一种玉米开花和籽粒发育相关蛋白、编码基因及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，更具体的说，涉及一种玉米开花和籽粒发育相关蛋白ZmNF-YA13、编码基因及应用。

背景技术：

籽粒大小高产历来是玉米育种的主要目标。籽粒产量是最重要、最复杂的性状之一,是由相互关联的多基因控制的一系列生理生化过程的最终体现。玉米籽粒产量由单位面积株数、单株粒数和百粒重决定。在种植密度一定的条件下,单株粒数和粒重直接决定籽粒产量。因此,从分子水平了解单株产量与产量构成因子(单株粒数和百粒重)的关系,对玉米产量的遗传改良具有重要的意义。几十年来,单株产量与单株粒数、百粒重的关系一直是玉米遗传研究的重点,改良产量构成因素性状可有效提高产量。国内外学者在表型水平上对这3个性状的关系进行了研究,表明单株产量与产量构成因子(粒数和粒重)显著相关。

NF-Y是一种真核生物中广泛存在的转录因子，能够特异性的结合CCAAT-box，而CCAAT-box作为一种顺式元件存在于大约1/4的真核生物基因启动子中。NF-Y是一个三聚体，它包括NF-YA(CBF-B或HAP2)，NF-YB(CBF-A或HAP3)，NF-YC(CBF-C或HAP5)。NF-Y作为保守的转录因子在植物的生长发育和对逆境胁迫响应中扮演着重要的角色。有研究已经发现拟南芥中的NF-YA参与逆境下开花的诱导(Xu et al.,2013)。NF-YA作为三聚体最为重要的组成因子，在结构上它有富含谷氨酰胺和色氨酸或苏氨酸的氮末端，有一个NF-YB/NF-YC结合域，还有一个DNA结合域，而这两个结合域是NF-YA的保守域。研究表明NFYA可以响应各种非生物胁迫而上调表达，NFYA过表达株系会变得矮小，但这种植株对ABA逆境胁迫信号变得极为敏 感，从而使耐受非生物胁迫的能力提高(Li et al.,2008)。

技术实现要素：

本发明从玉米中分离了一个NF-YA类转录因子ZmNF-YA13，并对其功能进行了研究，表明该基因参与了玉米籽粒大小的发育调控，该基因过表达能够明显增大籽粒和提高千粒重；同时该基因能够促进玉米开花，因此其在提高玉米产量、早熟育种中具有重要应用价值。

本发明所提供的蛋白，名称为ZmNF-YA13，来源于玉米B73，属NF-YA类转录因子。

本发明采用cDNA文库PCR扩增的方法，获得了ZmNF-YA13基因的编码(coding sequence，CDS)序列。ZmNF-YA13基因的全长cDNA序列包含1273bp，CDS序列828bp(序列1)，编码275个氨基酸(序列2)。

本发明所克隆的ZmNF-YA13基因产物在细胞核中表达(图1)。

本发明所克隆的ZmNF-YA13基因在逆境条件下的表达(图2)。

本发明把ZmNF-YA13基因构建到植物表达载体上，启动子为Ubiqutin，得到过表达质粒pUBI:NF-YA13(图3)，将其转化到农杆菌EHA105中，用农杆菌转化玉米并获得了转基因植株。把转基因纯系植株与未转基因的野生型植株在正常生长条件下进行比较，结果表明，ZmNF-YA13的过表达导致玉米开花时间提前，籽粒增大(图4)，说明ZmNF-YA13参与了玉米开花时间和籽粒发育的调控。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。附图中：

图1为ZmNF-YA13蛋白的亚细胞定位图；图1(A)为细胞核染料染色与绿色荧光蛋白的对比结果，图1(B)为空白对照组与混合显示的对比结果；

图2为ZmNF-YA13蛋白在逆境条件下的表达结果图；图2(A)、2(B)、2(C)分别为高盐、干旱、ABA处理条件的表达结果图；

图3为pUBI:NF-YA13表达载体图谱；

图4为转基因玉米的表型结果图；图4(A)为转基因玉米籽粒表型、4(B)为开花时间统计。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1 玉米ZmNF-YA13基因cDNA的克隆

以玉米B73的cDNA文库为模板进行RT-PCR扩增，PCR引物如下：

ZmNF-YA13F：5'-ATGCTTCTTCCCTCTTCGTC-3'；

ZmNF-YA13R：5'-TCATCTCATAACTGGAACCC-3'。

扩增条件如下：

扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收，克隆至pEASY-T1载体。酶切并测序鉴定，命名为pTNFYA13。测序结果表明：得到CDS为序列1所示的基因，将该基因命名为ZmNF-YA13，全长828bp，具体序列如下：ATGCTTCTTCCCTCTTCGTCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCAAAGGTAACTCCTTTGGGAAAACCGTTAACGATCATCTGAGGTCAACTTTGAGTTTTGATAACAAGCAACCTCCATTTGCAAGTCAAAACTTTGACTACGGTCAAACAATAGCTTGCATTTCATACCCGTACAATCGTTCTAGATCAGGAGATGTTTGGGCAGCCTATGAGTCACGCACCAGCACTGCCACTGTGTTCCGTTCCCAAATTGCTGGTGGGGGTTCATCCACAAGAATTCCCTTGCCTTTGGAATTAGCAGAGAATGAACCCATATATGTTAATCCCAAACAATAT CACGGGATACTTCGCAGAAGACAGTTACGTGCCAAGTTAGAGGCTCAGAACAAGCTAGTCAGAGCCCGAAAGCCTTACCTTCATGAGTCTAGGCATCTTCATGCAATGAAGAGGGCACGAGGTTCCGGTGGACGATTCCTCAACACTAAGCAGCTCCAGCAGTCTCACACTGCCCTCACCAGGTCCAACACCACAAGTGGCACAAGCTCCTCAGGCTCAACTCATCTGCGGCTTGGTGGTGGCGCAGCCGCAGCTGGAGATCGATCTGTGCTGGCACCCAAAACAATGGCCTCACAAGACAGTAGCAAGAAGGCTGTTTCTTCAGCTCTCGCCTTCACTGTGACTCCAATGCTGCGCAGAGATGACGGCTTCTTGCAGCACCCAAGCCATCTTTTCAGTTTTTCTGGTCATTTTGGGCAGGCAAGCGCGCAAGCTGGCGTCCATAATGGAAGTCAGCATAGGGTTCCAGTTATGAGATGA

其编码的蛋白的氨基酸序列如序列2所示，编码275个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中***号未计入)，其编码的蛋白的氨基酸序列如下：

实施例2 玉米ZmNF-YA13亚细胞定位分析

转录因子的特征之一是定位于细胞核中，并在细胞核中执行其转录调控功能。为此，利用原生质体转化的方法在玉米原生质体中对玉米ZmNF-YA13 蛋白的亚细胞定位进行了研究。

2.1载体构建：

利用引物：

pRTL2-NFYA13-F:

5'-CTCGAGGGATCCCCATGCTTCTTCCCTCTTCGTC-3'；

pAS2-NFYA13-R:

5'-TGCAGGTCGACGGATCCCCTCATCTCATAACTGGAACCC-3'；

扩增ZmNF-YA13编码区片段，通过GBclonart无缝克隆技术将带有同源臂的ZmNF-YA13重组到pRTL2载体，与GFP形成融合蛋白，由35S启动子驱动表达。

2.2玉米叶片原生质体的制备：

待玉米长到3片叶子时，选出完整无伤害的第二片叶子，剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5mm宽的叶条。将切好的叶条放入预先配置好的酶解液(1.5％Cellulase R10,0.4％macerozyme R10,0.4M mannitol,20mM KCl,20mM MES,pH 5.7,10mM CaCl₂,and 0.1％BSA)中(每5-10ml酶解液大约需10-20片叶子)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液，50转/分钟，震荡条件下酶解5～7h。

2.3原生质体的转化：

1)100g离心10分钟使原生质体沉淀在管底，然后用适量MMG溶液(0.4M mannitol,15mM MgCl₂,and 4mM MES,pH 5.7)重悬原生质体，使之最终浓度在2X10⁵个/ml。

2)每100μl原生质体加入10μl DNA(10微克约5-10kb的质粒DNA)至2ml离心管中，轻柔混合。

3)加入等体积110μl PEG溶液(40％PEG[v/v],0.2M mannitol,and 0.1M CaCl₂)，轻柔拍打离心管完全混合。诱导转化混合物10分钟。

4)100g离心2分钟去上清后，用1ml WI溶液(0.5M mannitol,20mM KCl4mMMES,pH5.7)轻柔重悬原生质体。

5)室温下(20-25℃)诱导原生质体14小时以上。在诱导12小时的时候 取一部分原生质体用5mg/ml核染料Hoechst33342(CalBiochem)染色0.5～2h。以上所有操作在室温下进行。

2.4 GFP表达情况观察：

在激光共聚焦显微镜下观察GFP表达，结果表明，ZmNF-YA13定位于细胞核中，表明该基因为转录调控因子。图1示出了ZmNF-YA13蛋白的亚细胞定位情况；图1(A)为细胞核染料染色与绿色荧光蛋白的对比结果，图1(B)为空白对照组与混合显示的对比结果，如图1(A)所示，ZmNF-YA13-GFP(绿色荧光蛋白，上部)的显示位置与细胞核染料Hochest的染色结果(蓝色，下部)重叠，相互印证。

实施例3 ZmNF-YA13在非生物逆境条件下的表达分析

3.1玉米材料的处理

取玉米种子，经10％H₂O₂表面消毒，无菌水清洗3遍之后，吸胀6h，然后置于两层滤纸上，28℃黑暗中萌发两天之后，将出芽一致的小苗种植于花盆蛭石中，白天28℃，夜间24℃，14h/10h光周期培养至出两片完整叶子，再转移置1/2Hoagland培养液中，一天后转移至全营养Hoagland继续培养，待长出三叶一芯，进行不同条件的处理。

1)PEG模拟旱处理：将玉米苗置于含16％PEG的培养液中，白天28℃，夜间24℃，14h/10h光周期培养，分别在0h,4h,12h,24h，48h,和15天时，取根，用液氮速冻，-80℃保存备用。

2)ABA处理：将玉米苗置于50uM的ABA溶液中，与上面相同条件培养，分别在0h，4h，12h，24h，48h和15天时，取根，用液氮速冻，-80℃保存备用。

3)盐处理：分别将玉米苗置于125mM的NaCl溶液中，与上面相同条件培养，分别在0h，4h，12h，24h，48h和15天时，取根，用液氮速冻，-80℃保存备用。

4)对照的处理：直接取未经任何处理的苗-80℃冻存，作为对照。

3.2RNA的提取及DNA的去除：

1)取约200mg处理的玉米材料，液氮研磨，用Trizol试剂(Invitrogen)提取RNA。

2)将RNA溶于85μl水中，加入10X buffer 10μl和5μlRQ1RNA Free DNase(1U/μl)，37℃，15min，以去除DNA的污染。

3)加入100μl的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，70％的乙醇洗一次，溶于50μl的水中。

4)定量RNA的浓度为1μg/μl。

3.3RT-qPCR：

按照Promega公司的GoScript^TMReverse Transcription System(Promega A5000)，进行RT-qPCR，反应程序如下：

1)依次加入以下试剂进行反应：

2)上述反应完成后，在反应体系中继续加入以下试剂：

3)再继续加入M-MLV 1μl(200u/μL)；42℃，50min；70℃，15min灭活，备用。

将cDNA稀释3倍作为荧光定量PCR的模板。玉米Tubulin5基因(GRMZM2G099167_T01)作为内参。引物设计如下：

ZmTub5FW：

5'-CTCACGCATCGACCACAAG-3'；

ZmTub5RV：

5'-CTTCCATACCCTCACCGACA-3'。

荧光定量用promega公司的qPCR Master Mix在ABI 7500上采用两步法进行。

1)qPCR反应体系：

2)PCR条件：

采用2^-ΔΔCt法计算不同处理条件下ZmNF-YA13的表达量。图2示出了ZmNF-YA7蛋白在逆境条件下的表达结果；图2(A)、2(B)、2(C)分别为高盐、干旱、ABA处理条件的表达结果图，结果表明ZmNF-YA13基因受高盐诱导在短期内下调表达，长期则上调表达(图2A)；受干旱诱导，处理植株根中ZmNF-YA13基因表达在短期内下调，48h快速升高，长期则又下调表达(图2B)；受ABA诱导，到48h根中表达上升到最高，之后降至初始水平(图2C)

实施例4 pUBI:NF-YA13表达载体的构建

1)设计扩增ZmNF-YA13CDS全长的引物，在引物两端各添加20nt载体同源序列，引物序列如下：

ZmNF-YA13F：

5'-GCGTGGATCCGAGCTCACATGCTTCTTCCCTCTTCGTC-3'；

ZmNF-YA13R：

5'-GTCACCTGTAATTCACACTCATCTCATAACTGGAACCC-3'。

以pTNFYA13质粒为模板，进行PCR扩增；

2)扩增产物进行回收，对回收后的产物和改造过的pCAMBIA3301m进行重组反应，所用试剂为GBclonart Seamless Cloning Kit，

反应体系如下：

3)酶切鉴定阳性克隆，阳性克隆即为pUBI:NF-YA13载体。图3示出了pUBI:NF-YA13表达载体图谱，将阳性克隆进行测序验证，获得阳性质粒如图3所示，用于后续实验。

实施例5 pUBI:NF-YA13转基因玉米的获得

5.1农杆菌转化及玉米转化：

将实施例4中获得的植物表达载体pUBI:NF-YA13转化到农杆菌EHA105中。玉米转化方法参照Frame et al.,进行。

5.2转基因玉米PCR检测：

正向引物：ZmNF-YA13FW:5’-CAAGACAGTAGCAAGAAGGCTG-3’

反向引物：NOS 70:5’-CCGGCAACAGGATTCAATCTTA-3’

反应体系()：

转基因植株DNA 1μl(20ng～50ng)；

反应条件：

72℃延伸5min,筛选出PCR阳性植株。

5.3转基因玉米Basta叶面喷洒检测及纯系的获得：

待PCR阳性植株长至5-6片叶时，用1000倍稀释的Basta喷施，每周一次，连续喷施3周后观察植株存活情况，存活的阳性苗连续自交筛选两代，获得T2代纯系，种植观察表型。

实施例6 pUBI:NF-YA13转基因玉米表型分析

将转空载体对照及过表达NF-YA13基因的转基因玉米各选取三个纯系种植，图4示出了转基因玉米的表型及籽粒和开花时间统计结果；图4(A)为转基因玉米籽粒表型、图4(B)为开花时间统计。发现转基因玉米与对照相比过表达ZmNF-YA13的植株开花时间提前，籽粒较对照显著增大，表明过表达ZmNF-YA13参与玉米开花时间和籽粒发育调控。

显然，上面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。