寡营养细菌组合及在抑制生物浸出中黄钾铁矾生成的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种可抑制生物浸出过程中黄钾铁矾生成的寡营养细菌组合。

背景技术：

根据现有研究知道，黄铜矿难用于生物浸出的原因不仅是其具有较高的晶格能，更重要的是在浸出过程中矿物表面会生成一层致密的钝化膜，从而阻碍营养物质、微生物和反应产物在矿物表面与溶液之间的传递，并抑制铜的持续浸出。而这层钝化膜的成分及其生成机制与矿物表面的吸附微生物、胞外多聚物、矿物分解产物和溶液中生成产物等有着密切的联系。一般认为，浸矿微生物吸附到矿物表面后，通过产生胞外多聚物富集三价铁离子，从而氧化分解黄铜矿。黄铜矿分解释放的单质硫会附着在胞外多聚物上面，成为影响矿物浸出的一部分。随着反应的进行，溶液中的氧化还原地位和三价铁离子浓度逐步升高，各种铁矾沉淀会随之产生。另外，由于浸矿系统中胞外多聚物一旦生成，很难降解或溶解，它们会一直覆盖在矿物表面，从而介导各类沉淀物质覆盖于矿物表面。因此，可以认为钝化膜就是指存在于矿物表面与溶液之间，阻碍矿物持续分解的一层致密的由无机物和有机物共同组成的物质，它们主要包括矿物分解过程中产生的单质硫和非溶性硫化合物，浸出系统中生成的各种铁矾沉淀(主要指黄钾铁矾)，吸附微生物本身及其分泌的胞外多聚物，部分浸出副产物如硫酸铅等。

黄钾铁矾(KFe₃(OH)₆(SO₄)₂)是生物冶金过程中一种常见的浸出产物，并覆盖于矿物表面。当浸出系统中黄钾铁矾较多时，它们会在矿物表面结合其他物质形成一层致密的钝化膜，从而抑制黄铜矿的持续浸出。有研究表明，浸矿系统中黄钾铁矾一旦生成，比较难以去除。因此，减少或阻碍黄钾铁矾沉淀的形成对黄铜矿生物浸出尤其重要。

生物浸出体系以及酸性矿坑水中的有机碳浓度往往低于20mg/l，是典型的寡营养环境，其中生长着丰富的寡营养微生物。在硫化矿的生物浸出体系中，寡营养细菌的主要作用是分解具有浸矿功能的细菌产生的有机代谢物，从而消除有机废物对浸矿微生物的毒害，并进而促进矿物的浸出效果。到目前为止，科学研究者已经从该环境中分离出了许多寡营养微生物，例如Alicyclobacillus spp.、Acidocella spp.、Acidisphaera spp.、Picrophilus spp.、Acidobacterium spp.、 Thermoplasma spp.、Acidomonas spp.等。

Alicyclobacillus(脂环酸芽孢杆菌属细菌)是一类嗜酸耐热、细胞膜中往往含有ω-环状脂肪酸结构的芽孢杆状细菌，由Wisotzkey等在1992年命名成立。该属细菌广泛存在于酸性果汁饮料、矿山、热泉和火山附近土壤等酸热环境中。目前对该属细菌的研究主要集中在食品防腐领域中。多项研究表明该属细菌具有广泛的底物利用特性，可以氧化Fe²⁺、元素硫以及硫化矿等，在厌氧或微氧的条件下可以还原Fe(OH)₃以及针铁矿等铁的沉淀物中的Fe³⁺，因此该属细菌在生物冶金中具有巨大应用潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一个寡营养细菌组合。该菌组合可以利用外加碳源，还原体系中的三价铁离子，从而抑制黄钾铁矾的生成。

本发明的第二个目的是提供一种可以分离培养寡营养细菌组合的培养基。

本发明的第三个目的是提供一种可以富集培养寡营养细菌组合的培养基。

本发明的第四个目的是提供一种寡营养细菌的富集、分离培养方法。

本发明的第五个目的是提供一种利用寡营养细菌组合体系抑制黄铜矿生物浸出过程中黄钾铁矾生成的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种寡营养细菌组合，由脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A，脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B和脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-AP-AC组成；

其中，脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2012年12月26日，保藏编号为：CGMCC No.7038；

脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2012年12月26日，保藏编号为：CGMCC No.7039；

脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-AP-AC的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2012年12月26日，保藏编号为：CGMCC No.7040。

优选地，所述脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A，脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B和脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-AP-AC的比例为1：1：1。

本发明还提供用于分离培养上述寡营养细菌组合的培养基为：0.25g酵母粉；0.5g蛋白胨；0.25g NaCl和1000ml蒸馏水，混匀后添加吉兰胶30g/L，调pH至3.0，121℃灭菌25分钟。

本发明还提供用于富集培养上述寡营养细菌组合的培养基为：0.25g酵母粉，0.5g蛋白胨，0.25g NaCl和1000ml蒸馏水，调pH至3.0，121℃灭菌25分钟。

本发明还提供所述的寡营养细菌组合的培养方法为：将寡营养细菌组合接种入上所述的培养基中，在30-55℃的温度下，100rpm摇床培养3-20天。

如上所述的寡营养细菌，其获得方法为：

所述寡营养细菌组合的样品来自江西德兴铜矿采集矿堆浸矿堆，经过富集、培养、纯化步骤获得纯菌，采用分子生物学技术确定菌种的系统发育地位，技术路线为：总DNA提取→16S rDNA片段扩增→测定序列→Blast比较分析；

本发明通过对照试验进行了Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC按1：1：1组合对黄铜矿的的生物浸出的影响实验研究，利用X-射线衍射光谱(XRD)分析技术，探索Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC在黄铜矿生物浸出中对黄钾铁矾的影响。

具体方法为：向200mL普通自来水中加入5-10w/v％黄铜矿矿粉和0.05-0.5w/v％酵母粉，酸平衡至pH1.6-1.75；待矿物进行酸平衡之后，开始进行生物浸出实验，设置4组生物浸出实验，分别为空白对照组，不接种任何细菌培养物；自养菌群组，接种已经驯化好的自养菌群Acidithiobacillus caldus OY(CCTCC NO：M2010356)；寡营养细菌组，接种Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC(1：1：1)；4，混合菌组，同时接种数量比例为1:1的自养菌群Acidithiobacillus caldus OY(CCTCC NO：M2010356)和Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC(1：1：1)。每组实验设置3个平行重复。4种浸矿体系的矿渣进行了X-射线衍射光谱(XRD)分析。

其中所用Acidithiobacillus caldus OY为可用于黄铜矿的浸矿微生物，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏时间：2010年12月17日，保藏编号：CCTCC NO：M2010356。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种寡营养细菌组合，及其培养基和富集、分离培养方法，以 及该寡营养菌组合在抑制生物浸出过程中黄钾铁矾生成中的应用。该菌组合可以利用外加碳源，还原体系中的三价铁离子，从而抑制黄钾铁矾的生成总量，并且即使形成黄钾铁矾也不是包裹于矿石表面，而是成为絮状颗粒聚集在一起形成团块状，不影响黄铜矿矿石的生物浸出，提高了黄铜矿的生物浸出效率，解决了黄铜矿难于生物浸出的问题。

附图说明

图1为本发明的寡营养细菌组合培养时所用抽滤装置。

图2A为本发明的寡营养细菌Biometek-A的扫描电镜照片。

图2B为本发明的寡营养细菌Biometek-B的扫描电镜照片。

图2C为本发明的寡营养细菌Biometek-AP-AC的扫描电镜照片。

图3为本发明的寡营养细菌的DNA提取电泳图。

图4为本发明的寡营养细菌的16S rDNA PCR扩增产物电泳图谱。

图5A-图5D为浸出体系的浸渣XRD图谱，其中图5A为空白对照组，图5B为本发明的寡营养细菌组合组，图5C为自养菌Acidithiobacillus caldus OY组，图5D为寡营养细菌组合和Acidithiobacillus caldus OY的混合菌组。

图6A-图6E为不同浸出体系中黄铜矿浸出前后的扫描电镜照片，其中，图6A为浸出前，图6B为空白对照，图6C为本发明的寡营养细菌组合组，图6D为自养菌Acidithiobacillus caldus OY组，图6E为寡营养细菌组合和Acidithiobacillus caldus OY的混合菌组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下所举实施例是为便于更好地理解本发明，但并不用来限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明所涉及的寡营养细菌组合，由脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A，脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B和脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-AP-AC组成。均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期均为：2012年12月26日，保藏编号分别为：CGMCC No.7038，CGMCC No.7039和CGMCC No.7040。该三种寡营养细菌按1：1：1比例组成。

实施例1：寡营养细菌的获得

步骤1、富集

本发明所获得的含寡营养细菌的水样取自江西德兴铜矿采集矿坑水。按照100ml水样加入0.3g酵母粉比例，在不同温度(30℃、45℃、55℃)下平行培养三组，100rpm摇床轻轻震荡培养1周。利用显微镜检测判断细菌生长情况，发现在45℃下细菌生长情况最好，收集45℃温度下寡营养菌培养液。

步骤2、培养基配制

分离培养基基本配制方法为：称取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25g NaCl和1000mL蒸馏水，混合均匀加人吉兰胶30g/L。按比例配制100mL培养基，调pH为3.0，121℃灭菌25分钟，灭菌后每10mL倒一块平板，备用。

富集培养基基本配制方法为：称取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25g NaCl和1000mL蒸馏水，调pH为3.0，121℃灭菌25分钟。

步骤3、培养

使用如图1所示抽滤装置，采用膜过滤法(0.2μm)将上述步骤1中收获的寡营养细菌培养液过滤，并将细菌用20mL无菌水洗下。以5v/v％的接种量接种于100mL富集培养基中，45℃摇床100rpm进行培养，并设有不接种对照即空白对照(CK)。培养两周后观察细菌生长情况。

步骤4、分离纯化

将步骤3培养的寡营养细菌进行梯度稀释(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)，分别取100μL稀释液涂步骤2制作的分离培养基平板，45℃培养三天。得到部分单菌落。

将单菌落按上述梯度稀释法依次进行纯化，共纯化4次，得到3株菌落形态稍有差异的纯菌菌落，分别命名为Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC。

步骤5、形态观察

通过扫描电镜观察分离菌种的形态特征，菌体形态如图2A至图2C所示。

实施例2：寡营养细菌Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC的系统发育地位的确定

步骤1、DNA提取

分别使用如下方法提取Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC，获得相应的菌的总DNA：

在无菌条件下取1.5ml菌液加入Eppendorf离心管中；经4℃、5000rpm离心5分钟，收集菌体；以1×TES液悬浮菌体，经5000rpm离心5分钟，洗涤菌体2次；将菌体重新悬浮于435μl的TES液中，将菌体充分打散；加入溶菌酶(20mg/ml) 125ul，蛋白酶K(10mg/ml)2.5μl，37℃水浴轻轻振荡保温2小时，加入50μl 20％的SDS，于37℃水浴轻轻振荡保温，至溶液完全澄清；加入5M NaClO₄ 125μl，用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提4～5次，至界面无蛋白膜出现为止；加入Rnase 2～5μl(10mg/ml)，在37℃保温30～60分钟；用氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次；吸取上层水相置于冰浴，加入1/10倍体积的3MNaAc-EDTA-Na₂，并加入2倍体积冷的无水乙醇，翻转混匀，冰浴5分钟；经12000rpm离心20分钟，使DNA沉淀；加入70％乙醇脱盐，4℃过夜，离心，吸出乙醇；加入95％乙醇脱水，离心，吸出乙醇；风干，加50μL蒸馏水溶解，获得总DNA。

将提取获得的Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC的总DNA分别标记为1、2、3。

步骤2、DNA提取结果

分别取三种菌的总DNA，各自按5μL DNA与1μL上样缓冲液的比例混合，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，90V电泳30min，然后取出，放入浓度为10mg/ml的EB中染色20min，再放入AlphaImager 2200凝胶成像系统，在波长为302nm的紫外光激发荧光，摄录成像，结果如图3，其中M为DNA marker。

由图3可见三种菌分别提取的总DNA大小均在23KB左右，并且DNA均较完整，紫外分光光度计测定OD260/OD280为1.82，可见纯度较高，没有蛋白和RNA残留，将三种菌的DNA浓度均调整为25μg/ml用于后续的实验的模板DNA。

步骤3、PCR扩增16S rDNA部分序列

分别对三种菌扩增16S rDNA部分序列，反应步骤如下：

A、设计通用引物：

27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'

1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'

B、PCR反应体系(50μl)：

C、PCR反应条件：

步骤4、16S rDNA PCR扩增产物电泳检测

将三种菌的PCR产物使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，90V电泳30min，两侧条带M为DNA marker。从图4可看出，三种菌的PCR产物的大小均在1500bp左右，符合所用的引物，且条带单一，亮度较大，说明PCR条件较好。

步骤5、PCR产物测序

将三种菌的PCR产物送上海生工测序。

步骤6、序列分析

所测得的序列经Blast分析表明，3个分离菌种均属于Alicyclobacillus属，分别命名为Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC。送交中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(CGMCC)进行保藏，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2012年12月26日，保藏编号分别为：CGMCC No.7038，CGMCC No.7039和CGMCC No.7040。

实施例3：寡营养细菌组合影响黄铜矿生物浸出体系中黄钾铁矾的生成实验。

寡营养细菌组合是分别将鉴定保藏的Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC菌种接种到步骤2配置的200mL富集培养基中，45℃摇床100rpm培养一周，获得三种细菌培养液。分别将培养液按照常规方法浓缩成菌泥，再根据菌量按照1:1:1的比例将三种菌混合。

自养菌Acidithiobacillus caldus OY的制备方法为：将自养菌Acidithiobacillus caldus OY接种到200mL 9K培养基(9K培养基配方：(NH₄)₂SO₄ 3.0g；KCl 0.1g；K₂HPO₄ 0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；Ca(NO₃)₂ 0.01g；FeSO₄·7H₂O 44.22g；蒸馏水1000.0ml；pH为1.8，按常规方法灭菌)中，45℃摇床100rpm培养一周。然后将菌液按照常规方法浓缩成菌泥。

反应体系：取300mL的烧瓶，装入200mL普通自来水，并加入10％黄铜矿矿 粉，0.1％酵母粉，用20％浓度的硫酸进行酸平衡至pH为1.7。

待矿物进行酸平衡之后，开始进行生物浸出实验，设置4组生物浸出实验，分别为：空白对照，不接种任何细菌培养物；寡营养细菌组，接种本发明的寡营养细菌Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC组合(三种菌比例1：1：1)；自养菌组，接种已经驯化好的自养菌群Acidithiobacillus caldus OY；混合菌组，接种寡营养细菌Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC组合和Acidithiobacillus caldus OY的混合菌，二者接种比例为1:1。保证每组总接菌量相同。每组实验设置3个平行重复。

接种后，在45℃摇床100rpm培养一周，对4组浸矿体系中的矿渣进行了X-射线衍射光谱(XRD)分析。其结果如图5A至图5D所示。可以看到在寡营养细菌组(图5B)和自养菌组(图5C)的矿渣表面均检测到黄铜矿CuFeS₂和黄钾铁矾KFe₃(SO₄)₂(OH)₆，在混合菌组(图5D)中的矿渣表面检测到了黄铜矿CuFeS₂和水合氢铁矾的混合物(Fe,H₃O)Fe₃(SO₄)₂(OH)₆，在无菌的空白对照组(图5A)的矿渣表面检测到了黄铜矿CuFeS₂、黄铁矿FeS₂和元素硫S⁰。

同时，对不同浸出体系中的黄铜矿的浸渣进行了扫描电镜观察和微区分析(SEM-EDS)，结果如图6A至图6E所示。在不同的浸矿体系中，黄钾铁矾等沉淀物在黄铜矿表面的赋存状态不同。具体表现为，浸出前(图6A)和无菌浸矿组(图6B)中，铁离子主要以Fe²⁺形式出现，没有生成可观测到的铁沉淀物，更没有观察到黄钾铁矾的存在，图6A中A表示浸矿前矿石的表面光滑。在寡营养细菌组(图6C)中，黄铜矿表面没有明显的黄钾铁矾，仅有少量黄钾铁矾呈絮状聚集在一起，图中B所示落在矿石上的很松散的黄钾铁矾。自养菌组(图6D)中，形成大量黄钾铁矾颗粒，并覆盖在黄铜矿表面，形成一层厚厚的铁矾层(如图中C所示)。在混合菌组(图6E)中，黄铜矿表面观察到有少量的黄钾铁矾颗粒(如图中D所示)，另有部分黄钾铁矾呈絮状颗粒聚集在一起形成团块状。

从上述结果可以看出，在浸矿自养菌Acidithiobacillus caldus OY单独存在的浸矿体系中，黄钾铁矾大量生成并包裹在黄铜矿表面，影响黄铜矿的进一步浸出；而在含有寡营养细菌组合的体系中，黄钾铁矾生成量下降，并且絮状颗粒聚集在一起形成团块状，而没有包裹在黄铜矿表面，使得黄铜矿的生物浸出过程基本不受影响。