本发明属于角蛋白的制备方法领域，尤其是涉及一种通过多级逆流萃取低温美拉德反应、合酶酶解与离子交换纯化工艺相结合的方式制备鱼鳞角蛋白的方法。
背景技术：
鱼制品在加工过程中会产生鱼鳞、内脏等下脚料，这部分下脚料占鱼体总重量的10％-15％，其中鱼鳞大约占3％-5％。我国对这部分资源缺少有效的利用手段，鱼鳞中的营养功能性物质未能被充分利用，附加值相对来说比较低。
鱼鳞中含有丰富的粗蛋白和灰分，粗蛋白含量占干物质的39.90-78.60％。鱼鳞中的蛋白质以胶原蛋白和硬蛋白为主。鱼鳞硬蛋白含量占干物质的4.454-8.29％，鱼鳞硬蛋白主要是角蛋白。角蛋白具有优异的生物学特性和良好的材料力学性能，可广泛应用于材料、医学、生物等方面。角蛋白是一种不能直接为畜禽吸收利用的硬蛋白，它必须经高温、高压、酸、碱或酶处理，变成短肽或游离氨基酸，才能被利用。其蛋白质含量及必需氨基酸含量极高，氨基酸组成相对稳定，是一种公认的具有较高营养价值，质量稳定的潜在优质蛋白源。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鱼鳞角蛋白的制备方法，采用控制热致溶解技术，加热溶解过程中分多次加入脱灰鱼鳞，提高了角蛋白的纯度，极大地减少了副产物的生成，分子量小于1000Da的胶原肽得率大于85％。
本发明的技术方案是：
鱼鳞角蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1)将鱼鳞清洗后加盐酸溶液脱灰处理后，去离子水冲洗至中性，获得脱灰鱼鳞；
2)在1-2重量份的脱灰鱼鳞中，加入6-8重量份的去离子水，加热到90-100℃后保温1-2h；
3)继续加入1-2重量份的脱灰鱼鳞，90-100℃继续保温1-4h；
4)分离获得胶原蛋白溶液和固体残渣；
5)向1重量份的固体残渣中加入3-5重量份的水混合后加入复合蛋白酶，在50-55℃条件下水解2-4h，获得鱼鳞角蛋白粗品；
6)鱼鳞角蛋白粗品经提纯后，喷雾干燥获得鱼鳞角蛋白。
美拉德反应又称为“非酶棕色化反应”，是法国化学家L.C.Maillard在1912年提出的。所谓美拉德反应是广泛存在于食品工业的一种非酶褐变，是羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应，经过复杂的历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素，所以又称羰氨反应。美拉德反应是一个十分复杂的反应过程，中间产物众多，终产物结构十分复杂，完全抑制美拉德反应相当困难，又由于美拉德反应影响因素众多，有效抑制美拉德反应必须是多种因素协同作用的结果。
现有技术鱼鳞角蛋白和鱼鳞胶原蛋白加热分离过程中，通常容易出现美拉德反应，导致胶原蛋白和角蛋白产率降低，造成胶原蛋白和角蛋白的损失。本发明研究人员在实验过程中发现鱼鳞胶原蛋白和鱼鳞角蛋白的提取分离的过程中，将温度控制在90-100℃，分多次将脱灰鱼鳞加入到胶原蛋白溶液中继续循环提取，可以有效的抑制美拉德反应，角蛋白的纯度和含量，减少副产物的生产，提高整个鱼鳞中角蛋白的得率。
所述步骤3)分两步进行：加入0.5-1.5重量份的脱灰鱼鳞，90-100℃继续保温1-2h后，继续加入0.5-1重量份的脱灰鱼鳞，90-100℃继续保温1-2h。
分两次将脱灰鱼鳞加入到胶原蛋白溶液中，循环提取不但提高了角蛋白的得率，还减少了水用量，节约用水，降低了生产成本。
所述步骤3)分两步进行：加入1重量份的脱灰鱼鳞，90-100℃继续保温1-2h后，继续加入1重量份的脱灰鱼鳞，90-100℃继续保温1-2h。
本发明研究人员经过长期大量实验发现，在步骤3)中分两次加入1重量份的脱灰鱼鳞，所得到的固体残渣中角蛋白含量最高，副产物最少。
所述步骤2)中在1重量份的脱灰鱼鳞中，加入6-8重量份的去离子水，加热到90-100℃后保温1-2h。
所述步骤2)中在1重量份的脱灰鱼鳞中，加入6-8重量份的去离子水，加热到90-95℃后保温1-2h。
提取胶原蛋白的温度过高，会发生美拉德反应，导致副产物含量增加，影响胶原蛋白和角蛋白的得率和纯度；提取胶原蛋白的温度过低，胶原蛋白和角蛋白就不能从鱼鳞中充分分离，也影响角蛋白的得率。本发明研究人员经过长期大量实验发现，在90-95℃的温度条件下提取胶原蛋白，不但能有效的抑制美拉德反应，还能够尽可能的提高角蛋白的得率，将鱼鳞中的角蛋白完全提出。
所述步骤3)分两步进行：加入1重量份的脱灰鱼鳞，90-95℃继续保温1-2h后，继续加入1重量份的脱灰鱼鳞，90-95℃继续保温1-2h。
所述步骤5)中，复合蛋白酶的加酶量为角蛋白和水总质量的1.5‰-3‰。
所述步骤1)中将清洗后的鱼鳞加入到质量浓度为3-5％的盐酸溶液中脱灰处理。
采用3-5％盐酸溶液脱灰处理后的脱灰鱼鳞，能够将鱼鳞中的钙完全析出，得到得脱灰鱼鳞灰分含量小于0.5％。
采用3-5％盐酸溶液脱灰处理后的脱灰鱼鳞，灰分含量小，且在分离胶原蛋白和角蛋白的过程中加热温度较低，能够避免美拉德反应，副产物少，角蛋白产率高。
所述脱灰处理为将1重量份的鱼鳞加入到8-10重量份的盐酸溶液中，室温条件下250-300r/min搅拌1-2h。
所述步骤1)中将清洗后的鱼鳞加入到质量浓度为4％的盐酸溶液中脱灰处理。
所述步骤(2)和步骤(3)中，在加热的过程中需要搅拌，搅拌速率为2000-4000r/min。
所述步骤6)中的提纯包括：活性炭吸附和离子交换树脂吸附。
所述活性炭吸附为向鱼鳞角蛋白粗品中加入鱼鳞角蛋白粗品质量0.5-1％的活性炭，在60℃吸附40min，进行脱色脱腥处理；
本发明鱼鳞角蛋白粗品经过活性炭吸附脱色脱腥处理后，再经过离子交换树脂脱盐、除重金属离子，所获得的鱼鳞角蛋白纯度可达到99％以上。
本发明具有的优点和积极效果是：
1)采用盐酸溶液脱灰处理鱼鳞，获得的脱灰鱼鳞灰分含量小于0.5％；
2)胶原蛋白和角蛋白的分离过程中，分多次向胶原蛋白溶液中加入脱灰鱼鳞，有效的抑制了美拉德反应，所制备的固体残渣中角蛋白的含量和纯度高；
3)采用复合蛋白酶水解角蛋白，所获得的鱼鳞角蛋白水解率高、品质好的，分子量小于1000Da的鱼鳞角蛋白得率大于85％；
4)经提纯喷雾干燥后所得鱼鳞角蛋白纯度可达99％以上。
具体实施方式
实施例1
将1重量份的鱼鳞清洗后，加入到8重量份的质量浓度为3％的盐酸溶液中，室温条件下250r/min搅拌2h，去离子水冲洗至中性，获得脱灰鱼鳞；将1重量份的脱灰鱼鳞加入到6重量份的去离子水中，加热到100℃后保温1h后；继续加入1重量份的脱灰鱼鳞， 继续100℃后保温2h，获得带有固体残渣的胶原蛋白溶液；离心分离获得固体残渣，向1重量份的固体残渣中加入3重量份的水后，加入固体残渣和水总重量3‰的复合蛋白酶，在55℃条件下水解2h，获得鱼鳞角蛋白粗品；鱼鳞角蛋白粗品中加入鱼鳞角蛋白粗品质量0.5％的活性炭，在60℃吸附40min，进行脱色脱腥处理，然后用离子交换树脂脱盐、除重金属离子后，喷雾干燥获得鱼鳞角蛋白。
鱼鳞角蛋白的纯度为99.7％；其中分子量小于1000Da的鱼鳞角蛋白得率为85.4％。
实施例2
将2重量份的鱼鳞清洗后，加入到10重量份的质量浓度为5％的盐酸溶液中，室温条件下300r/min搅拌1h，去离子水冲洗至中性，获得脱灰鱼鳞；将2重量份的脱灰鱼鳞加入到8重量份的去离子水中，加热到100℃后保温1h后；继续加入1重量份的脱灰鱼鳞，继续100℃后保温1h，获得带有固体残渣的胶原蛋白溶液；继续加入1重量份的脱灰鱼鳞，继续100℃后保温2h，获得带有固体残渣的胶原蛋白溶液；离心分离获得固体残渣，向1重量份的固体残渣中加入3重量份的水后，加入固体残渣和水总重量1.5‰的复合蛋白酶，在50℃条件下水解4h，获得鱼鳞角蛋白粗品；鱼鳞角蛋白粗品中加入鱼鳞角蛋白粗品质量1％的活性炭，在60℃吸附40min，进行脱色脱腥处理，然后用离子交换树脂脱盐、除重金属离子后，喷雾干燥获得鱼鳞角蛋白。
鱼鳞角蛋白的纯度为99.2％；其中分子量小于1000Da的鱼鳞角蛋白得率为85.0％。
实施例3
将2重量份的鱼鳞清洗后，加入到9重量份的质量浓度为4％的盐酸溶液中，室温条件下250r/min搅拌2h，去离子水冲洗至中性，获得脱灰鱼鳞；将1重量份的脱灰鱼鳞加入到8重量份的去离子水中，加热到100℃后保温2h后；继续加入1重量份的脱灰鱼鳞，继续100℃后保温1h，获得带有固体残渣的胶原蛋白溶液；继续加入1重量份的脱灰鱼鳞，继续100℃后保温2h，获得带有固体残渣的胶原蛋白溶液；离心分离获得固体残渣，向1重量份的固体残渣中加入5重量份的水后，加入固体残渣和水总重量2.5‰的复合蛋白酶，在55℃条件下水解3h，获得鱼鳞角蛋白粗品；鱼鳞角蛋白粗品中加入鱼鳞角蛋白粗品质量0.8％的活性炭，在60℃吸附40min，进行脱色脱腥处理，然后用离子交换树脂脱盐、除重金属离子后，喷雾干燥获得鱼鳞角蛋白。
鱼鳞角蛋白的纯度为99.4％；其中分子量小于1000Da的鱼鳞角蛋白得率为85.8％。
实施例4
将2重量份的鱼鳞清洗后，加入到9重量份的质量浓度为3％的盐酸溶液中，室温条件下250r/min搅拌2h，去离子水冲洗至中性，获得脱灰鱼鳞；将1.5重量份的脱灰鱼鳞加入到7重量份的去离子水中，加热到100℃后保温2h后；继续加入1.5重量份的脱灰鱼鳞，继续100℃后保温2h，继续加入0.5重量份的脱灰鱼鳞，继续100℃后保温2h；获得带有固体残渣的胶原蛋白溶液；离心分离获得固体残渣，向1重量份的固体残渣中加入4重量份的水后，加入固体残渣和水总重量1.5‰的复合蛋白酶，，在55℃条件下水解3h，获得鱼鳞角蛋白粗品；鱼鳞角蛋白粗品中加入鱼鳞角蛋白粗品质量0.5％的活性炭，在60℃吸附40min，进行脱色脱腥处理，然后用离子交换树脂脱盐、除重金属离子后，喷雾干燥获得鱼鳞角蛋白。
鱼鳞角蛋白的纯度为99.8％；其中分子量小于1000Da的鱼鳞角蛋白得率为85.9％。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。