本发明属于环境微生物领域，具体地涉及一种耐盐的脱COD脱氮微生物菌剂及其制备方法，该菌剂可以高效脱除含盐废水中的COD和总氮，实现用于高含盐废水处理的微生物菌剂的产业化、商品化。
背景技术：
来源于石油、化工、医药和化肥等行业的盐含量高于1%的高含盐废水普遍含有较高的COD，废水中污染物不断排放到环境中会引起严重的污染问题。淡水资源的缺乏问题日益严重，废水的处理及其回收利用更受到人们的重视。
物理或化学法处理高含盐废水中的COD，成本高并且可能会造成二次污染。传统生物法在处理低盐度废水时有很大优势，但在高盐、高酸碱、高温或低温逆环境中，微生物的降解能力就会受到抑制。耐盐菌技术正是基于工程领域的问题和急需而产生，通过科学方法驯化出处理高含盐废水的优势耐盐菌，该类菌体以其独特的细胞结构和物质组成能够在较高含盐度的环境中生长。耐盐菌处理高含盐废水具有普通活性污泥法无可比拟的优势，且比物理化学法成本低，会产生较为明显的经济效益和社会效益，可以为相关废水处理达标排放提供技术支撑。
在高含盐废水处理领域，盐含量是影响微生物处理废水效率的一个关键性因素。信欣等（生物强化技术处理高含盐有机废水[J].水处理技术，2008，8：66-70）采用生物强化技术处理高含盐有机废水，采用耐盐菌生物强化的皂素废水生物处理系统活性污泥的脱氢酶活性显著提高，系统耐受氯离子浓度高达2.8%时，皂素废水COD的去除率为84.41%。CN201210130657.0、CN201210130644.3、CN201010536065.X和CN201210130658.5涉及到采用沼泽考克氏菌FSDN-A、科氏葡萄球菌FSDN-C，节杆菌FDN-1、水氏黄杆菌FDN-2、脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3对含盐废水及催化裂化催化剂废水中的氨氮、总氮及化学需氧量进行生物处理的方法。该方法处理COD主要依靠反硝化脱除亚硝酸盐实现，处理能力有限，应用范围也受到一定程度的限制。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种可耐受高含盐废水的用于脱除COD和总氮的微生物菌剂及其制备方法。该微生物菌剂可以直接用于处理高含盐废水中的总氮和COD，也可以投加到各类生化反应构筑物中改善微生物组成，优化废水处理中微生物体系的耐盐性能，提高工艺整体的总氮和COD脱除率。
本发明耐盐的脱COD脱氮微生物菌剂含有副球菌（Paracoccus sp.）FSTB-2、北见微杆菌（Microbacterium kitamiense）FSTB-4、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5中的至少一种，同时含有脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans) DN-3和甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)SDN-3中的至少一种，其中副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4、施氏假单胞菌FSTB-5已经于2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号分别为CGMCC No.10938、CGMCC No.10939、CGMCC No.10940，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其中脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3已经于CN102465104A、CN102465103中公开，保藏编号分别为CGMCC No.3658和CGMCC No.3660。
本发明微生物菌剂中，“脱氮副球菌DN-3和/或甲基杆菌SDN-3”与“副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4、施氏假单胞菌FSTB-5中的至少一种”两类菌体的体积比为1:1-5。（按菌体体积计，菌体体积为培养后在每分钟1万转条件下离心分离5分钟后的得到的菌体体积，下同）。脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3可以是其中的一种，也可以是两种任意比例的混合菌体。最好同时含有副球菌FSTB-2和施氏假单胞菌FSTB-5。更优选同时含有脱氮副球菌DN-3、甲基杆菌SDN-3、副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5五株菌。
本发明微生物菌剂中，副球菌FSTB-2菌落颜色为米黄色，菌株个体为球状，革兰氏染色为阴性，氧化酶阳性，接触酶阴性，可分解利用多种碳源，具有硝酸盐还原活性。北见微杆菌FSTB-4菌落颜色为较浅的灰棕色，菌株个体为杆状，革兰氏阳性，氧化酶阴性，接触酶阳性，可分解利用多种碳源，具有硝酸盐还原特性。施氏假单胞菌FSTB-5菌落颜色为浅姜黄色，菌株个体为杆状，革兰氏阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性，具有硝酸盐还原性能，可分解利用多种碳源。
本发明微生物菌剂中，副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5均能够单独应用于盐含量1.0wt%-5.0wt%的含盐废水中COD的高效脱除。本发明菌剂中脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3均能以氨氮作为氮源进行异养硝化-好氧反硝化同步脱氮，在脱氮的同时能还能够利用部分COD。
本发明微生物菌剂中，可以含有适宜的添加剂，如营养物质、保藏助剂等，具体的添加剂种类及用量是本领域技术人员熟知的。
本发明还提供了上述耐盐脱COD脱氮微生物菌剂的制备方法，包括以下内容：
（1）将副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5分别接种于FSTB固体培养基上进行活化；将脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3分别接种于对应固体培养基上进行活化；
（2）用接菌环取平板上的副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5菌落分别接种于相应的FSTB液体培养液中，用接菌环取平板上的脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3菌落分别接种于相应的液体培养液中，在温度20-40℃、150-240rpm条件下培养24-72小时至对数生长期，获得液体菌剂种子液；
（3）将上述种子液放大培养后收集菌体，按所需的比例混合，即为本发明所述的耐盐微生物菌剂。
本发明微生物菌剂所涉及的副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5的菌体活化和种子液培养所使用的FSTB液体培养基配方为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值为6.0-8.0。脱氮副球菌DN-3菌体活化和种子液培养所用的培养基配方为：KNO3 1g/L，丁二酸钠 8g/L，KH2PO4 1g/L，FeCl2 0.5g/L，固体培养基加入2.0%的琼脂。甲基杆菌SDN-3菌体活化和种子液培养所用的培养基配方为：硫酸铵0.5g/L，甲醇0.75mL/L，KH2PO41g/L，FeCL20.5g/L。固体培养基是在上述液体培养基中加入2%琼脂。
本发明中，副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5三种菌的种子液可以单独放大培养，也可以是三种菌的种子液混合后进行放大培养。脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3的种子液可以单独放大培养，也可以是两种菌的种子液混合共同放大培养。
本发明微生物菌剂所涉及菌株的放大培养所用的培养液可以是含盐含COD含氮的液体培养基，也可以是含盐含COD含氮的实际废水，其中盐含量0.5wt%-10wt%，COD（Cr法，下同）为200-20000mg/L，总氮为50-1000mg/L。所述的培养条件为温度20-40℃，pH为6.0-8.0，溶解氧为0.1-3.0mg/L。本发明所用的放大培养反应器可以是具有良好曝气和搅拌系统的构筑物。
本发明微生物菌剂的制备过程首先进行菌体活化，然后进行种子液培养，最后将种子液放大培养后收集菌体、包装并保存备用。上述放大培养得到浓度较高的浓菌液可以直接投加使用，也可以将这些浓菌液加入营养液或者营养液和保护剂的混合液后可以制备成液态菌剂，也可以利用本领域现有的方法制备成干粉状的菌剂。可以采用塑料袋、塑料瓶或者塑料桶等耐储存、防冻、便于运输等材质的容器或者设备进行包装。包装方法采用本领域现有常规技术，包装量为50-5000g/包（袋或者瓶）包装后的菌剂可以根据具体情况在室温或者低温条件下保存。
本发明制备的耐盐脱COD脱氮微生物菌剂可以应用于各种高含盐废水的处理，耐受的盐含量为1wt%-10wt，COD去除率达90%以上，总氮去除率达95%以上。该菌剂可以直接投加到废水处理系统中，也可以与活性污泥混合作为接种物，也可以在各种填料上挂膜后处理废水，适用于高含盐废水中COD和总氮的高效脱除。
本发明所述微生物菌剂由副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4、施氏假单胞菌FSTB-5、脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3菌株组成。在高盐废水处理过程中，这几种微生物互相配合，氨氮、总氮及COD去除速率高于任何一种微生物单独使用时的效果，耐盐微生物菌剂对废水的耐受冲击能力比单一菌株强，拓宽了废水水质的适用范围宽，提高了废水中总氮及COD的处理效果。
本发明的微生物菌剂主要由生长条件相近的微生物制备而成，混合液中各个菌株的比例不受放大倍数的影响，有利于快速培养。该菌剂可以直接处理高含盐废水中的COD及总氮，也可投加到传统的废水构筑物中改善原有微生物的组成，强化生化处理效果，降低了运行费用。
具体实施方式
本发明提出一种废水处理用耐盐脱COD脱氮微生物菌剂及其制备方法。微生物菌剂生长速度快，收集量大，菌剂具有较强的耐盐特性和适应性，具有较好的抗冲击性；可以直接投加到废水处理厂活性污泥中使用，也可以在适宜的生化反应器内处理含高浓度总氮和COD的废水。投入使用后能够缩短系统启动时间，拓宽废水水质的适用范围，可以实现废水处理微生物菌剂的产业化、商品化。
本发明中，副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5所用的FSTB液体培养基配方为：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值为6.0-8.0；FSTB固体培养基是在液体培养基中加入20g/L的琼脂。
本发明中，脱氮副球菌DN-3的液体培养基配方为：KNO3:1g/L，丁二酸钠:8g/L，KH2PO4:1g/L，FeCL2:0.5g/L；固体培养基加入20g/L的琼脂。甲基杆菌SDN-3的液体培养基配方为：硫酸铵:0.5g/L，甲醇:0.75mL/L，KH2PO4:1g/L，FeCL2:0.5g/L；固体培养基加入20g/L琼脂。
实施例1微生物菌剂的制备方法
（1）将副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5分别接种于FSTB固体培养基上进行活化；将本发明脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3分别接种于对应固体培养基上进行活化；涂布均匀后放置在温度为35℃恒温培养箱中进行活化。
（2）用接菌环取平板上的副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4和施氏假单胞菌FSTB-5菌落分别接种于相应的FSTB液体培养基中，用接菌环取平板上的脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3菌落分别接种于相应的液体培养基中，在温度30℃、150rpm条件下震荡培养48小时至对数生长期，获得液体菌剂种子液。
（3）在具有良好曝气和搅拌条件的反应器中分别对副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4、施氏假单胞菌FSTB-5、脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3种子液进行放大培养，培养液中COD浓度为2000mg/L，总氮浓度为100mg/L，盐含量为2.5wt%，pH值为8.0。培养条件均为：温度为30℃，溶解氧2.0-3.0mg/L，培养时间72小时，由此获得五株菌的浓菌液。
对经过放大培养获得的浓菌液进行收集，并将副球菌FSTB-2、北见微杆菌FSTB-4、施氏假单胞菌FSTB-5、脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3按照表1所述的比例进行配制，具体如表1所示。
表1 耐盐微生物菌剂的组成及配比
实施例2微生物菌剂处理含盐含COD含氮废水
某化工厂产生的高含盐废水，盐含量为2.5wt%，COD为2000mg/L，总氮为80mg/L，系统长期运行过程中出现COD和总氮脱除率明显变差的状况，出水不能达标。每天按照废水处理体积的1%向系统内投加实施例1制备的耐盐微生物菌剂，共投放10天，处理效果如表2所示。
表2 不同耐盐菌剂的处理效果
由表2可知，采用本发明制备的组合菌剂处理后，出水COD始终低于60mg/L，出水总氮始终低于23mg/L。而同样条件下采用单一菌处理，出水COD高于99mg/L。采用CN201210130644.3所述的菌悬液，虽然出水总氮较低，但是COD不满足要求。由此可见，该微生物菌剂能够提高含盐废水的处理效果，实现含盐废水的深度处理。