一种冠状动脉疾病风险评估试剂盒及风险评估方法与流程

本发明涉及疾病风险评估领域，尤其涉及一种冠状动脉疾病风险评估试剂盒及风险评估方法。

背景技术：

当今社会，冠心病(CAD)和心肌梗死(MI)引起的发病率和死亡率是全球主要的健康负担。目前，冠心病的临床因素有很多，如性别、年龄、胸痛类型、吸烟史、糖尿病等。此外，动脉粥样硬化的发生与炎症密切相关。一些炎症细胞与因子聚集在损伤的内皮周围，促使动脉粥样硬化的形成和易损斑块的破裂。由于血液循环，这些变化间接的表现在外周血中，定量测定外周血中相关基因的表达量可反映出冠心病的严重程度。

现有技术中，临床上冠心病常用的检测方法有：心电图，超声心动图，负荷试验，CT冠状动脉造影，冠状动脉造影(CAG)等。心电图，超声心动图，负荷试验由于敏感性和特异性有限，因此，其阴性的检查结果并不能排除冠心病。所以冠状动脉造影(CAG)仍然是诊断冠心病的“金标准”，但由于技术相对复杂、有创、费用高，而且存在一定风险，致使很多患者难以接受，另外据统计，进行冠状动脉造影(CAG)的患者中只有不到1/3进行介入治疗，大部分的患者进行冠状动脉造影(CAG)只是为了确定诊断。而CT冠状动脉造影(CTA)拥有结果准确、创伤小、费用相对低廉的优点，已较好地用于临床。但是由于CT冠状动脉造影(CTA)的阴性预测值高，因此CT冠状动脉造影(CTA)的阴性诊断价值较大，而阳性诊断价值有限，特别是对于狭窄程度的判断，所以CT冠状动脉造影(CTA)主要用于筛选。

近两年，高通量测序技术在生物技术领域有重要突破，新一代的测序技术将传统的Sanger测序效率提高了数百倍，同时价格也大大下降。高通量测序技术的出现使得许多的极有前景的生物医药应用成为可能。而转录组是指特定组织或细胞在某一环境或生理条件下所转录表达的所有RNA的总和，通常感兴趣的是编码蛋白的mRNA，所以高通量测序技术与转录组学结合为研究基因表达及调控提供了重要的手段和方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中的一些冠状动脉疾病的风险评估使用的方法存在着费用高、风险大的问题，还有一些评估方法存在着虽然费用低，但是判断价值有限的问题，所以现有技术中的冠状动脉疾病风险评估方法不能够快速安全且费用低廉的评估患者冠状动脉栓塞的风险。

有鉴于此，本发明提供一种冠状动脉疾病的风险评估方法，可包括：

含RNA酶抑制剂的抗凝管抽取外周血作为样本；

外周血RNA提取试剂盒提取所述样本中的外周血RNA；

通过RNA反转录试剂盒对所述外周血RNA进行反转录并构建cDNA文库；

对所述cDNA文库进行高通量测序得到测序序列；

将所述测序序列与人类RNA基因组数据库进行序列比对得到唯一比对上目的基因的测定序列；

通过100-(唯一比对上单一基因的测定序列数/唯一比对上目的基因的测定序列总数)*10000得到基因表达量公式；

将每个基因代入所述基因表达量公式计算得到每个基因的基因表达量；

通过将每个基因的基因表达量代入冠脉狭窄评分公式计算冠脉狭窄评分；

判断所述冠脉狭窄评分与0的大小，若所述冠脉狭窄评分小于0，则没有 冠状动脉疾病的患病风险。

本发明还提供了一种冠状动脉疾病的风险评估试剂盒，可包括采血管、RNA提取试剂盒和RNA反转录试剂盒，所述采血管用于采取外周血样本，所述RNA提取试剂盒用于从所述采血管中采取的外周血样本中提取外外周血RNA，所述RNA反转录试剂盒用于对所述外周血RNA进行反转录并构建cDNA文库。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明中，通过对外周血样本中的RNA进行高通测序，并比对基因，计算冠状狭窄评分，通过评分评估患者冠状动脉栓塞的风险。该方法无需对患者进行创伤性的操作，拥有无创的优点。相比于CT冠脉造影，本发明提供的方法具有准确、无创的优势，相比于心电图和心脏负荷试验的准确率也大大提高。因此，本发明通过检测患者体内RNA水平的变化，快速安全的评估了患者冠状动脉栓塞的风险，具有良好的临床意义和实用价值。

附图说明

图1为本发明的一种冠状动脉疾病的风险评估方法流程图；

图2为本发明的一种冠状动脉疾病的风险评估试剂盒结构图。

具体实施方式

本发明实施例提供了一种冠状动脉疾病的风险评估方法，能够解决现有技术中的一些冠状动脉疾病的风险评估使用的方法存在着费用高、风险大的问题，还有一些评估方法存在着虽然费用低，但是判断价值有限的问题。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

请参阅图1，为本发明提供的一种冠状动脉疾病的风险评估方法流程图，由图1可以看出，所述方法包括：

S101、含RNA酶抑制剂的抗凝管抽取外周血作为样本；

S102、外周血RNA提取试剂盒提取所述样本中的外周血RNA；

S103、通过RNA反转录试剂盒对所述外周血RNA进行反转录并构建cDNA文库；

S104、对所述cDNA文库进行高通量测序得到测序序列；

S105、将所述测序序列与人类RNA基因组数据库进行序列比对得到唯一比对上目的基因的测定序列；

S106、通过100-(唯一比对上单一基因的测定序列数/唯一比对上目的基因的测定序列总数)*10000得到基因表达量公式；

S107、将每个基因代入所述基因表达量公式计算得到每个基因的基因表达量；

S108、通过将每个基因的基因表达量代入冠脉狭窄评分公式计算冠脉狭窄评分；

S109、判断所述冠脉狭窄评分与0的大小，若所述冠脉狭窄评分小于0，则没有冠状动脉疾病的患病风险。

具体的，本发明提供的方法使用通过含有RNA酶抑制剂的抗凝管抽取患者的外周血。在得到患者外周血后，可以配套使用外周血RNA提取试剂盒进行RNA提取，得到所述样本中的外周血RNA。使用市售的RNA反转录试剂盒将RNA进行反转录，并构建获得cDNA文库。通过高通量测序平台对构建的cDNA文库进行测序得到测序序列，然后将所述测序序列与相关的数据库进行序列比对得到唯一比对上目的基因的测定序列。最后计算冠脉狭窄评分， 通过判断冠脉狭窄评分与0的大小来评估患者冠状动脉栓塞的风险。

本实施例提供的一种冠状动脉疾病的风险评估方法通过对外周血样本中的RNA进行高通测序，并比对基因，计算冠状狭窄评分，通过评分评估患者冠状动脉栓塞的风险。该方法无需对患者进行创伤性的操作，拥有无创的优点。相比于CT冠脉造影，本发明提供的方法具有准确、无创的优势，相比于心电图和心脏负荷试验的准确率也大大提高。因此，本发明通过检测患者体内RNA水平的变化，快速安全的评估了患者冠状动脉栓塞的风险，具有良好的临床意义和实用价值。

为了便于对本发明提供的一种心电检测装置的有益效果有一个更直观的理解，本发明还提供了实施例2，结合图1一种冠状动脉疾病的风险评估方法流程进行详细描述。

S101、含RNA酶抑制剂的抗凝管抽取外周血作为样本；

具体的，通过含RNA酶抑制剂的抗凝管抽取患者外周血，可于室温(16-25℃)保存5天，2-8℃保存7天。需要说明的是，也可以使用普通抗凝管抽无患者外周血，这种方式获得的外周血样本则需要在4℃保存，且必须在4小时以内进行检测。

还需要说明的是，所述外周血样本的保存还可以使用血卡代替。

S102、外周血RNA提取试剂盒提取所述样本中的外周血RNA；

具体的，得到患者外周血后，可配套使用外周血RNA提取试剂盒进行RNA提取，提取量至少1ng，提取方法可参见试剂盒说明书。

S103、通过RNA反转录试剂盒对所述外周血RNA进行反转录并构建cDNA文库；

具体的，所述构建cDNA文库可包括：对所述外周血RNA反转录后得到的cDNA扩增富集得到全长cDNA；将所述全长cDNA破碎成片段；对所述片段进行筛选得到200bp范围的cDNA片段；对所述200bp范围的cDNA片 段进行平末端修复并加接头，然后进行PCR扩增，得到所述cDNA文库。

需要说明的是，RNA反转录试剂盒可以为市面销售的试剂盒，具体方法可以参见cDNA转录说明书。

S104、对所述cDNA文库进行高通量测序得到测序序列；

具体的，在得到所述cDNA文库后，通过高通量测序得到测序序列。优选的，高通量测序平台为Illumina测序平台或Ion torrent测序平台中的任意一种。优选的，可以通过对Illumina测序所得序列进行去接头、去低质量、去污染等处理，最终获得干净的mRNA分子序列。

S105、将所述测序序列与人类RNA基因组数据库进行序列比对得到唯一比对上目的基因的测定序列；

具体的，将上述获得的干净的mRNA分子序列与人类RNA基因组数据库进行序列比对，可以获得唯一比对上目的基因的测定序列。优选的，所述人类RNA基因组数据库包括repeatmarker数据库、Genbank数据库、Rfam(10.1)数据库、UCSC数据库和piRNA数据库中的一种或多种。优选的，可以通过使用Microsoft SOAP Toolkit 2.0软件将干净的mRNA分子序列与人类RNA基因组数据库进行序列比对。

需要说明的是，所述唯一比对上目的基因的测定序列包括AF28、AQP9、CASP5、CD3D、CD79B、CLEC4E、HNRNPF、IL18RAP、IL8RB、KCNE3、KLRC4、NCF4、RPL28、S100A12、S100A8、SLAMF7、SPIB、TFCP2、TLR4、TMC8、TNFAIP6、TNFRSF10C。

S106、通过100-(唯一比对上单一基因的测定序列数/唯一比对上目的基因的测定序列总数)*10000得到基因表达量公式；

具体的，通过100-(唯一比对上单一基因的测定序列数/唯一比对上目的基因的测定序列总数)*10000来描述基因表达量。可以理解的是，唯一比对上目的基因的测定序列总数即为前面所述AF28、AQP9、CASP5、CD3D、 CD79B、CLEC4E、HNRNPF、IL18RAP、IL8RB、KCNE3、KLRC4、NCF4、RPL28、S100A12、S100A8、SLAMF7、SPIB、TFCP2、TLR4、TMC8、TNFAIP6、TNFRSF10C这22个目的基因的测定序列总数。

S107、将每个基因代入所述基因表达量公式计算得到每个基因的基因表达量；

具体的，可以将每个比对基因都代入到所述基因表达量公式中，得到每个基因的表达量。

S108、通过将每个基因的基因表达量代入冠脉狭窄评分公式计算冠脉狭窄评分；

具体的，将上述得到的每个基因的表达量代入到所述冠脉狭窄评分公式中，计算得到冠脉狭窄评分。

优选的，所述冠脉狭窄评分公式可以包括

1)定义Norm1＝RPL28＝22.13；

2)定义Norm2＝(0.5*HNRPF+0.5*TFCP2)；

3)定义NKup＝(0.5*SLAMF7+0.5*KLRC4)4)；

4)定义Tcell＝(0.5*CD3D+0.5*TMC8)；

5)定义Bcell＝(2/3*CD79B+1/3*SPIB)；

6)定义Neut＝(0.5*AQP9+0.5*NCF4)；

7)定义Nup＝(1/3*CASP5+1/3*IL18RAP+1/3*TNFAIP6)；

8)定义Ndown＝(0.25*IL8RB+0.25*TNFRSF10C+0.25*TLR4+0.25*KCNE3)；

9)定义SCA1＝(1/3*S100A12+1/3*CLEC4E+1/3*S100A8)；

10)定义AF2＝AF289562；

11)定义女SEX＝0，男SEX＝1；

12)定义Intercept女：INTERCEPT＝1.821+0.123*(年龄-60)，结果为负则 设为0；

Raw Score＝INTERCEPT-0.755*(Nup-Ndown)-0.308*SEX*(SCA1-Norm1)-0.548*(1-SEX)*(SCA1-Neut)-0.406*(NKup-Tcell)-0.137*(Bcell-Tcell)-0.482*SEX-0.246(AF2-Norm2)；

最终得分Final Score＝RawScore*40/4.52。

可以理解的是，所述冠脉狭窄评分公式中的每个公式定义的如Norm1、Norm2等内容，只是作为一个变量，方便计算冠脉狭窄评分，没有实际含义。

S109、判断所述冠脉狭窄评分与0的大小，若所述冠脉狭窄评分小于0，则没有冠状动脉疾病的患病风险。

具体的，将上述得到的冠脉狭窄评分的最终得分与0进行比较，通过判断冠脉狭窄评分与0的大小来评估患者的冠状动脉疾病的患病风险。

其中，若所述冠脉狭窄评分小于0，则评估患者没有冠状动脉疾病的患病风险，即结果判断：Final Score<0则患者正常。

为了更清楚的理解本发明提供的一种冠状动脉疾病风险评估方法的评估过程，还提供了实施例3，以实际患者为例详细阐述所述冠状动脉疾病风险评估方法的工作过程。

(1)优选的，女性患者，年龄51岁，在患者冠脉造影之前，抽取患者外周血3ml，收集在Tempus^TM Blood RNA Tube中，于4℃保存3天。

(2)优选的，用Tempus^TM Spin RNA Isolation Kit分离纯化RNA，具体操作可参见试剂盒说明书，最终获得760ngRNA。

(3)优选的，使用SMARTer PCR cDNA synthesis kit试剂盒对上述提取得到的760ng RNA进行反转录及相应的扩增富集，具体操作可见反转录说明书。

(4)优选的，利用Covaris超声波DNA破碎仪，按照仪器说明书将富集的全长cDNA破碎成片段。

(5)优选的，用XP(核酸纯化试剂盒)进行片段筛选，选择200bp范围的cDNA片段。

(6)优选的，用Ultra^TMDNA Library Prep Kit for Illumina(用于Illumina的超DNA文库试剂盒)进行平末端修复，加接头。

(7)优选的，用Multiplex Oligos for(用于Illumina的多样本接头引物试剂盒)进行PCR扩增，得到340ng cDNA文库。

(8)优选的，使用Illumina NextSeq 500测序平台对测序序列进行高通量测序，结果如表1所示：

表1：测序基本数据分析

(9)使用Microsoft SOAP Toolkit 2.0软件将干净的mRNA分子序列与人类RNA基因组数据库进行序列比对，然后将每个基因代入到基因表达量公式中，即代入100-百分比*10000结果带入公式计算结果如表2所示：

表2：测序结果分布表

需要说明的是，其中百分比为唯一比对上单一基因的测定序列数/唯一比对上目的基因的测定序列总数。

(10)将每个基因的表达量代入到冠脉狭窄评分公式中，最终计算得分为-14.8，该得分很明显小于0，则最终评估该51岁女性患者没有冠状动脉疾病的患病风险。

本发明实施例提供的一种冠状动脉疾病风险评估方法无需对患者进行创伤性的操作，具有无创的优点，同时通过临床验证，阴性准确率可达96％，灵敏度89％，特异性52％，尤其适用于疑似患者的排除，相比于CT冠脉造影拥有准确，无创的优势，相比于心电图和心脏负荷试验的准确率大大提高。

另外据统计，60％以上接受冠脉造影的患者其实并没有冠心病，因此对于阴性患者的排除显得尤为必要，本发明实施例通过检测患者体内RNA水平的 变化，快速安全的评估患者冠状动脉栓塞的风险，具有良好的临床意义和实用价值。

另外，本发明还相应提供了一种冠状动脉疾病的风险评估试剂盒，具体参照附图2所示，可以包括采血管、RNA提取试剂盒和RNA反转录试剂盒，所述采血管用于采取外周血样本，所述RNA提取试剂盒用于从所述采血管中采取的外周血样本中提取外外周血RNA，所述RNA反转录试剂盒用于对所述外周血RNA进行反转录并构建cDNA文库。

本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”“第四”等(如果存在)是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的实施例能够以除了在这里图示或描述的内容以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。