本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种耐盐的脱COD北见微杆菌及其培养应用，该菌株特别适用于高含盐废水中COD的高效去除。
背景技术：
来源于石油、化工、医药和化肥等行业的盐含量高于1%的高含盐废水普遍含有较高的COD，废水中污染物不断排放到环境中会引起严重的污染问题。淡水资源的缺乏问题日益严重，废水的处理及其回收利用更受到人们的重视。
物理或化学法处理高含盐废水中的COD，成本高并且可能会造成二次污染。传统生物法在处理低盐度废水时有很大优势，但在高盐、高酸碱、高温或低温逆环境中，微生物的降解能力就会受到抑制。耐盐菌处理高含盐废水具有普通活性污泥法无可比拟的优势，且比物理化学法成本低，会产生较为明显的经济效益和社会效益，可以为相关废水处理达标排放提供技术支撑。
耐盐菌技术正是基于工程领域的问题和急需而产生，通过科学方法驯化出处理高含盐废水的的优势耐盐菌，该类菌体以其独特的细胞结构和物质组成能够在较高含盐度的环境中生长。该类耐盐微生物的耐盐性状与其适应极端环境的丰富酶系和活性产物有关。
在高含盐废水处理领域，盐含量是影响微生物处理废水效率的一个关键性因素。信欣等（生物强化技术处理高含盐有机废水[J].水处理技术，2008，8：66-70）采用生物强化技术处理高含盐有机废水，采用耐盐菌生物强化的皂素废水生物处理系统活性污泥的脱氢酶活性显著提高，系统耐受氯离子浓度高达2.8%时，皂素废水COD的去除率为84.41%。CN201210130657.0、CN201210130644.3、CN201010536065.X和CN201210130658.5涉及到采用沼泽考克氏菌（Kocuri apalustris）FSDN-A、科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）FSDN-C，节杆菌（Arthrobacter creatinolyticus）FDN-1、水氏黄杆菌（Flavobacterium mizutaii）FDN-2、脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）DN-3和甲基杆菌（Methylobacterium phyllosphaerae）SDN-3对含盐废水及催化裂化催化剂废水中的氨氮、总氮及化学需氧量进行生物处理的方法。该方法需要培养多种菌株进行复配制备耐盐菌剂，制备过程复杂，生产成本较高。
目前，还没有筛选到用于处理高含盐废水的北见微杆菌的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种耐盐的脱COD北见微杆菌及其培养应用。本发明提供的北见微杆菌可以快速降解脱除高含盐废水中的COD，具有耐盐能力强，处理效果好等特点。
本发明提供一种北见微杆菌FSTB-4，其分类命名为北见微杆菌（Microbacterium kitamiense），已于2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.10939。
本发明提供的北见微杆菌FSTB-4，主要形态特征为：菌落颜色为较浅的灰棕色，菌株个体为杆状。生理生化特征表现为：革兰氏阳性，氧化酶阴性，接触酶阳性，可分解利用多种碳源，具有硝酸盐还原特性。该菌株能够耐受氨曲南或萘啶酸。
本发明提供的北见微杆菌FSTB-4的16SrRNA基因序列见序列表。
本发明提供的北见微杆菌FSTB-4在含盐废水脱除COD中的应用。该菌株能够应用于盐含量1.0wt%-5.0wt%的含盐废水中COD的高效脱除。
本发明中，所述含盐废水可以是经过预处理的化工合成废水、煤化工废水，也可以是炼油工艺、煤化工工艺及化工合成工艺等产生的废水经过反渗透减量化单元产生的浓盐水。所述的含盐废水盐含量为0.5wt%-5.0wt%，优选为1.0wt%-4.5wt%，COD（Cr法，下同）含量为200 -20000mg/L。
本发明提供的北见微杆菌FSTB-4的培养方法，包括菌株活化、液体种子液培养、曝气培养等三个阶段，具体步骤为：
（1）菌株活化：将北见微杆菌FSTB-4接种到FSTB固体培养基的斜面或者平板中，25-35℃培养48小时，保存于4℃冰箱中。
（2）液体种子液培养：配制FSTB液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌并冷却至室温后，无菌环境下挑取斜面或平板中活化的菌株接种到三角瓶中，25-35℃培养24-72h。所述FSTB液体培养基为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值范围为6.0-8.5，优选为6.5-8.0。FSTB固体培养基是在液体培养基中加入20g/L琼脂。
（3）曝气培养：在设有曝气装置的反应器中加入FSTB液体培养基或待处理含盐废水，按照体积比5%-25%的比例接种液体种子液，pH值控制在6.0-8.5，曝气培养48-96小时，之后进行周期性的补料和排料操作，排料量占反应器体积的5%-90%，补料量占反应器体积的5%-90%，也可补加少量的碳源、氮源和微量元素物质，培养24-48小时为1个培养周期，之后按照上述比例排出对应体积的培养液，由此得到含有较高浓度北见微杆菌的浓菌液产品。
本发明中，培养结束后，采集培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-4相似菌落的百分比。在封闭式培养环境下，北见微杆菌为纯菌株，相似百分比达到95%以上。培养FSTB-4的生长环境尽管具有持续性的高盐选择压力，但在长期开放式培养时仍可能会有少量的其它干扰菌株生长，为防止干扰菌持续性繁殖生长成为优势菌，当相似百分比接近50%时，可采取全部排料后重新进水接种培养的方式，之后恢复正常的开放式培养操作流程。
本发明还提供一种脱COD的耐盐菌剂，该菌剂中包括北见微杆菌FSTB-4。所述的耐盐菌剂可以是只采用北见微杆菌FSTB-4菌液制得的耐盐菌剂，也可以与其他耐盐菌剂复配，如可以与现有的具有脱氮、除磷及降解难降解有机物的微生物菌剂结合，实现更好的废水处理效果。
本发明提供的耐盐北见微杆菌FSTB-4是一株在高含盐水体中具有较好COD脱除性能的菌株，耐盐能力强，处理效果好，可以直接用于含盐废水的处理，也可以投加到现有含盐废水处理系统中，提高废水处理效果。本发明提供的北见微杆菌FSTB-4的培养方法，可直接利用污水处理厂含盐废水（根据水质条件补加少量天然培养基和化学合成培养基）进行优势菌株培养富集增浓工作，极大的维持耐盐菌剂的生长特性和耐受特性，并降低耐盐菌剂的培养成本。
生物材料保藏说明
本发明提供的北见微杆菌（Microbacterium kitamiense）FSTB-4菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.10939；保藏日期：2015年6月1日。
具体实施方式
本发明的北见微杆菌FSTB-4是2014年6月从取自湖南省岳阳市某石化企业用于处理环氧氯丙烷生产废水的活性污泥中分离筛选得到的，其生理生化试验结果见表1。
表1北见微杆菌FSTB-4的生理生化试验结果
经“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”鉴定，该菌株属于北见微杆菌（Microbacterium kitamiense），命名为FSTB-4。
实施例2筛选和分离纯化
采用逐渐提高培养液盐浓度的方法对取自湖南省岳阳市某石化企业用于处理环氧氯丙烷生产废水的活性污泥进行驯化培养15天。
取上述驯化好的活性污泥，采用稀释涂布方法在富集培养基中进行初步分离，由此得到15个生长状态良好且性状各异的菌落。所采用的富集培养基含有的主要成分为：COD为1000mg/L，钙离子浓度为1000mg/L，全盐量为10000mg/L，所采用的固体培养基中琼脂含量为2.0%。
然后采用平板划线方法对得到的菌落进行转接，划线转接到筛选培养基中，进行进一步分离和筛选。采用的筛选培养基含有的主要成分为：COD为1000mg/L，钙离子浓度为4000mg/L，全盐量为25000mg/L，所采用的固体培养基中琼脂含量为2.0%。
由上述操作得到10株纯菌株，其中一株即为北见微杆菌FSTB-4。
实施例3北见微杆菌FSTB-4耐盐能力的考察
本发明所述的北见微杆菌FSTB-4的培养方法包括：菌株活化、液体种子液培养、曝气培养，具体过程如下：
（1）菌株活化：将北见微杆菌FSTB-4接种到含有FSTB固体培养基的平板中，30℃环境下培养48小时，然后保存于4℃冰箱中待用。所述FSTB固体培养基为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH值7.8。
（2）液体种子液培养：配制FSTB液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌并冷却至室温后，无菌环境下用接种环挑取平板中活化后的菌株接种到三角瓶中，30℃条件下培养48小时。所述FSTB液体培养基为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.8。
（3）曝气培养：采用密闭的反应器进行培养，所采用反应器及各种器具均需要灭菌完全，进气和排气位置需安装细菌过滤装置，培养液、酸碱调节剂及微量元素溶液均需要灭菌后按照无菌操作规程投加，反应器需配备曝气装置，并可进行进水、调酸、调碱、补料和排水排料操作，在该反应器中放入灭菌后的FSTB液体培养基，按照反应器体积百分比10%的比例接种液体种子液，开启培养过程后，培养过程中采用酸碱自动控制系统将培养液pH值范围控制在6.0-8.5，曝气培养72小时之后进行周期性的补料和排料操作，排料为反应器体积百分比50%的培养液，补料为反应器体积百分比50%的FSTB液体培养基，也可同时补加少量的碳源、氮源和微量元素物质，培养24小时为1个培养周期，之后按照上述比例排出对应体积的培养液，由此得到含有纯北见微杆菌的浓菌液产品。
采集上述培养完毕的浓菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-4相似菌落的百分比，相似百分比达到95%以上，即认定该北见微杆菌为纯菌株。
采用上述培养得到的北见微杆菌FSTB-4处理含盐废水。本实施例以经过预处理的环氧氯丙烷生产工艺含盐废水为例，所处理含盐废水的水质为：COD浓度范围为800-2000mg/L，盐含量为1wt%-5wt%，处理温度为30℃。处理效果如表2所示。
表2北见微杆菌FSTB-4处理含盐废水的效果
由表2可知，北见微杆菌FSTB-4能够耐受的盐含量为1.0wt%-5.0wt%，可以高效脱除废水中的COD。
实施例4北见微杆菌FSTB-4开放式培养
本发明北见微杆菌FSTB-4的开放培养方法包括：菌株活化、液体种子液培养、开放式曝气培养、纯菌株检测和优势菌维护，具体过程如下：
（1）菌株活化：将北见微杆菌FSTB-4接种到含有FSTB固体培养基的平板中，30℃环境下培养48小时，然后保存于4℃冰箱中待用。所述FSTB固体培养基为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH值7.8。
（2）液体种子液培养：配制FSTB液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌并冷却至室温后，无菌环境下用接种环挑取平板中活化后的菌株接种到三角瓶中，30℃条件下培养48小时。所述FSTB液体培养基为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.8。
（3）开放式培养：在设有曝气装置的开放式反应器中加入待处理的含盐废水，本实施例以经过预处理的环氧氯丙烷生产工艺含盐废水为例，所处理含盐废水的水质为：COD浓度范围为1000mg/L，盐含量为1wt%-5.0wt%，培养温度为35℃，按照体积比10%的比例接种液体种子液，曝气培养96小时，培养液菌体浓度变化（以600nm时的吸光度数值OD600表示菌体浓度）如表3所示。
表3北见微杆菌FSTB-4菌体浓度变化
（4）纯菌株检测：采集上述培养完毕的生物菌剂混合液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-4相似菌落的百分比，相似百分比达到50%以上，则认定北见微杆菌为优势菌株。
（5）优势菌株维护：在纯菌株检测FSTB-4相似菌落百分比接近50%时，采取全部排料后重新进水并重新接种培养的方式，之后恢复正常的开放式培养流程。
本发明所述北见微杆菌FSTB-4对实际含盐废水的适应性和处理效果非常好，具有较强的COD降解功能，可单独采用该菌株的纯培养用于含盐废水的处理，也可放大培养后作为外源功能微生物投加到现有工艺流程，有针对性地对实际工艺状况进行优化调节，解决高盐环境下活性污泥处理效果差且易退化的问题。采用耐盐菌处理高含盐废水比物理化学法成本低，直接应用会产生较为明显的经济效益和社会效益，可为高含盐相关废水处理达标排放提供技术支撑。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院
<120> 一种北见微杆菌及其培养应用
<130> 新申请
<170> PatentIn version 3.5
<211> 1304
<212> DNA
<213> Microbacterium
aacgggtgag taacacgtga gcaacctgcc ctgaactctg ggataagcgc tggaaacggc 60
gtctaatact ggatatgagc tgcggaggca tcttcgtggt tggaaagatt tttcggtttg 120
ggatgggctc gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgtcgacgg 180
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gcttagatac cctggtagtc caccccgtaa acgttgggaa ctagttgtgg ggtccattcc 720
acggattccg tgacgcagct aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg 780
ctaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg 840
atgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacacga gaacgctgca gaaatgtaga 900
actctttgga cactcgtgaa caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 960
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgttctatg ttgccagcac gtaatggtgg 1020
gactcatggg atactgccgg ggtcactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1080
gccccttatg tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg gtacaaaggg ctgcgatacc 1140
gcgaggtgga gcgaatccca aaaagccggt cccagttcgg attgaggtct gcaactcgac 1200
ctcatgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc 1260
gggtcttgta cacaccgccc gtcaagtcat gaaagtcggt aaca 1304