(d,J＝6.8Hz,1H),6.57(s,1H),2.53(s,3H),1.51(s,9H).ES/MS(M+H)+＝367.9
步骤2 1-(4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(2)
将1-(哌嗪-1-基)乙-1-酮(3.59g,28mmol))和碳酸钾(3.88g,28mmol)加入N，N-二甲基甲酰胺(40mL)中，然后向该悬浮液中加入4-氟-2-甲氧基-1-硝基苯(4.09g,23mmol)并在80℃搅拌过夜。将混合物倾入水中，将固体沉淀滤出。所得固体在50℃真空中干燥，得黄色固体(3.5g,产率：45％)
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.92(d,J＝9.4Hz,1H),6.60(dd,J＝9.4,2.4Hz,1H),6.54(d,J＝2.3Hz,1H),3.92(s,3H),3.60-3.58(m,4H),3.55–3.53(m,2H),3.49–3.47(m,2H),2.06(s,3H).ES/MS(M+H)+＝280.1
步骤3 1-(4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(3)
将1-(4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(3.5g,12.5mmol)溶解于50mL乙醇中，在氮气保护下加入10％钯碳(350mg)。将充满氢气的气球装在反应瓶上，并抽真空3次，直至反应体系中充满氢气。室温下搅拌过夜。用硅藻土滤去反应体系中的不溶物，并用甲醇洗涤。滤液减压旋蒸浓缩，得到黑色油状物。(3.1g,定量转化)
1H NMR(400MHz,DMSO)δ6.54(d,J＝1.9Hz,1H),6.53(d,J＝7.9Hz,1H),6.32(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),4.34(brs.,2H),3.75(s,3H),3.58–3.50(m,4H),2.97–2.91(m,2H),2.90–2.84(m,2H),2.03(s,3H).ES/MS(M+H)+＝250.2
步骤4 叔丁基(3-((2-((4-(4-乙酰基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(4)
将叔丁基(3-((2-氯-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(550mg,1.5mmol)和1-(4-(4-氨基-3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(250mg,1.0mmol)溶于二氧六环(10mL)中，然后加入催化量的三氟乙酸。将反应体系置于90℃的油浴中搅拌过夜。将反应液减压旋蒸浓缩后通过柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇20:1作为洗脱剂)得到橘黄色固体。(174mg,收率:34％)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(s,1H),7.67(s,1H),7.55(s,1H),7.34(s,1H),7.29(s,1H),6.95–6.84(m,1H),6.63(s,1H),6.46(d,J＝1.7Hz,1H),6.21(d,J＝8.2Hz,1H),3.82(s,3H),3.81–3.65(m,2H),3.70–3.50(m,2H),3.22–2.93(m,4H),2.44(s,3H),2.14(s,1H),1.49(s,9H).ES/MS(M+H)+＝580.9
步骤5 1-(4-(4-((4-(3-氨基苯氧基)-5-(甲硫基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(5)
将叔丁基(3-((2-((4-(4-乙酰基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(174mg,0.3mmol)溶于二氯甲烷4mL中，在冰浴条件下，向其中加入5mL三氟乙酸。反应体系移至室温，并在室温条件下搅拌1小时。反应液被减压旋蒸浓缩，然后重新用二氯甲烷溶解，并用1mol/L的碳酸钠水溶液洗涤，接着用盐水洗涤，有几层用无水硫酸钠干燥后减压旋蒸浓缩得到橘黄色固体。(96mg,定量转化)
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.26(s,1H),7.88(s,1H),7.48(d,J＝8.8Hz,1H),7.08(t,J＝8.0Hz,1H),6.61(d,J＝2.5Hz,1H),6.49(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),6.36(t,J＝2.1Hz,1H),6.33–6.28(m,2H),5.29(brs.,2H),3.78(s,3H),3.59–3.56(m,4H),3.12–3.04(m,2H),3.05–2.98(m,2H),2.40(s,3H),2.05(s,3H).ES/MS(M+H)+＝481.0
步骤6 N-(3-((2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-1)
在冰浴条件下丙烯酰氯(9μL,0.11mmol)滴加到1-(4-(4-((4-(3-氨基苯氧基)-5-(甲硫基)嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(48mg,0.10mmol)和二异丙基乙胺(26μL,0.15mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液中。然后在冰浴条件下继续搅拌1小时，将反应液减压旋蒸浓缩，并先后用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥后减压旋蒸浓缩，柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇20:1做为流动相)得到白色固体(35mg,收率:65％)
1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.31(s,1H),8.30(s,1H),7.96(s,1H),7.59(s,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,1H),7.41(t,J＝8.0Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,1H),6.94(d,J＝7.6Hz,1H),6.57(s,1H),6.43(dd,J＝16.7,10.1Hz,1H),6.27(d,J＝16.9Hz,1H),6.19(brs.,1H),5.78(d,J＝10.1Hz,1H),3.75(s,3H),3.56–3.54(m,4H),3.06–3.04(m,2H),2.99–2.97(m,2H),2.42(s,3H),2.04(s,3H).ES/MS(M+H)+＝535.3。
实施例2
N-(3-((2-((2-甲氧基-4-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-2)
合成方法如实施例1；
1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.31(s,1H),8.30(s,1H),7.98(s,1H),7.60(s,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.41(t,J＝8.1Hz,1H),7.34(d,J＝8.5Hz,1H),6.94(d,J＝7.9Hz,1H),6.58(s,1H),6.43(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.27(d,J＝16.9Hz,1H),6.22(brs.,1H),5.78(d,J＝10.2Hz,1H),3.75(s,3H),3.23–3.21(m,4H),3.16–3.14(m,4H),2.93(s,3H),2.42(s,3H).ES/MS(M+H)+＝571.2。
实施例3
N-(3-((2-((4-(4-乙酰基-1,4-二氮杂环庚烷-1-基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-3)
合成方法如实施例1；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.30(s,1H),8.02(brs.,1H),7.60(t,J＝9.6Hz,1H),7.49(s,1H),7.41–7.34(m,3H),6.97(d,J＝8.1Hz,1H),6.43(dd,J＝17.0,2.3Hz,1H),6.30(dd,J＝16.8,10.0,1H),6.19(s,1H),5.92(brs.,1H),5.74(dd,J＝10.0,2.5Hz,1H),3.78(s,3H),3.74(t,J＝5.3Hz,1H),3.63-3.61(m,1H),3.57(d,J＝4.6Hz,1H),3.53–3.51(m,2H),3.51-3.44(m,2H),3.36(t,J＝6.1Hz,1H),2.44(s,3H),2.04(s,3H),1.98–1.93(m,1H),1.92–1.87(m,1H).ES/MS(M+H)+＝549.2。
实施例4
N-(3-((2-((4-((1-乙酰基哌啶-4-基)氨基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-4)
合成方法如实施例1；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.35(s,1H),7.77(brs.,1H),7.39(t,J＝8.1Hz,1H),6.99(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),6.40–6.36(m,4H),6.34(dd,J＝17.0,2.3Hz,1H),5.86(dd,J＝16.8,10.3Hz,1H),5.79–5.65(m,1H),5.46(dd,J＝10.4,2.3Hz,1H),5.00–4.59(m,2H),3.80(s,3H),3.81–3.79(m,1H),3.25–3.14(m,1H),2.68–2.55(m,1H),1.99(s,3H),1.88–1.74(m,2H),1.21–1.07(m,2H).ES/MS(M+H)+＝549.3。
实施例5
N-(3-((2-((2-甲氧基-4-(4-丙酰基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(甲硫基) 嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-5)
合成方法如实施例1；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(s,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(brs.,1H),7.56(s,1H),7.49(s,1H),7.43(t,J＝8Hz,1H),7.42(s,1H),6.98(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),6.44(dd,J＝16.8,1.2Hz,1H),6.43(d,J＝2.4Hz,1H),6.23(dd,J＝16.8,10.2Hz,1H),6.17(s,1H),5.77(dd,J＝10.2,1.1Hz,1H),3.80(s,3H),3.75–3.73(m,2H),3.60–3.58(m,2H),3.03–3.00(m,4H),2.44(s,3H),2.39(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.17(t,J＝7.4Hz,3H).ES/MS(M+H)+＝549.0。
实施例6
N-(3-((2-((4-(4-异丁酰基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-6)
合成方法如实施例1；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(s,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(brs.,1H),7.56(s,1H),7.49(s,1H),7.43(t,J＝8Hz,1H),7.42(s,1H),6.98(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),6.44(dd,J＝16.8,1.2Hz,1H),6.43(d,J＝2.4Hz,1H),6.23(dd,J＝16.8,10.2Hz,1H),6.17(s,1H),5.77(dd,J＝10.2,1.1Hz,1H),3.81(s,3H),3.76–3.74(m,2H),3.65–3.63(m,2H),3.04–3.00(m,4H),2.90–2.73(m,1H),2.44(s,3H),1.15(d,J＝6.8Hz,6H).ES/MS(M+H)+＝563.0。
实施例7
N-(3-((2-((2-甲氧基-4-(4-新戊酰哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧 啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-7)
合成方法如实施例1；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.29(brs.,1H),8.26(s,1H),7.94(s,1H),7.55(s,1H),7.54(d,J＝8.9Hz,1H),7.38(t,J＝7.8Hz,1H),7.29(d,J＝8.5Hz,1H),6.91(d,J＝7.6Hz,1H),6.53(s,1H),6.39(dd,J＝16.6,10.0Hz,1H),6.22(d,J＝15.9Hz,1H),6.15(d,J＝7.8Hz,1H),5.74(d,J＝11.0Hz,1H),3.71(s,3H),3.68–3.59(m,4H),3.04–2.91(m,4H),2.39(s,3H),1.19(s,9H).ES/MS(M+H)+＝577.3。
实施例8
N-(3-((2-((2-甲氧基-4-(4-(2,2,2-三氟乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-8)
合成方法如实施例1；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.33(s,1H),7.69(m,2H),7.51(brs.,1H),7.44(t,J＝8.2Hz,1H),7.40(s,1H),7.37(s,1H),6.99(dd,J＝7.7,1.8Hz,1H),6.44(dd,J＝16.8,1.2Hz,1H),6.43(d,J＝2.4Hz,1H),6.22(dd,J＝16.8,10.2Hz,1H),6.20(s,1H),5.79(dd,J＝10.2,1.0Hz,1H),3.82(s,3H),3.83-3.80(m,2H),3.78–3.71(m,2H),3.14–3.06(m,4H),2.44(s,3H).ES/MS(M+H)+＝589.0。
实施例9
N-(3-((2-((4-(4-乙酰基哌嗪-1-基)-2-(二氟甲氧基)苯基)氨基)-5-(甲硫基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙烯酰胺(XQ-9)
合成方法如实施例1；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(s,1H),7.71(d,J＝8.9Hz,1H),7.64(d,J＝7.8Hz,1H),7.49(s,1H),7.45(s,1H),7.41(d,J＝8.2Hz,1H),7.22(s,1H),6.97(dd,J＝8.1,1.6Hz,1H),6.63(d,J＝2.7Hz,1H),6.44(dd,J＝16.8,1.2Hz,1H),6.44(t,J＝79.6Hz,1H),6.25(dd,J＝16.8,10.2Hz,1H),5.79(dd,J＝10.2,1.1Hz,1H),3.77–3.70(m,2H),3.66–3.52(m,2H),3.11–2.97(m,4H),2.45(s,3H),2.13(s,3H).ES/MS(M+H)+＝571.0。
实施例10
5-(硫醚基)嘧啶类化合物对EGFR野生型和EGFR L858R/T790M双突变的激酶IC50测试，
EGFR WT为野生型表皮生长因子受体，EGFR L858R/T790M为带有第858位氨基酸有亮氨酸突变成精氨酸以及790位氨基酸有苏氨酸突变成甲硫氨酸的表皮生长因子受体，
激酶活性检测：
用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测激酶磷酸化底物的能力，计算化合物对激酶活性的抑制作用，采用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行野生型EGFR和EGFR T790M/L858R突变的激酶区表达，经镍柱(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化。ELISA主要步骤如下：酶反应底物Poly(Glu,Tyr)4:1用无钾离子的PBS(10mM磷酸钠缓冲液，150mM NaCl,pH 7.2-7.4)稀释成20μg/mL，于37℃反应12-16h包被酶标板，然后用含0.1％Tween-20的PBS(T-PBS)洗板，每孔加入用反应缓冲液(50mM HEPES pH 7.4,50mM MgCl2,0.5mM MnCl2,0.2mM Na3VO4,1mM DTT)稀释的ATP(终浓度5μM)溶液，加入不同浓度的待测化合物或溶剂对照，然后分别加入相应激酶启动反应，37℃摇床反应1h，T-PBS洗板三次，加入抗体PY99100μL/孔(用含BSA的T-PBS稀释)于37℃摇床反应0.5h，T-PBS洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠的IgG 100μL/孔(用含BSA的T-PBS稀释)，37℃摇床反应0.5h，再次洗板后，加入2mg/mL的OPD显色液100μL/孔，25℃避光反应1-10min，加入2M H2SO4终止反应，用可调波长微孔板酶标仪SPECTRA MAX 190读数，波长为492nm，IC50值由抑制曲线得到。表2显示了化合物激酶活性。
表2
实施例11EGFR活性的细胞水平测试
采用磺酰罗丹明B(sulforodamine B，SRB)法检测化合物对细胞增殖抑制作用，选用EGFR依赖细胞株：人表皮细胞癌A431细胞株和人非小细胞肺癌NCI-H1975细胞株(均购自ATCC)。细胞以一定密度接种于96孔板，贴壁过夜，加入不同浓度化合物作用72h，用预冷的10％三氯乙酸于4℃固定1h，蒸馏水洗去固定液后烘干，使用4mg/mL的SRB溶液(溶于1％醋酸)室温染色15分钟，洗去多余染色液，室温烘干，在使用酶标仪检测前加入10mmol/L Tris 100μL每孔，约15分钟后，SRB完全溶解，使用多功能酶标仪(VERSAmax,Molecular Devices)测定515nm的吸收波长，抑制率计算公式为：[1–(A515treated/A515control)]×100％。表3显示了化合物细胞活性。
表3