具耐热性的果胶酶的制作方法

本申请涉及一种果胶酶，尤指一种具耐热性的果胶酶。

背景技术：

果胶(Pectin)是植物细胞壁中主要的组成之一，绝大部分存在于初生细胞壁(primary cell wall)以及中胶层(middle lamella)。果胶物质是种复杂的异质多醣，主要是以D-半乳糖醛酸(D-galacturonic acid)，经由α-1,4-糖苷键结组成其骨干。而此骨干可被进一步地修饰，像是甲基酯化(methyl-esterification)或取代成乙酰基(acetyl groups)。果胶大致上可被分成三大类：同质半乳醛酸聚醣(homogalacturonan)、木糖半乳醛酸聚醣(xylogalacturonan)以及鼠李半乳醛酸聚醣(rhamnogalacturonan)。第三种果胶的结构最为复杂，其由重复的鼠李糖-半乳糖醛酸组成其主链，且有不同种的糖，像是半乳糖、木糖以及阿拉伯糖(arabinose)形成其支链。

由于这样复杂构成的果胶，其完整的分解需要依靠好几种不同的果胶酶(pectinases)来共同作用。果胶酶在自然界中广泛地存在于许多不同的细菌、酵母、真菌以及植物中，大致上可分为三大种：果胶水解酶(hydrolases)、果胶裂解酶(lyases)以及果胶酯酶(esterases)。在这些果胶酶中，果胶裂解酶(pectate lyase；endopolygalacturonate lyase；EC 4.2.2.2)是分解果胶过程中的关键酶种之一。它可以透过反式消除机制(transelimination mechanism)任意地催化半乳醛酸聚糖中的α-1,4-糖苷键结，进而生成不饱和半乳醛酸寡糖的产物。

长久以来，果胶酶已经被广泛应用在食品以及制酒工业上。近年来，更延伸应用在许多不同的工业上，像是造纸、纺织以及饲料中。因为果胶酶在工业上具有极高的经济应用价值，许多研究不论是从大自然中筛选新基因或是改造现有的蛋白，都企图想要找到更适合于工业应用的果胶酶。在许多提升工业酶的策略中，根据蛋白结构分析，进而逻辑性地设计突变点是改造蛋 白的主要方法之一。而一个好的工业酶所要具备的理想条件之一就是高耐热性，因为高耐热性的酶通常具有较高的蛋白稳定性以及较佳性能的酶作用力，故也较有利于工业应用。

因此，本申请利用逻辑性的突变设计去增加果胶裂解酶的耐热性，进而提升它在工业上的应用价值。

技术实现要素：

本申请的目的在于改造现有果胶裂解酶，利用结构分析及点突变技术，有效提升果胶裂解酶的耐热性，藉以增加果胶裂解酶的工业应用价值。

为达上述目的，本申请的广义实施方式提供一种果胶酶，其氨基酸序列为将序列编号2第181位置的丝氨酸(serine)以一氨基酸取代修饰的序列，其中用于取代的该氨基酸选自苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)。编码该序列编号2的基因是从坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)所分离出来的PcPEL基因。该果胶酶是果胶裂解酶。

在一个实施方式中，该果胶酶的氨基酸序列是序列编号4的氨基酸序列。

在个一实施方式中，该果胶酶的氨基酸序列是序列编号6的氨基酸序列。

在个一实施方式中，该果胶酶的氨基酸序列是序列编号8的氨基酸序列。

又，该果胶酶的用途为用于制造食品、制酒、造纸、纺织或制造饲料。

附图说明

图1显示PcPEL的核苷酸序列以及氨基酸序列。

图2显示PcPEL的蛋白结构。

图3显示突变引物序列。

图4显示S181F的核苷酸序列以及氨基酸序列。

图5显示S181M的核苷酸序列以及氨基酸序列。

图6显示S181L的核苷酸序列以及氨基酸序列。

图7显示PcPEL原始蛋白及S181F、S181M、S181L三种突变蛋白的耐热性分析。

具体实施方式

体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的态样上具有各种的变化，其均不脱离本申请的范围，且其中的说明及图示在本质上用作说明之用，而非用以限制本申请。

本申请的果胶裂解酶(PcPEL)是从嗜碱性细菌坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)菌株中所分离出来的基因。根据先前文献中指出，该果胶裂解酶的最适活性是在50℃以及pH 10的条件之下。为了提升此果胶裂解酶的耐热性，本申请欲通过结构分析以及点突变技术(site-directed mutagenesis)对其进行改造。因此，本申请利用X-ray结晶学技术去解开PcPEL的蛋白三级结构，进而阐明其详细的结构信息。为了提升PcPEL的耐热性，本申请根据其结构分析挑选位于活性区附近的第181个氨基酸的丝氨酸(serine)，利用点突变技术，分别单一突变成苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)，因而成功地提高其耐热性，也进一步地增加此果胶裂解酶的工业应用价值。以下将详述本申请改造果胶裂解酶的方法及其所得到的改良果胶裂解酶蛋白。

首先，PcPEL基因被构建在pPICZαA的载体上，其中如图1所示，PcPEL基因包含858个碱基(不含终止密码子，核苷酸序列以序列编号1标示)以及286个氨基酸(氨基酸序列以序列编号2标示)。线性化之后的质粒DNA接着被转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)中，再利用含有0.1mg/ml zeocin抗生素的YPD平板，在30℃中培养2天，筛选出成功转化的细胞。接着挑选菌落，分别接种到YPD培养基中增生，再进一步地将菌分离出来，转移到含有0.5％甲醇的BMMY培养基内，进而诱导其目标蛋白的表达。经由离心步骤，收集含有表达出的目标蛋白的上清液。为了后续的蛋白纯化步骤，本申请利用含有25mM Tris；pH 7.5的缓冲液进行两次透析。再利用FPLC系统以及DEAE纯化管柱，纯化出PcPEL蛋白。最后，为了后续的结晶实验，纯化的蛋白再浓缩至10mg/ml的浓度。

为了利用X-ray结晶学技术解析蛋白结构，必须先得到蛋白晶体。本 申请利用座滴式蒸气扩散法以及结晶试剂盒筛选出成功结晶的条件，再进行调整之后，得到适当的结晶条件是在0.1M Bis-Tris；pH 6.5、0.2M Lithium sulfate以及25％PEG3350的环境中，在室温下培养2天。而相位角问题则是通过分子置换法(molecular replacement)解开，经由计算机运算之后，得到PcPEL的蛋白结构。

如图2所示，PcPEL的蛋白结构属于典型PL10家族的(α/α)₃barrel蛋白折叠。本申请欲利用增加PcPEL蛋白的疏水性作用力(hydrophobic interaction)，来进一步提升其耐热性。通过结构分析，本申请挑选位于活性区附近第181位置的丝氨酸(serine)分别突变成苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)，亦即，本申请利用点突变技术获得PcPEL的三种突变基因，分别是S181F、S181M以及S181L。

突变方式为利用PCR分别取得三种突变基因，而当中所用到的突变引物列在图3。原始的模板DNA则利用限制酶DpnI移除掉。突变基因个别送入大肠杆菌内复制放大，再通过DNA测序，确认突变的成功与否。最后，突变基因分别送入毕赤酵母中表达出突变蛋白，如同前述的蛋白表达步骤。

三种突变基因的核苷酸序列以及氨基酸序列分别如图4、图5及图6所示。图4显示S181F的突变序列，其核苷酸序列以序列编号3标示，氨基酸序列则以序列编号4标示。图5显示S181M的突变序列，其核苷酸序列以序列编号5标示，氨基酸序列则以序列编号6标示。图6显示S181L的突变序列，其核苷酸序列以序列编号7标示，氨基酸序列则以序列编号8标示。

果胶裂解酶的活性测定是利用检测聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid)底物在C4与C5之间的分解，进而产生的不饱和键结，被波长235nm所吸收。大致而言，反应混合物包含了0.5ml适当稀释的蛋白样本以及0.2％聚半乳糖醛酸作为底物，在含有0.6mM氯化钙的pH 9.4glycine-NaOH缓冲液环境中于45℃下作用10分钟。接着，加入3ml 30mM的磷酸以停止反应。最后，检测在OD235nm波长的吸收值，进而求出果胶裂解酶的活性。

至于耐热性分析方面，突变蛋白以及原始蛋白分别在65℃、68℃、70 ℃以及75℃下作用2分钟。接着放在冰上5分钟降温，再置于室温下5分钟回复。最后，再检测高温处理过的样本所剩余的酶活性。

图7显示PcPEL原始蛋白及S181F、S181M、S181L三种突变蛋白的耐热性分析，其中未热处理的样本的果胶裂解酶活性设定为100％。由图7可知，S181F、S181M及S181L三种突变蛋白的耐热性均高于原始蛋白(wild type)。相较于未热处理的蛋白，原始蛋白在68℃高温处理之下所剩余的活性还有约50％，而三种突变蛋白在相同68℃高温处理之下则保留了80％的活性。此外，在70℃高温处理之下，原始蛋白几乎失去全部的活性，然而三种突变蛋白还保留了约40％的活性。以上结果显示出，这三种突变蛋白S181F、S181M及S181L相较于原始蛋白，具有较高的耐热性，也表示具有较大潜力的工业应用价值。

综上所述，为了增加果胶裂解酶的工业应用价值，本申请利用逻辑性的突变设计去增加果胶裂解酶的耐热性，根据PcPEL的结构分析并利用点突变技术，将位于活性区附近的第181个位置的丝氨酸(serine)分别单一突变成苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)以及亮氨酸(leucine)，而得到S181F、S181M及S181L三种突变蛋白。由耐热性分析结果可知，S181F、S181M及S181L三种突变蛋白的耐热性均高于原始蛋白，故本申请成功地设计出较具耐热性的PcPEL突变蛋白，不但提高果胶裂解酶的耐热性，也进一步地增加此果胶裂解酶的工业应用价值。

尽管本发明已利用上述实施例进行了详细叙述而可由本领域技术人员任施匠思而进行各种修饰，但其均不超出如所附的申请专利范围所要保护的内容。