一种利用芽孢杆菌生产抗氧化肽的发酵方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种利用芽抱杆菌生产抗氧化肤的发酵方法 及应用。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上农业废弃物产出量最大的国家，随着养殖业的发展，其产生的污染 问题也越来越多的引起了人们的重视，对养殖业产生的废弃物加 W回收利用，可W实现清 洁生产。水产品加工后的下脚料具有很高的蛋白质含量。不同水产品其加工后的废弃蛋白 的氨基酸组成和序列不同，因此找出能够有效酶解特定水产加工废弃蛋白的酶是至关重要 的。微生物源蛋白酶由于其自身的优势已经成为当下蛋白酶研究的热点。采用微生物发酵 的方法酶解水产蛋白，生产具有一定抗氧化活性的多肤，可W增加水产品加工的产值，节约 资源，保护环境。而且微生物发酵法将产酶和发酵合二为一，可W大规模处理原料，是一种 很有前景的利用水产加工废弃物的方式。但是目前没有专口从水产品中筛选并利用水产加 工废弃物接种芽抱杆菌发酵生产抗氧化肤的具体方法
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种芽抱杆菌抗氧化肤的生产方法及应用，解决了现有技术 中存在的缺少专口水解水产品的菌株的问题。
[0004] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案：
[0005] -种利用芽抱杆菌生产抗氧化肤的发酵方法:包括如下步骤：
[0006] 步骤1、制备发酵多肤液，具体为：
[0007] 原料烘干;打碎;脱脂处理;脱脂后的处理:使用0.22皿规格的滤膜将原料过滤除 去脂肪后，在70°C下将原料烘24h备用；力化H为6.8、0.05mol/L的憐酸缓冲液灭菌;接种，种 子液培养基：牛肉膏0.3%，蛋白腺1%，氯化钢0.5%，pH7.0;接种量2% ;发酵;90°C，1 Omin 灭酶；SOOOr/min 离屯、，20min;
[000引步骤2、对步骤1中发酵多肤液进行纯化，具体为：
[0009] 400化/min，20min发酵液依次经过离屯、，S层滤纸过滤，0.22皿滤膜过滤澄清后， 取适量发酵液进行超滤转数为20化pm，依次使用截留分子质量为化d和3kd的膜包进行超 滤；当过滤至发酵液体积剩下原体积的1/5时，补加蒸馈水至原体积;此时收集滤过液并分 别取滤过液和截留液适量进行多肤含量的测定，测定方法采用双缩脈法;重复补水几次并 分别测定滤过液和截留液中的多肤含量，直到截留液W及滤过液中多肤含量相对恒定，即 可认为小分子肤已经被滤过，而大分子肤被截流。
[0010] 进一步的，所述步骤一中，原料选取飯鱼加工边角料，鱼肉，70°C烘24h。
[0011] 进一步的，所述步骤一中，脱脂处理先用乙醇体积mL:原料质量g=l:4、再用异丙 醇体积ni:原料质量g = 1:2脱脂。
[0012] 进一步的，所述步骤一中，采用憐酸缓冲液灭菌的条件为溫度120°C、时间30min。
[0013] 进一步的，所述步骤一中，发酵条件为:4号菌最优发酵条件为:菌龄为26h，培养液 初始抑为6.8，溫度为30°C、料液比2.90%，发酵时间4她;其中料液比、溫度、初始抑值对抗 氧化活性的影响最为显著;得到的总抗氧化能力为570.1 lU
[0014] 上述方法在制备抗氧化肤方面的应用。
[0015] 本发明的有益效果是：
[0016] 本发明所使用的发酵方法能够对水产品进行有效的发酵，且，本方法能大幅提高 水产品发酵制备抗氧化肤的效果。
【附图说明】
[0017]图1分子量大于5000组分对DPPH自由基清除率曲线；
[001引图2分子量3000-5000组分对DPPH自由基清除率曲线；
[0019] 图3分子量小于3000组分对DPPH自由基清除率曲线；
[0020] 图4分子量大于5000组分对邻苯=酪自氧化抑制率；
[0021 ] 图5分子量3000-5000组分对邻苯=酪自氧化抑制率；
[0022] 图6分子量小于3000组分对邻苯=酪自氧化抑制率。
[0023] 从图1-图3可W看出，S种组分的DPPH自由基清除率都与样品蛋白质浓度成正比， 其中，分子量小于3000的组分IC50最低，说明相同浓度下该组分的DPPH自由基清除效果好 于其他组分。
[0024] 从图4-图6可W看出，样品浓度与清除率具有一元线性回归关系，R2达到0.97W 上，拟合程度很高。分子量<3000组分的IC50值最小，为0.41 Img/ml。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0026] 实施例1芽抱杆菌抗氧化肤的分离提纯过程
[0027] 步骤1、制备发酵多肤液，具体为：
[00%]原料烘干(飯鱼加工边角料，鱼肉，70°C烘2地)^打碎^脱脂处理(先用乙醇体积 原料质量g= 1:4、再用异丙醇体积111^原料质量g = 1:2脱脂)脱脂后的处理:使用0.22皿 规格的滤膜将原料过滤除去脂肪后，在70°C下将原料烘24h备用。^加憐酸缓冲液(pH为 6.8、0.05mo 1/L)灭菌(溫度120°C、时间30min)^接种(种子液培养基:牛肉膏0.3%，蛋白腺 1 %，氯化钢0.5%，pH7.0;接种量2% )^发酵(4号菌最优发酵条件为:菌龄为26h，培养液初 始抑为6.8，溫度为30°C、料液比2.90%，发酵时间48h。其中料液比、溫度、初始pH值对抗氧 化活性的影响最为显著。得到的总抗氧化能力为570.1 IU。）^灭酶（90°C，IOmin)^离屯、 (SOOOr/min)，20min。
[0029] 步骤2、对步骤I中发酵多肤液进行纯化，具体为：
[0030] 发酵液依次经过离屯、（400化/min，20min)，S层滤纸过滤，0.2化m滤膜过滤澄清 后，取适量发酵液进行超滤(转数为2(K)rpm)，依次使用截留分子质量为化d和3kd的膜包进 行超滤。当过滤至发酵液体积剩下原体积的1/5时，补加蒸馈水至原体积。此时收集滤过液 并分别取滤过液和截留液适量进行多肤含量的测定，测定方法采用双缩脈法。重复补水几 次并分别测定滤过液和截留液中的多肤含量，直到截留液W及滤过液中多肤含量相对恒 定，即可认为小分子肤已经被滤过，而大分子肤被截流。
[0031 ] HY-4发酵液超滤次数与各组分肤含量的关系
[0032]
[C
[C
[C
[0036] 根据结果，HY-4发酵液超滤时，过化d膜包均需补水3次，过3kd膜包时均需补水2 次，即认为超滤完成，小分子被滤过，大分子被截留。
[0037] 实施例2纯化处理后各组分的抗氧化活性
[003引 一、DPPH清除率的测定
[0039] HY-4发酵液相对分子质量巧000组分的DPPH清除率
[0040]
[0041 ] HY-4发酵液相对分子质量3000-5000组分的DPPH清除率
[00421
[0(
[0<
[0<
[0046] IC50 的计算：
[0047] 分子量巧000组分：1.4312mg/ml
[004引 分子量3000-5000组分:0.4592mg/ml
[0049]分子量 <3000组分:0.2022mg/ml
[(K)加]由W上可W看出3号样品的DPPH清除率最强，其IC50为0.2022mg/ml。
[0051 ]二、邻苯=酪自氧化抑制率
[0化2] 分子量巧000组分邻苯=酪自氧化抑制率
[0化3]
[C
[C
[C
[C
[0化引 IC50的计算
[0059]分子量巧 OOO 组分：2.724mg/ml
[0060] 分子量3000-5000组分:0.777mg/ml
[0061] 分子量 <3000组分:0.41 Img/ml
[0062] 本实验中，直线的R2均在0.97W上，说明样品对邻苯S酪的自氧化抑制率与样品 浓度成严格的线性关系，尽管抑制率均未达到50% W上，但是，所得IC50可W由方程计算得 出。本结果可W看出，3号样品的抑制率明显高于1号和2号
[0063] 其中，图1分子量大于5000组分对DPPH自由基清除率曲线；
[0064] 图2分子量3000-5000组分对DPPH自由基清除率曲线；
[0065] 图3分子量小于3000组分对DPPH自由基清除率曲线；
[0066] 图4分子量大于5000组分对邻苯=酪自氧化抑制率；
[0067] 图5分子量3000-5000组分对邻苯=酪自氧化抑制率；
[006引图6分子量小于3000组分对邻苯=酪自氧化抑制率。
[0069] 从图1-图3可W看出，S种组分的DPPH自由基清除率都与样品蛋白质浓度成正比， 其中，分子量小于3000的组分IC50最低，说明相同浓度下该组分的DPPH自由基清除效果好 于其他组分。
[0070] 从图4-图6可W看出，样品浓度与清除率具有一元线性回归关系，R2达到0.97W 上，拟合程度很高。分子量<3000组分的IC50值最小，为0.41 Img/ml。
[0071] 综上所述，本此实验可W说明，分子量小于3000的样品其抗氧化能力高于分子量 大于它的两个组分。
【主权项】
1. 一种利用芽孢杆菌生产抗氧化肽的发酵方法:其特征在于，包括如下步骤： 步骤1、制备发酵多肽液，具体为： 原料烘干;打碎;脱脂处理;脱脂后的处理:使用〇.22μπι规格的滤膜将原料过滤除去脂 肪后，在70 °C下将原料烘24h备用；加 pH为6.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液灭菌;接种，种子液 培养基:牛肉膏〇. 3 %，蛋白胨1 %，氯化钠0.5 %，pH7.0;接种量2 % ;发酵;90 °C，lOmin灭酶； 5000r/min 离心，20min; 步骤2、对步骤1中发酵多肽液进行纯化，具体为： 4000r/min，20min发酵液依次经过离心，三层滤纸过滤，0.22μηι滤膜过滤澄清后，取适 量发酵液进行超滤转数为200rpm，依次使用截留分子质量为5kd和3kd的膜包进行超滤；当 过滤至发酵液体积剩下原体积的1/5时，补加蒸馏水至原体积;此时收集滤过液并分别取滤 过液和截留液适量进行多肽含量的测定，测定方法采用双缩脲法;重复补水几次并分别测 定滤过液和截留液中的多肽含量，直到截留液以及滤过液中多肽含量相对恒定，则小分子 肽已经被滤过，而大分子肽被截流。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，原料选取鲅鱼加工边角料， 鱼肉，70°C烘24h。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，脱脂处理先用乙醇体积mL: 原料质量g = l :4、再用异丙醇体积mL:原料质量g = l :2脱脂。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，采用磷酸缓冲液灭菌的条 件为温度120°C、时间30 min。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，发酵条件为:4号菌最优发 酵条件为:菌龄为26h，培养液初始pH为6.8，温度为30°C、料液比2.90%，发酵时间48h;其中 料液比、温度、初始pH值对抗氧化活性的影响最为显著;得到的总抗氧化能力为570.11U。6. 权利要求1-5任一方法在制备抗氧化肽方面的应用。
【专利摘要】一种利用芽孢杆菌生产抗氧化肽的发酵方法及其应用：包括：步骤1、制备发酵多肽液，原料烘干；打碎；脱脂处理；脱脂后的处理：使用0.22μm规格的滤膜将原料过滤除去脂肪后，在70℃下将原料烘24h备用；加pH为6.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液灭菌；接种，种子液培养基；步骤2、对步骤1中发酵多肽液进行纯化；当过滤至发酵液体积剩下原体积的1/5时，补加蒸馏水至原体积；此时收集滤过液并分别取滤过液和截留液适量进行多肽含量的测定，测定方法采用双缩脲法；重复补水几次并分别测定滤过液和截留液中的多肽含量，直到截留液以及滤过液中多肽含量相对恒定，即可认为小分子肽已经被滤过，而大分子肽被截流。
【IPC分类】C12P21/00, C12R1/07, C07K1/34
【公开号】CN105713941
【申请号】CN201510923532
【发明人】李秉钧, 王轰, 冯俊荣, 牟伟丽, 艾冰花
【申请人】烟台大学