一种用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒的制作方法

具体而言，本发明涉及用于PCR扩增人PDE9A基因的引物组、包含该引物组的用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒及使用该引物组的PCR扩增方法。
背景技术：
：自从孕妇血浆的游离DNA(cfDNA，cellfreeDNA)中存在胎儿游离DNA(cellfreefetalDNA)这个现象被发现以来，研究者们就利用这个现象来进行多种研究和应用，例如无创产前DNA检测、胎儿性别确定、胎儿染色体异常检测、单基因遗传病筛查、妊娠相关疾病筛查等。目前有通过检测SRY基因来确定孕妇血浆中胎儿游离DNA的浓度的方法，但是SRY基因是男胎特有基因，对于孕有女胎的孕妇来说就无法检测出胎儿游离DNA的浓度。后来，科学家们通过甲基化测序等手段发现孕妇和胎儿基因组在甲基化水平上差异很大，从而找到了一些胎儿特异性的甲基化基因，目前检测胎儿游离DNA浓度的方法就集中在检测甲基化差异方面。PDE9A基因位于21q22.3，在孕妇外周血中为甲基化状态，而在胎儿组织中为非甲基化状态。理论上，孕妇血浆中的胎儿游离DNA(cffDNA)可以通过胎儿特异的表观遗传学标记——非甲基化的PDE9A基因(U-PDE9A)来测定。U-PDE9A也可以作为无创检测21三体的一个标志物。利用甲基化敏感酶消化后，来自胎儿的PDE9A基因被消化降解掉，游离DNA中只剩下来自母亲的PDE9A基因。通过这种方法我们可以有效的检测孕妇血浆中游 离DNA含量，准确的检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的浓度，有助于为目前的无创产前筛查方法提供指导和理论依据。然而，作为一种有临床应用价值的cffDNA检测方法，需要保证测定值与真实值之间有良好的相关性(R2值接近1)。因此，上述理论上可行的方法离实际应用还相去甚远。备注：cffDNA，表示的是cellfreefetalDNA，游离胎儿DNA；而cfDNA是cellfreeDNA，游离DNA。参考文献[1]PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum.Lancet1997.350:485-487.[2]Cell-freefetalDNAplasmaextractionandreal-timepolymerasechainreactionquantification.MethodsMolMed2007.132:51-63.[3]QuantificationofCell-freeDNAinnormalandcomplicatedpregnancies:overcomingbiologicalandtechnicalissues,PLoSOne2014.9(7):1-7.[4]Cell-freeFetalDNAandCell-FreeTotalDNAlevelsinspontaneousabortionwithfetalchromosomalaneuploidy,PLoSOne2013.8:2.[5]Non-invasiveepigeneticdetectionoffetaltrisomy21infirsttrimestermaternalplasma.PLoSOne2011.6(11):e27709.[6]Non-invasiveprenatalaneuploidytestingatchromosomes13,18,21,X,andY,usingtargetedsequencingofpolymorphicloci.PrenatDiagn2012.32(13):1233-1241.技术实现要素：鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够使得胎儿游离DNA的测定值与真实值之间有良好的相关性的、用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒。本发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过使用特定用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，可以使采用Q-PCR方 法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间具有良好的相关性，从而完成了本发明。即，本发明包括：1.一种引物组，其由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。2.根据项1所述的引物组，其用于扩增人PDE9A基因。3.根据项2所述的引物组，其中，所述人PDE9A基因来源于孕妇血浆游离DNA。4.一种用于扩增人PDE9A基因的试剂盒，其包含项1-3任一项所述的引物组。5.根据项4所述的试剂盒，其还包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的绝对定量用标准品。6.一种扩增人PDE9A基因的方法，其使用项1-3任一项所述的引物组作为引物进行PCR扩增。7.根据项6所述的方法，其使用从孕妇血浆中提取的游离DNA作为模板。8.根据项6所述的方法，其使用经甲基化酶消化的从孕妇血浆中提取的游离DNA作为模板。9.根据项6所述的方法，其中，所述PCR扩增的变性温度为93℃-98℃，优选94℃-96℃。10.根据项6所述的方法，其中，所述PCR扩增的退火温度为52℃-62℃，优选55℃-60℃。11.根据项6所述的方法，其中，所述PCR扩增的延伸温度为72℃。12.一种用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，其包含权利要求1所述的引物组。13.根据项12所述的试剂盒，其还包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的绝对定量用标准品。14.一种用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，其包括：用于对从孕妇血浆中提取的游离DNA进行消化的甲基化酶。15.根据项14所述的试剂盒，其还包括：用于测定从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂；以及用于测定经所述甲基化酶消化后的从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂。16.根据项14所述的试剂盒，其还包括下述引物组：所述引物组由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。17.根据权利要求14所述的试剂盒，其还包含核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的绝对定量用标准品。18.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述甲基化酶是选自BstUI、HhaI和HpaII中的一种或多种。发明效果通过使用本发明的用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，能够使采用Q-PCR方法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间具有良好的相关性。附图说明图1显示了使用本发明的引物组扩增人PDE9A基因的情况下，采用Q-PCR方法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间具有良好的相关性。图2显示了使用对比例的引物组扩增人PDE9A基因的情况下，采用Q-PCR方法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间的相关性不良。发明的具体实施方式在一个方面中，本发明提供一种引物组(本发明的引物组)，其由上游引物及下游引物组成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。SEQIDNO：15’-TCGGTGAGTGCGCGCTGC-3’(也称作PDE9A-FS)SEQIDNO：25’-CAGCCATCCCGAAAAGGCGA-3’(也称作PDE9A-RS)所述引物组可以在针对人PDE9A基因的PCR扩增中作为引物使用。本说明书中，人PDE9A基因包括完整的人PDE9A基因，也包括其片段。在另一个方面中，本发明提供一种用于扩增人PDE9A基因的试剂盒(本发明的扩增试剂盒)，其包含本发明的引物组。对于本发明的试剂盒而言，本发明的引物组是必须的，其中，上游引物和下游引物可以分别装在不同容器内，也可以装在同一容器内。除了包含本发明的引物组以外，本发明的试剂盒还可以包含例如用于PCR扩增的其他试剂，包括但不限于选自dNTPS、MgSO4、Taq酶、DMSO、Tween20、甜菜碱、荧光染料、PCR反应缓冲液、绝对定量用标准品、双蒸水(ddH2O)等中的至少一种，本领域技术人员可根据需要适当选择。此外，本发明还提供一种用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒(本发明的测定试剂盒)，其包含本发明的引物组或本发明的扩增试剂盒。这里，作为绝对定量用标准品，优选使用核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的绝对定量用标准品。优选地，本发明的测定试剂盒还可以包括：用于测定从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂；和/或用于测定经所述甲基化酶消化后的从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂。这里，所述用于测定从孕妇血浆中提取的游离DNA的浓度的试剂包括但不限于：dNTPS、MgSO4、Taq酶、DMSO、Tween20、甜菜碱、荧光染料、PCR反应缓冲液；所述用于测定经所述甲基化酶消化后的从孕妇血浆中提取 的游离DNA的浓度的试剂包括但不限于：dNTPS、MgSO4、Taq酶、DMSO、Tween20、甜菜碱、荧光染料、PCR反应缓冲液。本发明的引物组可适用于在荧光实时定量PCR中作为引物组对人PDE9A基因进行扩增。在使用本发明的引物组扩增人PDE9A基因的情况下，采用Q-PCR方法获得的胎儿游离DNA的测定值与真实值之间能够具有良好的相关性。因此，在另一个方面中，本发明提供一种扩增人PDE9A基因的方法(本发明的扩增方法)，其使用本发明的引物组作为引物进行PCR扩增(例如荧光实时定量PCR)。PCR(聚合酶链反应)扩增是本领域技术人员熟知的，其一般通过一定的PCR反应程序(温度循环)来实现。所述PCR反应程序一般包括变性、退火、延伸等步骤。对本发明的扩增方法而言，变性步骤可以在93-98℃(优选94-96℃)进行0.1～10分钟(优选0.2～2分钟)；退火步骤可以在52-62℃(优选55-60℃)进行0.1～10分钟(优选0.2～2分钟)；延伸步骤可以在72℃进行0.1～10分钟(优选0.5～5分钟)；由上述变性、退火、延伸步骤组成的循环可以进行10-50次(优选25-45次)。优选地，经历上述温度循环前的模板可以在93-98℃(优选94-96℃)进行1～60分钟(优选5～20分钟)的热预变性。本发明的扩增方法可以使用各种样本作为模板来进行，只要样本中包含人PDE9A基因即可。优选地，所述模板可以是从孕妇血浆中提取的游离DNA，或者经甲基化酶消化的从孕妇血浆中提取的游离DNA。例如，在基于荧光实时定量PCR、通过扩增人PDE9A基因测定孕妇血浆中的胎儿游离DNA量的情况下，可以将从孕妇血浆中提取的游离DNA平均分为两份，一份直接进行荧光实时定量PCR(测定的是孕妇血浆中总游离DNA的量)，一份先经过甲基化酶消化再进行荧光实时定量PCR(测定的是孕妇血浆中母亲游离DNA的量)，两者的差值即为孕妇血浆中的胎儿游离DNA的量。从孕妇血浆中提取游离DNA的方法是本领域技术人员已知的。此外，对游离DNA进行甲基化酶消化的方法也是本领域技术人员已知的，可以使用的甲基化酶包括例如BstUI、HhaI、HpaII等，但不限于此。实施例以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是用于解释本发明，并非对本发明的限定。实施例1分别提取孕妇(孕龄20周)基因组DNA和羊水中胎儿基因组DNA(下称羊水DNA)，精确定量后，利用超声波打断仪将基因组DNA打断至200bp左右的片段，模拟血浆游离DNA的状态。片段化后的羊水DNA模拟血浆中的胎儿游离DNA，片段化后的孕妇基因组DNA模拟血浆中的母亲游离DNA，将两者以已知比例混合，混合成不同胎儿游离DNA浓度的样本，然后采用本发明的引物组作为人PDE9A基因的扩增引物，基于Q-PCR方法进行胎儿游离DNA浓度测定，样本中胎儿游离DNA浓度的测定值及真实值如表1所示。表1样本胎儿游离DNA浓度真实值胎儿游离DNA浓度测定值Sample12％1.5％Sample26％5.2％Sample39％8.9％Sample413％12.5％Sample515％15.4％Sample617.2％18％Sample719.5％20％上述测定值与真实值之间的相关性如图1所示，可知R2高达0.997。本实施例中，首先将各待测样本均分成两份，一份直接进行荧光实时定量PCR，一份先采用常规方法进行甲基化酶消化再进行荧光实时定量PCR。荧光实时定量PCR的条件如下：反应程序：95℃10min；(95℃15sec,60℃30sec,72℃for30sec)45cycles。该荧光实时定量PCR中使用的绝对定量用标准品的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。SEQIDNO：35’-TGCCTCGGTGAGTGCGCGCTGCGGGCTCTGCCCGGTGACGCCACGCGGCCTCCTCGCCTTTTCGGGATGGCTGGGAG-3’对比例1像实施例1那样进行了样本中胎儿游离DNA浓度的测定，不同的是：替代本发明的引物组使用了下述引物组作为人PDE9A基因的扩增引物。样本中胎儿游离DNA浓度的测定值及真实值如表2所示。引物组序列如下：FS：ACCGGCCTGCCTCGGTGAGTGRS：GCCCCTCCCAGCCATCC表2样本胎儿游离DNA浓度真实值胎儿游离DNA浓度测定值Sample12％0.8％Sample26％7.6％Sample39％13％Sample413％9.4％Sample515％11％Sample617.2％15.6％Sample719.5％18.4％上述测定值与真实值之间的相关性不好，如图2所示，R2仅为0.799。可见使用这对引物的检测效果远远低于本发明提供的引物对的效果。还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用 于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。工业实用性根据本发明，提供了一种能够使得胎儿游离DNA的测定值与真实值之间有良好的相关性的、用于扩增PDE9A基因的引物组，以及包含该引物组的用于测定孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度的试剂盒。当前第1页1 2 3